云南中緬邊境登革1型病毒全基因組序列特征研究

胡挺松，張海林，劉永華，徐松淼，李華昌，鄧 波，尹小雄，黃 瑛，張富強(qiáng)，范泉水

?

云南中緬邊境登革1型病毒全基因組序列特征研究

胡挺松1，張海林1，劉永華2，徐松淼1，李華昌3，鄧 波1，尹小雄2，黃 瑛4，張富強(qiáng)1，范泉水1

目的 闡明云南省中緬邊境地區(qū)2013-2015年14株登革1型病毒(DENV-1)全基因組序列特征。方法 采用C6/36 細(xì)胞培養(yǎng)法分離病毒，用RT-PCR法擴(kuò)增新分離DENV-1的全基因組序列，采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果 從登革熱患者血清中分離到14株DENV-1，其中瑞麗市9株，臨滄市3株，昆明市2株。經(jīng)RT-PCR和序列測定，獲得這14株DENV-1的全基因組序列(10 735nt)，其開放讀碼框(95-10 271)編碼 3 392個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化和同源性分析表明，13株為基因I型(G-I)，其中瑞麗和臨滄本地病例7株，緬甸輸入性病例6株；1株為G-III(昆明的印度輸入性病例)。云南13株G-I可分為2個進(jìn)化群，但均與緬甸、泰國等東南亞流行株具有較近的親緣關(guān)系。云南13株G-I的E基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.02%-100%和98.78%-100%，它們與6株東南亞G-I參考株的核苷酸和氨基酸同源性分別為96.53%-99.53%和97.33%-100%，與DENV-1原型株US_Hawaii核苷酸和氨基酸同源性分別為93.76%-94.45%和95.86%-96.91%。所有云南株和東南亞參考株與US_Hawaii株在結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸位點(diǎn)分別存在44和150個位點(diǎn)差異。結(jié)論 云南中緬邊境地區(qū)2013-2015年流行的DENV-1均為G-I，并具有基因多樣性特點(diǎn)但均為來自緬甸的多個傳播來源。

登革1型病毒；全基因組；系統(tǒng)進(jìn)化分析；同源性分析；氨基酸位點(diǎn)分析

登革熱(dengue fever, DF)是由登革病毒(dengue virus, DENV)引起經(jīng)伊蚊傳播的一種急性傳染病，DENV分為1、2、3和4血清型(serotype)。DENV為有包膜的單股、正鏈RNA 病毒，基因組全長約10～11kb，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、PrM/M 和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5)。近10多年來，全球DF流行顯著增強(qiáng)，地理范圍不斷擴(kuò)大，疾病負(fù)擔(dān)逐漸加重，成為重要的公共衛(wèi)生問題[1-3]。本病在東南亞地區(qū)流行較為嚴(yán)重，近幾年我國廣東、福建、廣西等東南沿海地區(qū)常有流行[4-6]。云南省位于中國西南邊境地區(qū)，與越南、老撾和緬甸接壤并設(shè)有較多的邊境口岸和通道，境內(nèi)外人員和物資交流頻繁，DF可通過輸入性病例或帶病毒的媒介伊蚊將病毒傳播到云南省。近10多年來，云南省每年均有來自境外的DF輸入性病例[7-8]。2013-2015年云南省西南邊境地區(qū)發(fā)生本地DF流行，其中中緬邊境地區(qū)的德宏州瑞麗市和臨滄市發(fā)生了由登革1型病毒(DENV-1)引起的本地DF暴發(fā)疫情[9-11]。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，DENV基因多樣性在不斷增加，導(dǎo)致產(chǎn)生大量不同毒力的病毒株，這意味著人類將受到更多類型的致病性DENV的攻擊。因此，對各地不同時期DENV流行株的全基因組序列測定和分析，不僅可掌握DENV遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，并可對自然界中DENV的基因變異起到監(jiān)測作用。此前，我們曾對DENV-1引起的疫情進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和病毒部分基因序列測定及血清型鑒定[9-11]，但缺乏對病原體的深入研究。本研究從云南DF患者中分離到14株DENV-1，并對它們進(jìn)行全基因組序列測定和分析，以期闡明該地區(qū)DENV-1流行株的遺傳進(jìn)化和流行病學(xué)特點(diǎn)，為本病預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患者標(biāo)本 2013-2015年在云南省德宏州、臨滄市和昆明市采集登革熱患者急性期血清標(biāo)本，并按文獻(xiàn)方法[2]進(jìn)行DENV核酸檢測和血清型鑒定，獲得的DENV-1感染的患者血清標(biāo)本。

1.2 病毒分離 用C6/36 細(xì)胞(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所提供)培養(yǎng)法分離病毒。取DENV-1陽性患者血清100 μL，用細(xì)胞培養(yǎng)液1∶10稀釋，接種于已長成單層的C6/36細(xì)胞，置4% CO2恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)。每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，待75% 以上細(xì)胞出現(xiàn)病變，收取細(xì)胞上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR和序列測定 用Axygen 公司的AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 提取病毒分離物中的病毒RNA，用美國Invitrogen公司的SuperScript○RIII One-Step RT-PCR System with Platinum○RTaq Kit 試劑盒一步法RT-PCR擴(kuò)增DENV全基因序列，將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收，直接測序。引物自行設(shè)計(jì)，根據(jù)GenBank中的DENV-1基因序列，利用MEGA6軟件進(jìn)行比對，找出相對保守區(qū)域，利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)DENV-1全基因序列的引物：DEV1-1F: 5′ AGT TGT TAG TCT ACG TGG ACCG 3′, DEV1-2136R: 5′ ATT TTC CCT ATG CTG CTT CC 3′; DEV1-1883F: 5′ CAT GGA ACC GTT CTA GTG CAG 3′, DEV1-4234R: 5′ TCC AGC TAT TAG TGG CCC AG 3′; DEV1-3818F: 5′ GAG TTA CCA AAT TCC TTG GAG G 3′，DEV1-6218R: 5′ CGT CAA AGC ACC ATC TTC TG 3′; DEV1-5907F: 5′ GAA GGA ACC ACA ATA AGG AAGG 3′, DEV1-8144R: 5′ CCA CCA CAC TTG GCA TGT AG 3′; DEV1-7725F: 5′ CCA AAC ATG CAG TGT CGA GAG 3′, DEV1-9397R:5′ TAA GCC ATA GGT TCCA ACC TG 3′; DEV1-9071F: 5′ GAG AAT TCA CTC AGC GGA GTG 3′，DEV1-10735R: 5′ AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGCA 3′。引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物測序均由昆明碩摯生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析 采用ClastalX1.83進(jìn)行核苷酸序列比對，采用MEGA6軟件鄰接法(neighbor-joining)進(jìn)行DENV基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹分析[13]。同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析均引用GenBank中16株DENV-1，其中7株為基因I型(G-I)：包括DENV-1原型株即國際參考株US_Hawaii(KM204119，美國夏威夷，1944)以及Myanmar.37726 (AY726549，緬甸)、Myanmar.44168 (AY 726551，緬甸)、TH/BID-V2270/2001 (FJ687427，泰國)、SL_2009c (HQ891315斯里蘭卡)、GZ_OY(FJ176779，廣東，2006)和VN_BID-V2836/2004(FJ882569，越南)；2株G-II：hu/Seychelles/NIID41 (AB195673，塞舌爾輸入到日本)和Reunion 185(DQ285558，留尼旺島，2004)；3株G-III：NI/BID-V1223/2007(FJ898433，尼加拉瓜)、NI BID/V621/2005(FJ410290，尼加拉瓜)和RR107(KF289072，印度)；2株G-IV：PF08/070308-138(JQ915073，法屬波利尼西亞)和PF07/230407-201(JQ915071，法屬波利尼西亞)；2株G-V：HawO3663(DQ672564，美國)和DS212-110306(EU179861，文萊)。其中的US_Hawaii株，除與其它參考株一并用于核苷酸和氨基酸同源性及進(jìn)化分析外，作為氨基酸位點(diǎn)差異比對分析所參照的標(biāo)準(zhǔn)株[12]。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離 從DF患者急性期血清中共分離到14株DENV-1，其中7株分離自本地感染病例，另外7株分離自境外輸入性病例(表1)。年度分布為2013年2株、2014年6株、2015年6株。地區(qū)分布為德宏州瑞麗市9株、臨滄市3株、昆明市2株。

表1 云南省14株登革1型病毒的背景信息
Tab.1 Background information of 14 strains of DENV-1 isolated from Yunnan Province, China

毒株名稱Virusstrain基因庫號GenBankno.基因型Genotype年份Year城市City病例性質(zhì)TypeofcaseYNH12KY672943G-I2013昆明市Kunming緬甸輸入病例ImportedcasefromMyanmarYNH22KY672944G-III2013昆明市Kunming印度輸入病例ImportedcasefromIndiaDGRL-6KY672937G-I2014瑞麗市Ruili本地感染病例IndigenouscaseDGRL-32KY672938G-I2014瑞麗市Ruili本地感染病例IndigenouscaseDGRL-49KY672939G-I2014瑞麗市Ruili本地感染病例IndigenouscaseDGRL-157KY672940G-I2014瑞麗市Ruili緬甸輸入病例ImportedcasefromMyanmarDGRL-161KY672941G-I2014瑞麗市Ruili緬甸輸入病例ImportedcasefromMyanmarDGRL-177KY672942G-I2014瑞麗市Ruili本地感染病例Indigenouscase15DGR7KY672932G-I2015瑞麗市Ruili本地感染病例Indigenouscase15DGR4KY672931G-I2015瑞麗市Ruili緬甸輸入病例ImportedcasefromMyanmar15DGR55KY672933G-I2015瑞麗市Ruili緬甸輸入病例ImportedcasefromMyanmarLC1502KY672936G-I2015臨滄市Lincang本地感染病例IndigenouscaseGM1503KY672935G-I2015臨滄市Lincang本地感染病例IndigenouscaseGM1502KY672934G-I2015臨滄市Lincang緬甸輸入病例ImportedcasefromMyanmar

2.2 序列測定 經(jīng)全基因組序列測定，獲得上述14株云南DENV-1的全基因核苷酸序列，全長約為10 735nt，其開放讀碼框(95-10 271)編碼 3 392 個氨基酸前體蛋白，依次包含3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。所有這14株DENV-1的全基因核苷酸序列均已提交到GenBank。

2.2 進(jìn)化分析 云南14株DENV-1與來自GenBank中16株不同基因型DENV-1參考株的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，圖1和2顯示，云南新分離株間無論在全基因(Complete genome)還是C/prM/M、E、NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5基因核苷酸序列均存在一定差異，并可分為兩個基因型，其中13株為G-I，1株為G-III。所有瑞麗(2014和2015年)和臨滄(2015年)本地病例和輸入性病例的分離株均為G-I，但它們間仍然存在一定差異。根據(jù)E、NS1和NS5等基因序列進(jìn)化分析，云南G-I流行株至少可分為2個進(jìn)化亞支，其中2014年瑞麗流行株(DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49和DGRL-157)高度聚集為一個亞支并與瑞麗2015年15DGR55株以及緬甸流行株(Myanmar_37726和Myanmar_44168)親緣關(guān)系較近，同為一個進(jìn)化支；瑞麗2015年15DGR7和15DGR4株與2014年DGRL-161和DGRL-177株以及臨滄流行株(LC1502、GM1503和GM1502)雖同在一個亞支，但它們間仍存在著一定差異，但均與泰國TH/BID-V2270株、斯里蘭卡SL_2009c株和廣州株(GZ_OY)具有較近的親緣關(guān)系。圖1和2還顯示，包括云南株及東南亞參考株在內(nèi)的所有G-I株均與原型株US_Hawaii株進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)。另外，2013年昆明市2株DENV-1分別為G-I(YNH12)和G-III(YNH22)，其中YNH12株分離自來自緬甸的輸入病例，與2015年臨滄流行株具有較近的進(jìn)化關(guān)系；YNH22株則分離自來自印度的輸入性病例，與印度2011年流行株(RR107)具有較近的親緣關(guān)系(圖1和2)。此外，本次云南株非編碼區(qū)3′UTR的進(jìn)化分析結(jié)果與編碼區(qū)分析基本相似。

2.3 核苷酸和氨基酸同源性分析 云南14株DENV-1與16株DENV-1參考株的E基因進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析。所有云南株DENV-1間的核苷酸和氨基酸同源性分別為89.85%-100.0%和96.91%-100.0%，其中以G-III(YNH22)與G-I(13株)間核苷酸(89.85%-90.82%)和氨基酸(96.91%-97.54%)同源性差異較大，而13株G-I間的核苷酸(97.02%-100%)和氨基酸(98.78%-100%)同源性僅存在較小差異。云南13株G-I與7株G-I參考株間的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.76%-99.46%和95.86%-100%，其中，與DENV-1原型株US_ Hawaii核苷酸和氨基酸同源性分別為93.76%-94.45%和95.86% -96.91%，差異較大；而與其它6株東南亞流行株核苷酸和氨基酸同源性分別為96.53%-99.53%和97.33% -100%，同源性較高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，瑞麗2014年流行株(DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49、DGRL-157)和2015年15DGR55株(輸入病例)與緬甸流行株(Myanmar_3772和Myanmar_44168)間核苷酸(98.43%-99.18%)和氨基酸(98.78%-99.80%)同源性最高；2015年瑞麗流行株(15DGR4和15DGR7)、臨滄流行株(LC1502、GM1503、GM1502)和昆明YNH12株與廣州GZ_OY株的核苷酸同源性為98.98%-99.53%，氨基酸同源性均為100%；而2014年瑞麗DGRL-161和DGRL-177 株則與泰國TH/BID-V2270株和斯里蘭卡SL_2009c株的核苷酸(98.76%-99.46%)和氨基酸(99.19%-99.80%)同源性最高。

注：黑色圓形代表分離自云南省的DENV-1Black circles represent the strains isolated from Yunnan Province, China.圖1 云南省14株DENV-1 全基因(complete genome)、C/PrM/M和E基因序列進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete genome, C/PrM/M and E genes of 14 DENV-1 strains isolated from Yunnan Province, China

注：黑色圓形代表分離自云南省的DENV-1Black circles represent the strains isolated from Yunnan Province, China圖2 云南省14株DENV-1 NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5 and 3′UTR基因序列進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 and 3′UTR genes of 14 DENV-1 strains isolated from Yunnan Province, China

云南13株G-I與G-II、G-III、G-IV和GV間的核苷酸(氨基酸)同源性分別為89.99%-90.94%(96.49%-97.33%)、89.90%-90.44%(95.87%-96.92%)、89.85%-90.89%(96.28%-99.80%)和89.36%-91.31%(96.07%-97.12%)，它們間存在明顯差異。

云南G-III株(YNH22)與3株G-III參考株間的核苷酸(氨基酸)同源性分別為94.12%-99.59%(98.78%-99.53%)，與G-I、G-II、G-IV和G-V參考株間的核苷酸(氨基酸)同源性分別為90.41%-91.06%(97.33%-97.75%)、89.55%-89.63%(97.33%)、89.47%-89.79%(97.13%-97.54%)、90.80%-91.83%(97.13%)。

2.4 氨基酸位點(diǎn)分析 云南14株DENV-1與上述參考株進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)的差異分析，并以原型株US_Hawaii株作為參照進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)比對。表2顯示，無論結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)或非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)的氨基酸序列均存在差異。云南株C、PrM/M、E蛋白分別有5、12和27個氨基酸位點(diǎn)的改變，如瑞麗2014年的DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49、DGRL-157以及緬甸的Myanmar_37726和Myanmar_44168株在PrM/M-73位點(diǎn)均有改變(T-S)；除上述瑞麗2014年4株和2015年的15DGR55株外，其它G-I云南株均在PrM/M-122位點(diǎn)有改變(K-R)。云南13株G-I和G-I參考株均在E-8(N-S)、E-155(T-S)、E-171(S-T)、E-324(V-I)、E-461(I-V)等位點(diǎn)發(fā)生改變；除上述瑞麗2014年4株和15DGR55株外，其它云南株均存在E-114(I-L)位點(diǎn)改變。部分云南株還檢測到包括E-52(K-N)、E-55(V-I)、E-203(E-G)、E-227(P-S)、 E-234(E-Q)、E-270(I-F) 、E-277(K-T) 、E-278(I-N)、E-337(F-I)、E-369(A-T)、E-380(V-I)、E-382(A-V)位點(diǎn)改變。此外，表2顯示的氨基酸種類均為與原型株US_Hawaii株存在有差異的氨基酸位點(diǎn)，而空白位置則為未發(fā)生改變的氨基酸位點(diǎn)。

表2 DENV-1云南株與US_ Hawaii株E蛋白氨基酸差異位點(diǎn)比較
Tab.2 Different sites of amino acid in E sequences in Yunnan strains and US_ Hawaii strain of DENV-1

位點(diǎn)Site12345678910111213141516171819202122232425262728E-8NSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSE-37DNNNNE-52KNNNNNNNNNSNNNNNNNNNNNNNNNNNE-55VVVVVVVVVVIIE-114ILLLLLLLLLLLLLLLE-155TSSSSSSSSSSSSSSSSSSSE-161ITTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTE-171STTTTTTTTTTTTTTTTTTE-203EGGGGE-227PSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSE-234EQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQE-270IFE-277KTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTE-278INE-290NDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDE-291KQE-324VIIIIIIIIIIIIIIIIIIIE-337FIIE-369ATTTTE-380VIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIE-382AVVVVVVE-402LFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFE-429FLLE-439IVVVVE-461IVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVE-473ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTE-484MLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL

注Note：阿拉伯?dāng)?shù)字表示本研究中的病毒株名稱。Arabic numeral represent the virus strain names in the study: 1：US_ Hawaii；2：SL_ 2009c；3：TH_BID-V2270；4：Myanmar_44168；5：Myanmar_37726；6：GZ_OY；7：VN_BID-V2836；8：Reunion 185；9：RR 107；10：NI_BID-V1223；11：NI_BID-V621；12：hu_Seychelles_NIID41；13：HawO3663；14：DS212-110306；15：YNH22；16：YNH12；17：LC1502；18：GM1503；19：GM1502；20：DGRL-177；21：DGRL-161；22：DGRL-157；23：DGRL-49；24：DGRL-32；25：DGRL-6；26：15 DGR55；27：15 DGR7；28：15 DGR4.

云南株NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5蛋白依次存在24、16、6、34、7、16、47個氨基酸的改變。從NS1看，上述瑞麗2014年4株和15DGR55株在NS1-111(H-Y)位點(diǎn)均有改變；在NS1-131位點(diǎn)，除前述這5株發(fā)生T-A改變外，其它G-I云南分離株均發(fā)生K-S改變；在NS1-144位點(diǎn)，除前述這5株外，其它G-I分離株均發(fā)生P-S改變。此外，2014年瑞麗DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49和DGRL-157株在NS2a-34(T-A)、NS2b-85(K-R)、NS4a-72(F-L)、NS5-59(I-A)、NS5-253(R-K)、NS5-642(V-A)、NS5-785(D-N)、NS5-687(V-I)等位點(diǎn)均存在改變。2015年臨滄分離株(LC1502、GM1503和 GM1502)在NS2a-114(V-M)、NS2a-178(F-L)、NS3-77(I-L)、NS3-258(V-I)和NS5-30(R-K)等位點(diǎn)圴有改變。所有云南13株G-I在NS2b-112(I-L)、NS3-26(L-M)、NS3-44(G-N)、NS3-85(F-L)、NS3-293(A-S)、NS3-350(D-E)、NS3-466(Q-H)、NS4a-39(K-R)、NS5-135(T-I)、NS5-285(N-H)、NS5-325(R-K)、NS5-649(H-Y)等位點(diǎn)均發(fā)生了改變。

3 討 論

四種血清型DENV廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，其中尤以DENV-I流行較為廣泛[13-17]。DENV最早分離于20世紀(jì)40年代，首次分離到DENV-1(US Hawaii株，1944年夏威夷)至今已70多年。研究認(rèn)為，不同地區(qū)的DENV-1存在一定差異并具明顯地域特征，該血清型可分為5個基因型，其中G-I為主要基因型，亦屬東南亞DENV-1的優(yōu)勢基因型[13-17]。當(dāng)前，G-I仍在全球傳播擴(kuò)散，如2014年日本東京[19]以及我國廣東[4]、福建[5]、廣西[7]等地DF暴發(fā)的病原均為該基因型。本次對云南省DENV-1全編碼區(qū)包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因核苷酸進(jìn)化分析表明，2014和2015年瑞麗及2015年臨滄發(fā)生的本地DF暴發(fā)疫情的病原均為G-I，但這些G-I病毒間仍然存在一定差異，可分為不同的進(jìn)化群。如對瑞麗連續(xù)兩年G-I流行株的比較發(fā)現(xiàn)，無論2014或2015年瑞麗均存在上述兩個進(jìn)化群病毒的流行，提示這兩年雖有不同傳播來源的流行株，但當(dāng)?shù)厝钥赡艽嬖诳缒陚鞑サ牟《局?。?015年臨滄流行株則與同年瑞麗流行株具有較近的親緣關(guān)系，但與2014年瑞麗流行株存在明顯差異，提示2015年臨滄和瑞麗流行株可能來自同一進(jìn)化群。

上述每起DENV-1疫情中，本次均從緬甸輸入性病例和本地病例中分離到DENV-1的G-I病毒，這兩類病例所感染的病毒株均具較近親緣性和較高同源性。如2014年瑞麗本地病例病毒株(DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49)和緬甸輸入性病例病毒株(DGRL-157)均屬同一進(jìn)化亞群；2015年瑞麗市本地病例病毒株(15DGR7)和輸入性病例病毒株(15DGR4)亦為同一亞群；2015年臨滄市本地病例病毒株(LC1502、GM1503)和緬甸輸入病例病毒株(GM1502)也屬相同亞群。由此認(rèn)為，來自相鄰緬甸邊境地區(qū)的DF輸入性病例是引起瑞麗和臨滄市本地DENV-1流行的主要原因，DENV-1的G-I進(jìn)化群屬滇西南中緬兩側(cè)邊境地區(qū)DF流行的主要病原。此外，本次從昆明市輸入性DF患者血清中分離到的兩株DENV-1分別為G-I和G-III，前者與瑞麗和臨滄市流行株具有較近的親緣性，后者為分離自印度輸入性病例并與近期印度流行株具有較近的親緣關(guān)系，尚未發(fā)現(xiàn)G-III本地流行。

E蛋白存在于DENV粒子表面，為主要病毒抗原，它可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，阻斷病毒與細(xì)胞的融合，DENV的毒力基因大多在E 區(qū)。目前認(rèn)為E 蛋白中影響DENV毒力的3 個區(qū)段是：III區(qū)(殘基303～395)，如突變會影響病毒的細(xì)胞嗜性和侵入細(xì)胞；II區(qū)(52～136 和190～284)，若改變會影響病毒促融合活性；II區(qū)和III區(qū)分界面之間的區(qū)域(294～305)[19-20]。本研究云南DENV-1分離株在E 蛋白III區(qū)和II區(qū)中發(fā)現(xiàn)27個氨基酸位點(diǎn)改變，這些位點(diǎn)的改變是否會引起病毒細(xì)胞嗜性和毒力等改變尚需進(jìn)一步研究。E 蛋白中的E155(156)作為糖基化位點(diǎn)，如被破壞會影響病毒毒力，已在DENV-1和DENV-4得到證實(shí)，本次發(fā)現(xiàn)云南株中E155位點(diǎn)已發(fā)生改變(T-S)。E390位點(diǎn)的改變可能會引起E 蛋白功能區(qū)中III區(qū)的特異性表位的改變，進(jìn)而增強(qiáng)病毒對宿主細(xì)胞的吸附而加重感染并可能與DHF/DSS的發(fā)生有關(guān)[20]，本次未從云南分離株中檢測到E390位點(diǎn)的改變。DENV非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的復(fù)制，有的與抗原性和毒力也有一定關(guān)系。本次云南株中幾乎每一種非結(jié)構(gòu)蛋白均存在一定程度的改變，其中與抗原性相關(guān)的NS1也有較多位點(diǎn)改變。另外NS3 具有絲氨酸蛋白酶活性及核苷三磷酸酶活性(NTPase) /RNA解旋酶活性，NS3與此相關(guān)的位點(diǎn)在160～180區(qū)位，本次僅發(fā)現(xiàn)云南有1株(15DGR55)的NS3-170發(fā)生(A-T)改變。

[1] WHO and the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control: new edition[R]. Geneva: WHO, 2009: 3-16.

[2] Bureau of Disease Control and Prevention, Health Department of the People’s Republic of China. Handbook of prevention and control for dengue fever[M]. 2nd ed. Beijing: People’s Health Press, 2008: 13-23. (in Chinese)

衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局. 登革熱防治手冊[M]. 2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，2008: 13-23.

[3] Kraemer MU, Sinka ME, Duda KA, et al: The global distribution of the arbovirus vectorsAedesaegyptiandAe.albopictus[J]. eLife, 2015, 4:e08347. DOI: 10.7554/eLife.08347.001

[4] Sun J, Wu D, Zhou H, et al. The epidemiological characteristics and genetic diversity of dengue virus during the third largest historical outbreak of dengue in Guangdong, China, in 2014[J]. J Infect, 2016, 72(1): 80-90. DOI: 10.1016/j.jinf.2015.10.007

[5] Wang JZ, Chen HB, Zhang YJ, et al. Sequence for E genes of autochthonous dengue virus isolates from Nanping, Fujian province, 2014[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(3): 281-285. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.014 (in Chinese)

王金章，陳宏彬，張擁軍，等. 2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2016，32(3)：281-285. doi:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.014

[6] Sui HT, Ma XJ, Yang YC, et al. Dengue fever outbreak in a district of Fuzhou, Fujian, China, 2015[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(12): 1131-1134. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.017 (in Chinese)

隨海田，馬曉軍，楊益昌，等. 福建省福州市鼓樓區(qū)一起登革熱暴發(fā)疫情現(xiàn)場調(diào)查報告[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2016，32(12)：1131-1134. doi:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.017

[7] Zhang HL, Fu SH, Deng Z, et al. An outbreak of imported dengue fever from Myanmar to the border of China, with its viral molecular epidemiological features[J]. Chin J Epidemiol, 2013, 34(5): 428-432. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2013.05.004 (in Chinese)

張海林，付士紅，鄧掌，等. 云南中緬邊境一起輸入性登革熱暴發(fā)的分子流行病學(xué)研究[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2013，34(5)：428-432. doi:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2013.05.004

[8] Jiang JY, Guo XF, Tang YR, et al. Surveillance and control of imported dengue cases in Yunnan from 2004 to 2014[J]. Chin J Vector Biol Ctrl, 2016, 27(1): 5-8. DOI: 10.11853/j.issn.1003.4692.2016.01.002 (in Chinese)

姜進(jìn)勇，郭曉芳，唐燁榕，等. 云南省2004-2014年輸入性登革熱病例監(jiān)測與防控對策分析[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2016，27(1)：5-8. DOI:10.11853/j.issn.1003.4692.2016.01.002[9] Feng Y, Liu YH, Yin ZL, et al. Molecular epidemiologic analysis of an outbreak of dengue fever in 2013 at Ruili city, Yunnan Province of China[J]. Chin J Viral Dis, 2014, 4(4): 306-311. (in Chinese)

馮云, 劉永華, 尹正留, 等. 云南省瑞麗市2013年登革熱暴發(fā)的分子流行病學(xué)研究[J]. 中國病毒病雜志, 2014, 4(4):306-311.

[10] Liu YH, Feng Y, Yin XX, et al. Molecular epidemiology of dengue virus types 1 and 2 in Ruili, Yunnan, 2014[J]. Dis Surveill, 2016, 31(1): 8-13. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.01.004 (in Chinese)

劉永華，馮云，尹小雄，等. 2014年云南省瑞麗市登革1和2型病毒流行的分子流行病學(xué)研究[J]. 疾病監(jiān)測，2016, 31(1):8-13. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.01.004

[11] Li HC, Pan H, Feng Y, et al. Epidemiological survey of an outbreak of dengue fever in Lincang, Yunnan, 2015[J]. Dis Surveill, 2016, 31(7): 561-565. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.07.007 (in Chinese)

李華昌，潘虹，馮云，等. 2015年云南省臨滄市登革熱暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 疾病監(jiān)測，2016, 31(7):561-565. doi:10.3784/j.issn.1003-9961.2016.07.007

[12] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J]. Mol Biol Evolut, 2013, 30(12): 2725-2729.

[13] Rico-Hesse R. Molecular evolution and distribution of dengue viruses type 1 and 2 in nature[J]. Virology, 1990, 174(2): 479-493.

[14] Villabona-Arenas CJ, Zanotto PMd. Worldwide spread of dengue virus type 1[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e62649. DOI: 10.1371/journal.pone.0062649

[15] Fahri S, Yohan B, Trimarsanto H, et a1. Molecular surveillance of dengue in Semarang, Indonesia revealed the circulation of an old genotype of dengue virus serotype-1[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(8): e2354. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002354

[16] Thu HM, Lowry K, Myint TT, et al. Myanmar dengue outbreak associated with displacement of serotypes 2, 3, and 4 by dengue 1[J]. Emerg Inf Dis, 2004, 10(4): 593-597.

[17] Dubot-PA, Vongphrachanh P, Denny J, et al. An epidemic of dengue-1 in a Remote Village in Rural Laos[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(8): e2360. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002360

[18] Kutsuna S, Kato Y, Moi ML, et al. Autochthonous dengue fever, Tokyo, Japan, 2014[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(3): 517-520. DOI: 10.3201/eid2103.141662

[19] Bray M, Men R, Tokimatsu I, et al. Genetic determinants responsible for acquisition of dengue type 2 virus mouse neurovirulence[J]. J Virol, 1998, 72(2): 1647-1651.

[20] Rey FA, Heinz FX, Mandl C, et al. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution[J]. Nature, 1995, 375(6529): 291-298. DOI: 10.1038/375291a0

Molecular characteristics of the full-length genome of dengue serotype 1 virus strains isolated from dengue fever cases in Sino-Myanmar border region in Yunnan Province, China

HU Ting-song1, ZHANG Hai-lin1, LIU Yong-hua2, XU Song-miao1, YIN Xiao-xiong2, LI Hua-chang3, DENG Bo1, HUANG Ying4, ZHANG Fu-qiang1, FAN Quan-shui1

(1.CenterforDiseaseControlandPrevention,ChengduMilitaryRegion,Kunming650118,China;2.RuiliCenterforDiseaseControlandPrevention,Ruili678600,China;3.LincangPrefectureCenterforDiseaseControlandPrevention,Lincang677000,China;4.TheThirdPeople’sHospitalofKunming,Kunming650041,China)

We investigated the molecular characteristics of the full-length genome of 14 dengue serotype 1 virus (DENV-1) strains isolated in Sino-Myanmar border region in Yunnan Province, China during 2013-2015. Isolation of dengue virus was using C6/36 cell culture method. Viral RNA was extracted from virus isolates, and then the full-length genome was amplified by RT-PCR. The homology and phylogenetic analysis was made on the nucleotide and deduced amino acid sequences by bioinformatics software including ClastalX1.83 and MEGA6 etc. Results showed that fourteen strains of DENV-1 isolated from dengue fever cases, of these, 9 strains from Ruili City of Dehong Prefecture, 3 from Lincang Prefecture, 2 from Kunming City. RT-PCR and sequencing indicated that the full-length genes (10 735 nt) of 14 DENV-1 strains were obtained, and their open reading frame (95-10 271) were coded 3 392 amino acid residues. The genotypes of DENV-1 were revealed by homology and phylogenetic analysis based on structural and non-structural proteins. Thirteen were genotype I (G-I) (7 from indigenous cases in Ruili and Lincang and 6 from imported case from Myanmar to Ruili, Lincang and Kunming), and 1 G-III from imported case from India to Kunming. The phylogenic analysis indicated that the 13 isolates from Yunnan divided into 2 phylogenic subgroups, and they had a closer genetic relationship with the strains isolated from Southeast Asia. The gene sequences of the 13 G-I strains have been acquired, the rate of their nucleotide homology and amino acid homology were 97.02%-100% and 98.78%-100% respectively. Compared with 6 strains from Southeast Asia,nucleotide homology and amino acid homology were 96.53%-99.53% and 97.33%-100% respectively. Compared with prototype strain (US_Hawaii) of DENV-1，nucleotide homology and amino acid homology were 93.76%-94.45% and 95.86%-96.91% respectively.Compared with US_Hawaii strain, there were 44 and 150 different sites in amino acid of structural and non-structural proteins, respectively. The G-1 of DENV-1 have been popular in Sino-Myanmar border region in Yunnan, 2013-2015. They have genetic diversity but multiple transmission sources were from Myanmar, and should strengthen control cross-border spread of dengue fever in this region. It is necessary to further study that change of the amino acid sites of Yunnan strains of DENV-1 is related to its antigenicity and pathogenicity.

dengue serotype 1 virus; full-length genome; phylogenetic analysis; homology analysis; amino acid site analysis

s: Zhang Fu-qiang, Email: zfq1968@aliyun.com;Fan Quan-shui, Email: fqs168@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.001

國家十三、五重大專項(xiàng)(No.2016YFC1200100)，全軍青年培育項(xiàng)目(15QNP035)和中國博士后基金 (No.2015M582907、2016T91009)聯(lián)合資助

張富強(qiáng)，Email: zfq1968@aliyun.com 范泉水，Email: fqs168@126.com

1.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，昆明 650118； 2.瑞麗市疾病預(yù)防控制中心，瑞麗 678600； 3.臨滄市疾病預(yù)防控制中心，臨滄 677000； 4.昆明市第三人民醫(yī)院，昆明 650041

R373.3

A

1002-2694(2017)06-0473-08

2017-02-21 編輯：李友松

Supported by the National Key Basic Research Program of China (No. 2016YFC1200100), the Science and Technology Programs of Military (No. 15QNP035), and the General Financial Grant from the China Postdoctoral Science Foundation (Nos. 2015M582907 and 2016T91009)