Avastin對堿燒傷角膜內新生淋巴管和血管形成的影響

王 進,孫 亮,齊秀英,馬 晶

(1.黑龍江哈爾濱普瑞眼科醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000；2.哈爾濱醫(yī)科大學解剖學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

正常角膜組織內沒有血管及淋巴管分布以維持角膜的透明狀態(tài)和保持角膜處于“免疫赦免”狀態(tài)。在角膜化學燒傷、感染及移植手術的情況下，角膜在損傷修復過程中可能有新生淋巴管和新生血管形成[1]。這些新生淋巴管與血管共同構成角膜的“免疫雙臂”，破壞了角膜原有的免疫赦免功能而發(fā)生免疫排斥反應。Avastin(Bevaeizumab，貝伐單抗)是一種人源化的抗VEGF重組鼠單克隆抗體，能夠阻止VEGF與血管內皮細胞相應的受體結合，進一步抑制血管內皮細胞的有絲分裂過程，從而阻礙新生血管的形成[2]，臨床應用Avastin滴眼液治療眼新生血管形成相關疾病已獲得了良好的治療效果[3]。VEGF-C是最早發(fā)現(xiàn)的具有促進淋巴管生成作用的因子，通過與受體VEGFR-3結合后，促進淋巴管內皮細胞的分化和增殖[4]。本研究通過制備小鼠堿燒傷角膜模型，結膜下注射Avastin，采用免疫組化法觀察堿燒傷后不同時期小鼠角膜組織內VEGF-C的表達情況，以及角膜堿燒傷后新生淋巴管和新生血管的生成情況，探討Avastin對角膜新生淋巴管和新生血管形成的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 建立小鼠角膜堿燒傷動物模型

取體重25～30 g，8～10周齡C57BL/6J小鼠36只，購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供。將直徑3 mm圓形單層濾紙浸入1 mol/L NaOH溶液中，30 s左右使濾紙達到飽和狀態(tài)，吸除多余液體。小鼠0.5%利多卡因角膜局部麻醉數(shù)秒，拭去多余的藥液，將3 mm圓形濾紙片置于小鼠右眼角膜中央20 sec，用生理鹽水沖洗結膜囊1 min。左眼作為正常對照。

1.2 實驗動物分組

小鼠角膜堿燒傷模型制備后，將36只小鼠隨機分為Avastin治療組和對照組。Avastin治療組小鼠堿燒傷2 h后給予25 mg/mL Avastin 5 μL結膜下隔日注射及每日左氧氟沙星滴眼液滴眼3次，用藥兩周；堿燒傷對照組小鼠每日給予左氧氟沙星滴眼3次，用藥兩周。于堿燒傷后3 d、7 d和12 d處死小鼠，每個時間段6只小鼠，取出雙側眼球，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.3 主要試劑

兔抗小鼠LYVE-1、兔抗鼠VEGF-C抗體和Avastin購自Santa Cruz公司；PV-6001試劑盒購自博士德生物公司。

1.4 免疫組化染色步驟

采用SP法，組織切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2作用10 min，目的是阻斷內源性過氧化物酶活性。0.01MPBS沖洗3次，每次5 min，然后將切片放入0.01 M檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)中高壓2 min進行抗原修復。0.01 MPBS沖洗3次，滴加一抗(LYVE-1和VEGF-C的工作濃度均為1∶200)，4 ℃冰箱孵育12～24 h。0.01MPBS沖洗3次，滴加二抗室溫孵育30 min。0.01MPBS沖洗3次，DAB顯色。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 結果判斷和統(tǒng)計學方法

圖像分析儀(Image-ProPlus 6.0)分析實驗結果，測定免疫組化結果的光密度值(optical density,OD)。在200倍顯微鏡下隨機觀察每個時間段標本的6個視野，對染色結果進行圖象分析，計算OD的均值，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 堿燒傷角膜內新生淋巴管的形成情況

在堿燒傷后7 d和12 d時間段，對照組角膜內可見LYVE-1陽性表達的新生淋巴管，淋巴管形狀不規(guī)則，部分管壁不完整呈開放狀態(tài)(圖1)。在Avastin治療組，堿燒傷后12d可見角膜內LYVE-1表達呈陽性的開放狀態(tài)的新生淋巴管(圖2)，Avastin治療組角膜新生淋巴管出現(xiàn)的時間較對照組有明顯延遲現(xiàn)象。

2.2 堿燒傷角膜內新生血管形成的觀察

小鼠角膜堿燒傷后第3 d，體視顯微鏡下觀察對照組角膜，可見到角膜新生血管生長。與對照組相比，Avastin治療組角膜新生血管的生成較對照組少，新生血管的生長明顯受到抑制(圖3)。

2.3 VEGF-C免疫組化結果

正常小鼠角膜上皮細胞和角膜內皮細胞均表達VEGF-C蛋白(圖4A)。在堿燒傷對照組中，堿燒傷后3 d，角膜基質層內可見大量的炎性細胞浸潤，VEGF-C表達于角膜上皮細胞和炎性細胞內，表達水平較強(圖4B)。堿燒傷后7 d，角膜上皮細胞和炎性細胞內VEGF-C表達(圖4C)呈減弱趨勢。堿燒傷后12 d，VEGF-C表達水平下降接近正常角膜VEGF-C表達的水平(見圖4D)。在Avastin治療組中，VEGF-C亦表達于角膜上皮細胞和炎性細胞內，在3 d和7 d時間段，Avastin治療組VEGF-C的表達均低于相應時間段對照組VEGF-C的表達(圖5)。

圖1 堿燒傷后對照組7d和12d角膜內新生的淋巴管(箭頭)×400

圖2 Avastin治療組12d角膜內新生的淋巴管(箭頭)×400

圖3 角膜堿燒傷對照組3d,7d和12d 角膜新生血管(A,B,C)Avastin治療組3d,7d和12d角膜新生血管(D,E,F)

圖4 正常角膜(A)和堿燒傷后對照組3 d,7 d和12 d角膜(B,C,D)內VEGF-C的表達×200

圖5 Avastin治療組3 d,7 d和12 d角膜內VEGF-C的表達(A,B,C)×200

采用圖像分析軟件分析角膜堿燒傷后對照組和治療組不同時間段VEGF-C表達的光密度值，結果表明，與對照組VEGF-C的表達相比較，3 d、5 d和7 d時間段Avastin治療組角膜VEGF-C的表達明顯降低，二者之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

角膜新生淋巴管和新生血管的形成與角膜炎癥和角膜移植排斥反應密切相關，新生淋巴管和新生血管的形成不僅改變了角膜的“免疫赦免”的解剖特點，也是臨床角膜移植排斥反應的主要原因，同時亦增加了角膜的混濁度[5]。近年隨著血管和淋巴管生成因子(VEGF-C)和淋巴管內皮特異性標記物(LYVE-1)的發(fā)現(xiàn)，人們對角膜淋巴管生成和血管生成與VEGF-C的關系進行了深入研究[6]。VEGF-C可通過與受體VEGFR-3結合，使得VEGFR-3發(fā)生磷酸化，激活VEGF-C/VEGFR-3信號通路，誘導組織內淋巴管生成和血管生成。VEGF-C與VEGFR-3結合還可能激活多條細胞內信號傳導通路，促進淋巴管和血管內皮細胞增殖、分化、遷移、抗凋亡等重要生物學行為偶聯(lián)，最終形成淋巴管和血管[7]。

研究表明,人源性Avastin能夠抑制VEGF與血管內皮細胞表面的受體結合，從而抑制新生血管的形成。目前，Avastin在眼科的主要應用集中于Avastin眼內注射治療血管源性眼科疾病，例如視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病視網膜病變、新生血管性青光眼等[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠角膜堿燒傷對照組，燒傷后7 d的角膜基質層內可觀察到大量的LYVE-1陽性表達的新生淋巴管，部分呈開放狀態(tài)，部分呈不規(guī)則條索狀。在Avastin治療組，堿燒傷后12 d，可見管腔呈開放狀態(tài)的淋巴管，且淋巴管的數(shù)量低于堿燒傷對照組，表明結膜下注射Avastin可延遲和減少堿燒傷角膜內新生淋巴管的形成。在角膜堿燒傷后新生血管生成方面，堿燒傷對照組小鼠角膜堿燒傷后第3 d，體視顯微鏡下即可見到新生血管生長進入角膜內，角膜堿燒傷后第12 d時間段，部分新生血管侵入角膜堿燒傷斑。而在Avastin治療組，堿燒傷后第3 d，僅在角膜緣處可見到新生血管芽，堿燒傷后第12 d，可見稀疏的新生血管分布于堿燒傷斑的周邊。這說明結膜下注射Avastin可顯著延遲和減少角膜新生血管的形成時間和數(shù)量。本研究應用免疫組化檢測證實，Avastin治療組與堿燒傷對照組比較，VEGF-C在不同時間段的表達量均顯著降低，新生淋巴管和新生血管的數(shù)量也明顯減少，其機制可能是Avastin下調VEGF-C的表達或Avastin與VEGF-C結合，阻止了VEGF-C與淋巴管和血管內皮細胞表面受體結合，從而抑制了內皮細胞的有絲分裂和增殖，從而阻礙了新生淋巴管和血管的形成。預防和抑制角膜新生淋巴管和新生血管生成對降低角膜移植的排斥風險、提高角膜移植的成功率以及治療眼科血管源性疾病等方面都具有重要的實際意義，然而角膜新生淋巴管和新生血管的形成是一個極其復雜的過程，可能需要很多因子或多條分子通路參與，因此，對角膜新生淋巴管和新生血管生成的分子機制、角膜淋巴管和血管生成與VEGF-C的確切關系還需進一步研究。

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