金納米粒子表面等離子共振吸收特性快速檢測(cè)脫落酸

朱娟花, 王 順, 李 偉, 常課課, 郭清乾, 孫海峰, 王滿蘋(píng), 江 敏, 張 浩, 胡建東,5

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002;3.安陽(yáng)學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000;4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002; 5.小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

金納米粒子表面等離子共振吸收特性快速檢測(cè)脫落酸

朱娟花1, 王 順1, 李 偉2, 常課課1, 郭清乾1, 孫海峰1, 王滿蘋(píng)3, 江 敏4, 張 浩1, 胡建東1,5

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002;3.安陽(yáng)學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000;4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002; 5.小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

提出了一種基于金納米粒子表面等離子共振吸收特性快速檢測(cè)脫落酸的新方法。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)獲取金納米粒子在加入不同目標(biāo)物質(zhì)時(shí)的吸收光譜，并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的可行性。在優(yōu)化NaCl濃度條件下，采用5、20、 50、 100、 200 μmol·L-1脫落酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，以吸光度比值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，脫落酸濃度與吸光度比值(A620/A522)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996。

金納米粒子；表面等離子共振；植物激素；脫落酸

植物激素是由植物自身代謝產(chǎn)生的一類有機(jī)物質(zhì)，并自產(chǎn)生部位移動(dòng)到作用部位，在極低濃度下就有明顯生理效應(yīng)的微量物質(zhì)，也被稱為植物天然激素或植物內(nèi)源激素。在細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)、組織與器官分化、開(kāi)花與結(jié)實(shí)、成熟與衰老、休眠與萌發(fā)以及離體組織培養(yǎng)等方面，分別或相互協(xié)調(diào)地調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育與分化[1-2]。脫落酸 (Abscisic Acid, ABA) 是植物激素之一，能抑制植物生長(zhǎng)、促進(jìn)休眠、引起氣孔關(guān)閉、調(diào)節(jié)種子胚的發(fā)育、增加抗逆性等生理作用[3-5]。因此，實(shí)現(xiàn)植物激素脫落酸進(jìn)行高靈敏度、高特異性檢測(cè)具有重要意義。目前，脫落酸的測(cè)定方法有多種，主要有酶聯(lián)免疫法[6]，毛細(xì)管電泳法[7]，化學(xué)發(fā)光法[8]，表面等離子共振法[9]，高效液相色譜法[10-11]法，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[12]及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (HPLC-MS)[13-15]等。這些方法分析比較復(fù)雜，步驟也較為繁瑣，而儀器聯(lián)用設(shè)備昂貴，使用和維護(hù)成本高。

金納米是目前研究最為廣泛的納米材料之一， 具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，并且具有獨(dú)特的光學(xué)效應(yīng)。當(dāng)金納米粒子粒徑與入射光波長(zhǎng)相匹配時(shí)，入射光電磁場(chǎng)誘導(dǎo)價(jià)帶電子發(fā)生極化，從而產(chǎn)生對(duì)入射光能量的吸收，即表面等離子體共振 (SPR) 吸收，吸收峰的位置與顆粒的形態(tài)及周圍環(huán)境的介電常數(shù)密切相關(guān)[16-18]。金納米粒子具有非常高的摩爾消光系數(shù)，可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)。采用檸檬酸鈉還原法制備的13.5 nm球形金納米粒子吸收峰位于520 nm附近[19]。核酸適配體是利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)體外篩選出來(lái)的與靶物質(zhì)高特異性結(jié)合的單鏈DNA/RNA。作為一種新型分子識(shí)別元件，與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體不僅對(duì)目標(biāo)物質(zhì)具有高度的親和力與特異性，而且具有靶標(biāo)范圍廣、易合成、易修飾和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[20-21]。基于金納米粒子和核酸適配體的比色分析已成為研究的熱點(diǎn)[22]。當(dāng)核酸適配體與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，核酸適配體自身的構(gòu)象會(huì)隨之發(fā)生變化[23-26]。

本研究根據(jù)金納米粒子表面等離子共振吸收特性構(gòu)建了一種脫落酸快速檢測(cè)新方法。以篩選的脫落酸核酸適配體[27]為識(shí)別單元，當(dāng)體系中不存在脫落酸時(shí)，核酸適配體纏繞在納米金粒子表面，由于核酸鏈帶負(fù)電荷，增加了金納米表面的靜電斥力，從而使金納米粒子能夠在較高鹽濃度條件下仍然保持其良好的分散性，溶液呈紅色。當(dāng)體系中存在目標(biāo)物質(zhì)脫落酸時(shí)，脫落酸與其適配體發(fā)生特異性結(jié)合誘導(dǎo)適配體構(gòu)象發(fā)生變化，剛性增強(qiáng)，從金納米粒子表面解離下來(lái)，失去保護(hù)的金納米粒子在鹽存在條件下出現(xiàn)一定程度的團(tuán)聚，顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色。金納米粒子這種表面等離子共振吸收光譜的變化可通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)儀進(jìn)行識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)脫落酸的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

脫落酸 (Sigma-Aldrich，USA)；脫落酸適配體序列：5’-GCG GAT GAA GAC TGG TGT GAG GGG ATG GGT TAG GTG GAG GTG GTT ATT CCG GGA ATT CGC CCT AAA TAC GAG CAA C-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；甲醇和氯化鈉 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)，分析純)；PBS緩沖液(pH 7.4，Solarbio)；膠體金(13.5±1.0) nm，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備；整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程均使用去離子水。

1.2 儀器和裝置

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) (南京菲勒儀器有限公司)；搖床；迷你金屬?。粶u旋混合器；LX-手掌型離心機(jī) (其林貝爾儀器制造有限公司，南京)。

1.3 分析方法

1.3.1 驗(yàn)證試驗(yàn) 100 μL金納米溶膠中分別加入：(1) 60 nmol·L-1適配體+100 mmol·L-1NaCl(a)；(2) 60 nmol·L-1適配體+5 μmol·L-1脫落酸+100 mmol·L-1NaCl(b)；(3) 100 mmol·L-1NaCl(c)。首先金納米溶膠加入適配體反應(yīng)30 min，然后再加入脫落酸37 ℃下孵育1 h，最后再分別加入100 nmol·L-1的NaCl進(jìn)行光譜掃描。

1.3.2 NaCl濃度條件的優(yōu)化 100 μL金納米溶液與60 nmol·L-1適配體反應(yīng)30 min后，加入5 μmol·L-1脫落酸，37 ℃下孵育1 h，最后分別加入40、60、80、100、120 nmol·L-1的NaCl進(jìn)行光譜掃描。

1.3.3 脫落酸定量檢測(cè) 進(jìn)行脫落酸定量檢測(cè)時(shí)，將30 μL 1 μmol·L-1脫落酸核酸適體與100 μL金納米溶膠室溫下混合30 min，然后分別加入100 μL 的5、20、50、100、200 μmol·L-1脫落酸，加入170 μL的去離子水， 37 ℃下反應(yīng)1 h，接著加入100 μL NaCl，最終總體積為500 μL，混勻后立即用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在300～800 nm范圍內(nèi)掃描記錄表面等離子共振吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物激素脫落酸的檢測(cè)原理

由檸檬酸鈉還原法制備得到的金納米粒子表面結(jié)合有檸檬酸根負(fù)離子，粒子間存在靜電斥力，具有較好的分散性，溶液呈紅色。加入一定濃度的脫落酸適配體后，適配體N原子與Au原子通過(guò)形成Au-N配位鍵從而使核酸適配體吸附在金納米表面，增加了金納米表面的靜電斥力，在較高的鹽濃度下仍然分散良好，溶液呈紅色。加入目標(biāo)分析物脫落酸后，脫落酸與核酸適配體特異性結(jié)合，失去保護(hù)的金納米粒子在鹽存在的條件下發(fā)生團(tuán)聚，溶液呈藍(lán)色，吸收光譜發(fā)生變化，金納米粒子的團(tuán)聚程度與脫落酸濃度的高低密切相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)脫落酸的檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)脫落酸的可行性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法檢測(cè)植物激素脫落酸的可行性，按照1.3.1的分析方法，加入不同物質(zhì)后金納米粒子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖1所示。加入NaCl溶液后，金納米粒子之間的電荷平衡被破壞，發(fā)生團(tuán)聚，在700 nm附近出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰 (曲線c)。加入適配體后，受適配體保護(hù)的金納米粒子在鹽存在的條件下，仍能保持金納米粒子原有的吸收光譜，最大吸收峰在522 nm(曲線a)。加入目標(biāo)分析物后，適配體與脫落酸發(fā)生特異性結(jié)合，從金納米粒子表面解離下來(lái)，失去保護(hù)的金納米粒子在鹽條件下發(fā)生團(tuán)聚，吸收光譜在550～650 nm范圍內(nèi)發(fā)生變化。本試驗(yàn)在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)選取620 nm作為新的特征吸收波長(zhǎng)，采用A620/A522比值的大小來(lái)評(píng)價(jià)金納米團(tuán)聚程度，A620/A522比值越大，團(tuán)聚程度越高，目標(biāo)物濃度越大，從而實(shí)現(xiàn)脫落酸的檢測(cè)。

圖1 金納米粒子加入不同物質(zhì)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of AuNP solutions after addition of different materials

2.3 NaCl濃度條件的優(yōu)化

金納米粒子凝聚程度與鹽濃度密切相關(guān)，按照1.3.2的分析方法，隨著NaCl濃度的增加，金納米粒子顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色。根據(jù)加入脫落酸前后吸收光譜比值的變化Δ(A620/A522)判斷最佳的NaCl濃度，如圖2所示。從圖2可以看出，隨著NaCl濃度的增加，Δ(A620/A522)逐漸增大，這是因?yàn)殡S著NaCl濃度的增大，金納米團(tuán)聚程度增大，當(dāng)NaCl濃度增大為100 mmol·L-1時(shí)，Δ(A620/A522)達(dá)到最大。而當(dāng)NaCl濃度增大到120 mmol·L-1時(shí)，Δ(A620/A522)略有降低，這可能是因?yàn)楫?dāng)NaCl濃度大于100 mmol·L-1，金納米粒子發(fā)生了過(guò)聚集狀態(tài)。因此，最佳NaCl濃度為100 mmol·L-1。

圖2 NaCl濃度對(duì)金納米離子吸收光譜比值變化的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration on Δ(A620/A522)

2.4 脫落酸的定量檢測(cè)

在上述優(yōu)化NaCl濃度條件下采用該方法定量檢測(cè)植物激素脫落酸，將不同濃度的脫落酸與一定量的金納米-適配體混合，37 ℃孵育1 h，然后加入100 μL 500 mmol·L-1NaCl，用振蕩器混合均勻，按照1.3.3分析方法，然后轉(zhuǎn)入微量比色皿中，進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。隨著脫落酸濃度的增大，620 nm處吸光度逐漸增大。用A620/A522比值定量反應(yīng)脫落酸濃度，如圖4所示。其中橫坐標(biāo)為脫落酸濃度，縱坐標(biāo)為A620/A522比值。從圖4可以看出，當(dāng)脫落酸濃度在5～200 μ mol·L-1范圍時(shí)，濃度與A620/A522比值呈線性相關(guān)，線性方程為A620/A522=0.378 1+0.001 2C，線性系數(shù)為0.996，具有較好的線性關(guān)系。

圖3 不同濃度脫落酸的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

圖4 脫落酸濃度與A620/A522比值之間的關(guān)系Fig.4 Calibration curve of the adsorption ratio (A620/A522) versus the concentration of ABA

3 結(jié)論

本研究采用自動(dòng)掃描紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)獲取金納米粒子在加入不同目標(biāo)分析物脫落酸后金納米粒子表面等離子共振吸收光譜特性，建立了快速檢測(cè)植物激素脫落酸方法。通過(guò)試驗(yàn)分析了金納米粒子凝聚程度與NaCl濃度的關(guān)系，建立了2個(gè)特征波長(zhǎng)下吸光度比值A(chǔ)620/A522與檢測(cè)目標(biāo)物脫落酸濃度曲線。結(jié)果表明，目標(biāo)物脫落酸存在與否吸收光譜具有顯著差異，在優(yōu)化NaCl濃度條件下，脫落酸濃度在5～200 μmol·L-1范圍時(shí)，吸光度比值(A620/A522)與樣品濃度具有較好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.996?；诮鸺{米粒子表面等離子共振吸收光譜特性為植物激素脫落酸快速定量檢測(cè)提供了一條有效的途徑。

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(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

Rapid detection of abscisic acid based on the surface plasmon resonance absorption properties of gold nanoparticles

ZHU Juanhua1， WANG Shun1, LI Wei2, CHANG Keke1, GUO Qingqian1, SUN Haifeng1, WANG Manping3, JIANG Min4, ZHANG Hao1, HU Jiandong1,5

(1.College of Mechanical and Electrical Engineering, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.School of Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 3.Anyang University, Anyang 455000， China; 4.College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 5.State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Zhengzhou 450002, China)

In this paper, a novel rapid method of detecting abscisic acid was demonstrated based on the surface plasmon resonance absorption properties of gold nanoparticles. The absorption spectra of AuNPs was recorded by an ultraviolet-visible spectrophotometer, and its feasibility was verified by experiments. Under the optimized NaCl condition, the standard concentration of 5, 20, 50, 100, 200 μmol·L-1were detected, respectively. There was a good linear relationship between the concentrations of ABA and the ration of absorbance (A620/A522) with the correlation coefficient R of 0.996.

gold nanoparticles; surface plasmon resonance; plant hormones; abscisic acid

2016-08-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (U1304305, 31671581)；小麥玉米作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SKL2014ZH-06, 39990026)

朱娟花(1975-)，女，河南郟縣人，副教授，碩士，從事測(cè)試技術(shù)與信號(hào)處理方面的研究。

胡建東(1965-)，男，江西新余人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師。

1000-2340(2017)01-0066-05

S24

A