TaCYP78A5基因過表達小麥的遺傳和功能初步分析

陳之忍，馬 猛，申玉霞，吳林楠，劉香利,2，趙惠賢,2

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

TaCYP78A5基因過表達小麥的遺傳和功能初步分析

陳之忍1，馬 猛1，申玉霞1，吳林楠1，劉香利1,2，趙惠賢1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

為了驗證小麥籽粒大小相關(guān)基因 TaCYP78A5在小麥籽粒發(fā)育中的功能，對pINO啟動子驅(qū)動的 TaCYP78A5基因過表達的轉(zhuǎn)基因小麥后代株系進行了鑒定，檢測了T0代植株目標基因拷貝數(shù)，定量分析了7個T1代陽性植株的目標基因表達，并對其籽粒大小進行了統(tǒng)計。結(jié)果表明，利用Bar試紙條和目標基因特異PCR檢測相結(jié)合的方法對21株轉(zhuǎn)基因T0代再生苗進行檢測，共鑒定出14個陽性植株，除2個植株的目標基因拷貝數(shù)為3和1個植株為7外，其余11個T0代轉(zhuǎn)基因植株目標基因插入拷貝數(shù)均為1～2個，其中有6個單拷貝植株。與野生型相比，7個T1代陽性植株目標基因表達量均極顯著增加，粒厚和粒寬均有不同程度增加，粒重極顯著增加。

小麥； TaCYP78A5基因；Bar基因；轉(zhuǎn)基因株系

小麥(TriticumaestivumL.)是主要的糧食作物之一，在谷物種植中居于首位[1]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，全球范圍內(nèi)耕地面積下降，環(huán)境逐漸惡化，使得小麥生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，提高小麥產(chǎn)量，維持其可持續(xù)供應具有重要意義[2]。籽粒大小是決定谷物產(chǎn)量的重要組成因素之一，也是現(xiàn)代作物育種的一個重要選擇性狀[3-4]。在水稻和擬南芥中，許多與種子大小相關(guān)的基因都已被克隆并進行了功能鑒定，但小麥種子大小相關(guān)基因的分離和功能研究僅有個別報道[5]。

細胞色素P450(Cytochromes P450)是植物最大的蛋白家族之一[6]，此類蛋白含有硫羥基和血紅素結(jié)構(gòu)域，在多個生化代謝途徑中起著重要的作用，參與多種生物合成和分子解毒[7]。 CYP78A家族是植物特有的細胞色素P450家族成員，在陸生植物中高度保守[8]。許多 CYP78A家族成員作用于植物生殖器官和籽粒的生長發(fā)育，被認為是可以用于作物改良[9]。例如，在擬南芥中， KLUH(KLU)/CYP78A5以及 CYP78A7通過非細胞自主信號來促進器官的生長，它們的活性高低與種子大小成正相關(guān)[10]；在水稻中， CYP78A13通過調(diào)節(jié)胚與胚乳之間的大小平衡來調(diào)節(jié)種子的大小，功能缺失突變體的種子胚增大但胚乳減小，而過表達則會導致種子的胚減小和胚乳增大[4,11]；在番茄中，KLUH的直系同源基因SIKLUH通過增加果皮和中隔組織細胞數(shù)目增大了果實的體積，提高了果實的品質(zhì)[12]。

本實驗室馬 猛等[5,9]采用大麥條斑花葉病毒誘導基因沉默(BSMV-VIGS)的技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，小麥 TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因沉默可導致小麥籽粒變小，而在擬南芥中過表達 TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因可導致其種子增大。由此初步認為， TaCYP78A3和 TaCYP78A5基因具有調(diào)控小麥籽粒大小的功能。為了進一步驗證 TaCYP78A5基因在小麥種子發(fā)育中的功能，本研究以擬南芥胚珠珠被特異表達啟動子pINO(Promoter of INNER NO OUTER)驅(qū)動的 TaCYP78A5基因過表達載體pCAMBIA3301-TaCYP78A5 轉(zhuǎn)化春小麥JW1所得T0代和T1代轉(zhuǎn)基因植株為材料，進行分子檢測及遺傳 分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料及載體

由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化并經(jīng)PPT篩選攜帶 TaCYP78A5基因的T0代轉(zhuǎn)基因植株和野生型受體小麥JW1由濟南邦迪生物科技有限公司提供。轉(zhuǎn)化所用雙元植物表達載體pCAMBIA3301- TaCYP78A5由本實驗室程繪繪[13]構(gòu)建，其T-DNA結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.1.2 試劑

2×EsTaqMasterMix和DNA Marker DL2000為康為世紀產(chǎn)品；2× Premix ExTaq、Fruit-mateTMfor RNA Purification和RNAiso Plus為TaKaRa產(chǎn)品；GoScriptTMReverse Transcriptase System和2× SYBR Green Master Mix為Promega產(chǎn)品；PAT/Bar檢測試紙條為EnviroLogix產(chǎn)品；引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

Camv35S：花椰菜病毒35S強啟動子；pINO：胚珠珠被特異性啟動子。

Camv35S:Cauliflower mosaic virus 35S promoter; pINO:Promoter of INNER NO OUTER.

圖1 植物表達載體pCAMBIA3301- TaCYP78A5的T-DNA結(jié)構(gòu)

Fig.1 T-DNA region of plant expression vector pCAMBIA3301- TaCYP78A5

1.2 方 法

1.2.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株Bar試紙條檢測及目標基因特異PCR檢測

野生型JW1和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化篩選后再生植株于株高3～5 cm時進行移栽，移栽前剪取部分葉片至1.5 mL離心管中，用研磨棒搗碎，加入500 μL EB2 Extraction Buffer，將試紙條按正確方向插入混合液中，靜置10 min，觀察條帶的變化。

再生植株移栽溫室后，三葉期取葉片，利用CTAB法提取其基因組DNA。以ddH2O為空白對照，野生型小麥JW1為陰性對照，植物表達載體pCAMBIA3301- TaCYP78A5為陽性對照，利用特異性引物SPA5-F/SPA5-R(SPA5-F:5′-GC TACGACGATTTCACAAGCCAAG-3′，位于目標基因 TaCYP78A5內(nèi)；SPA5-R：5′-GCCTG CCCAACCTTTCGGTAT-3′，位于GUS基因內(nèi))對轉(zhuǎn)基因小麥進行PCR鑒定。PCR反應體系：2× EsTaqMasterMix 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，照相分析。

1.2.2 T0代轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測

通過qPCR(TaqMan探針法)對Bar試紙條及目標基因特異PCR鑒定均為陽性的轉(zhuǎn)基因植株進行拷貝數(shù)檢測。內(nèi)參基因選用小麥中的單拷貝基因Pinb[14]。使用Primer Premier 5.0設計目標基因所用引物和探針，為了防止內(nèi)源基因?qū)z測的干擾，上游引物位于目標基因 TaCYP78A5上，下游引物和探針位于GUS基因上。引物和探針序列見表1。以5倍梯度稀釋的轉(zhuǎn)基因植株T0A5-21的基因組DNA為模板，ddH2O為空白對照，野生型小麥JW1為陰性對照，進行qPCR，3個重復，得到Pinb和 TaCYP78A5基因的標準曲線。PCR反應體系：2× Premix ExTaq10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.25 μL，5 μmol·L-1的TaqMan探針1.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。參照劉振華等[14]和Weng等[15]的方法對 TaCYP78A5基因的拷貝數(shù)進行測定，各待測樣品設置3個重復得到其Ct值，由公式X=2×10[(Ctx-Ix)/Sx-(CtR-IR)/SR] 計算出目標基因的拷貝數(shù)。其中，IX和IR是 TaCYP78A5和Pinb的標準曲線的截距，SX和SR是 TaCYP78A5和Pinb的標準曲線的斜率，CtX和CtR是各待測樣品 TaCYP78A5與Pinb基因的Ct值。 TaCYP78A5基因的拷貝數(shù)估測值是將X值的小數(shù)按大于0則入的原則只保留整數(shù)得到的。

表1 實時熒光定量PCR的引物及探針序列Table 1 Sequences of primer and probe for real-time PCR

1.2.3 T1代單拷貝轉(zhuǎn)基因植株最適Basta濃度的確定及其目標基因的遺傳分析

將6個T0代單拷貝植株及野生型JW1植株種子在溫室中加代繁殖，于三葉期，利用CTAB法提取T1代基因組DNA，對其進行PCR鑒定，PCR反應體系及條件同1.2.1。于拔節(jié)期，設置5個Basta溶液濃度梯度(10、20、50、100和200 mg·L-1)，用棉簽將Basta溶液均勻涂抹于轉(zhuǎn)基因小麥和野生型JW1葉片，5個重復，每隔2 d觀察表型，一周后統(tǒng)計結(jié)果。利用確定的最適Basta濃度涂抹T1代各轉(zhuǎn)基因植株，比較其和PCR鑒定結(jié)果，統(tǒng)計陽性植株和陰性植株的數(shù)量。

1.2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株目標基因的表達量檢測

選取7個T1代陽性植株(T1A5-18株系所對應的T1代植株由于錯過取樣時間而沒有取樣)和野生型JW1，取其開花前胚珠，采用試劑盒提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系：5×Reaction Buffer 4 μL，25 mmol·L-1MgCl24 μL，Random Primer 0.5 μL，qA5-R 0.5 μL，PCR Nucleotide Mix 1 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.4 μL，Reverse Transcriptase 1 μL，RNA 8 μL，用ddH2O補至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃退火5 min，42 ℃延伸30 min，70 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活15 min。得到cDNA后通過qRT-PCR來檢測目標基因的表達情況，內(nèi)參基因選擇GADPH來進行歸一化處理。定量PCR以ddH2O為空白對照，野生型小麥JW1為陰性對照，每個樣品設置3個重復。PCR反應體系：2× SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，45個循環(huán)。目標基因檢測所用引物為qA5-F/qA5-R(表1)，內(nèi)參基因引物為GADPH-F/GADPH-R(GADPH-F：5′-CCTTCCGTGTTCCCACTGTTG-3′；GADPH-R：5′-ATGCCCTTGAGGTTTCCCTC-3′)。qRT-PCR結(jié)束后，分析各植株的Ct值，計算出相對表達量。

1.2.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株籽粒大小的統(tǒng)計

待小麥種子成熟并干燥后，選取qRT-PCR分析所用7個陽性植株的主穗穗中部的10粒種子，用游標卡尺測定粒寬、粒長和粒厚，同時使用電子天平測量單粒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果

對T0代轉(zhuǎn)基因植株進行了Bar試紙條檢測及多次重復PCR檢測，圖2A中Bar試紙條檢測結(jié)果顯示，陰性對照(野生型JW1)和陰性轉(zhuǎn)基因植株只顯示一條控制線，而陽性轉(zhuǎn)基因植株則可同時顯出控制線和檢測線；圖2B中PCR檢測檢測結(jié)果顯示，空白對照(ddH2O)和陰性對照(野生型JW1)基因組均沒有擴增出預期目的條帶，而陽性對照(pCAMBIA3301-TaCYP78A5質(zhì)粒)與陽性轉(zhuǎn)基因植株可擴增出與理論值一致的1 353 bp目的條帶。從圖2中可以看出，Bar試紙條檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致，21株轉(zhuǎn)基因再生苗中共鑒定出14株陽性植株。

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)入基因拷貝數(shù)

以T0A5-21的基因組DNA(5倍的稀釋，設置5個梯度)作為模板進行實時定量PCR，得到Pinb和 TaCYP78A5基因的擴增曲線，并以模板濃度(C)的Log值和對應的Ct值為X軸和Y軸，得到Pinb和 TaCYP78A5基因的標準曲線(圖3)。2個基因的擴增標準曲線的相關(guān)系數(shù)都為0.998，接近于1，所以得到的標準曲線可以用于測定T0代轉(zhuǎn)基因植株的目標基因拷貝數(shù)。

分別以各轉(zhuǎn)基因陽性植株的基因組DNA為模板，用內(nèi)參基因Pinb和 TaCYP78A5基因特異引物和探針進行TaqMan實時定量PCR擴增，每個待測樣品設定3個重復，得到其Ct值(表2)，參照劉振華等[14]和Weng等[15]的方法進一步計算各轉(zhuǎn)基因陽性植株中目標基因的拷貝數(shù)(表2)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后代目標基因拷貝數(shù)均較低，14個陽性植株中除了2個植株的外源基因拷貝數(shù)為3和1個植株為7外，其余的均為1～2個拷貝，其中有6個單拷貝植株，約占總檢測數(shù)目的一半。

T0A5-1至T0A5-24：轉(zhuǎn)基因植株；M：DL2000；H2O：ddH2O；Y：pCAMBIA3301- TaCYP78A5。

T0A5-1-T0A5-24:Transgenic plants; M:DL2000; H2O:ddH2O; Y:pCAMBIA3301- TaCYP78A5.

圖2 轉(zhuǎn)基因植株Bar試紙條檢測(A)和PCR檢測(B)結(jié)果

Fig.2 Pictures of transgenic plants by Basta strips (A) and PCR (B)

圖3 內(nèi)參基因Pinb(A)和目標基因 TaCYP78A5(B)的擴增標準曲線

轉(zhuǎn)基因植株TransgenicplantCt(Pinb)Ct(TaCYP78A5)X拷貝數(shù)估測值EstimatedcopiesT0A5-127.22±0.04030.16±0.0050.141T0A5-226.56±0.05027.48±0.0300.731T0A5-325.13±0.02524.67±0.0302.683T0A5-427.64±0.01027.76±0.0101.182T0A5-625.11±0.03025.11±0.1101.872T0A5-1025.83±0.01524.10±0.1656.587T0A5-1325.49±0.08026.44±0.0500.841T0A5-1525.35±0.02026.49±0.0150.761T0A5-1626.33±0.01026.29±0.0101.612T0A5-1826.31±0.01527.38±0.0750.671T0A5-1925.09±0.03524.96±0.0352.083T0A5-2126.02±0.02526.01±0.1001.652T0A5-2228.72±0.02028.28±0.0251.562T0A5-2428.26±0.01529.02±0.0100.651

X：拷貝數(shù)計算值。X：Caculated copies.

2.3 轉(zhuǎn)基因植株最適Basta濃度

分別用10、20、50、100和200 mg·L-1五個濃度梯度的Basta溶液涂抹拔節(jié)期的陽性轉(zhuǎn)基因小麥T1A5-2、陰性轉(zhuǎn)基因小麥T1A5-5和野生型JW1，結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，野生型JW1和轉(zhuǎn)基因陰性對照T1A5-5的葉片在Basta濃度為10 mg·L-1時，幾乎沒有變化，隨著Basta溶液濃度的增大，葉片的枯萎面積逐步增大，當濃度達到100 mg·L-1時，葉片涂抹部分已全部枯萎，而轉(zhuǎn)基因陽性小麥株系葉片在Basta溶液濃度200 mg·L-1時仍保持正常生長。為了防止假陽性結(jié)果出現(xiàn)，選用200 mg·L-1的Basta來篩選T1代轉(zhuǎn)基因植株，鑒定部分統(tǒng)計結(jié)果見表3。從表中可以看出，200 mg·L-1的Basta涂抹結(jié)果與前期PCR鑒定結(jié)果相一致，所以200 mg·L-1的Basta溶液葉片涂抹可用于大規(guī)模篩選含Bar基因的轉(zhuǎn)基因植株。

2.4 轉(zhuǎn)基因單拷貝插入的T0∶1株系目標基因的遺傳分析

結(jié)合PCR檢測與Basta葉片涂抹法的鑒定結(jié)果，統(tǒng)計出各T0∶1代株系所對應的T1代陽性植株與陰性植株的數(shù)量，其結(jié)果見表4。從表4中可以看出，目標基因是可遺傳。

2.5 T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株目標基因的表達量

T1代陽性植株和野生型JW1開花前胚珠總RNA的RT-PCR分析結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，與野生型JW1相比，各轉(zhuǎn)基陽植株目標基因 TaCYP78A5表達量都極顯著增加，且各植株間表達水平存在一定的差異，T1A5-2-8、T1A5-13-2、T1A5-13-9和T1A5-15-7表達量相對較高，而T1A5-1-4和T1A5-15-13表達量相對較低。

+：陽性； -：陰性。

+:Positive; -:Negative.

2.6 T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株的籽粒大小

各個陽性植株主穗中部籽粒粒寬、粒長、粒厚和粒重的統(tǒng)計結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，與野生型相比，各轉(zhuǎn)基因陽性植株的粒寬、粒重和粒厚均有所增加。在粒寬方面，除T1A5-13-2外，其他植株均極顯著增加；在粒長方面，除T1A5-1-4極顯著增加外，其他植株變化不明顯；在粒厚方面，T1A5-1-4、T1A5-13-2和T1A5-15-7極顯著增加，T1A5-13-9和T1A5-29-9顯著增加，其余植株變化不明顯；在粒重方面，所有植株都極顯著增加。說明 TaCYP78A5基因在小麥中過表達能夠增加小麥的籽粒大小，從而增加粒重。

3 討 論

外源基因整合在轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)是影響外源基因穩(wěn)定性遺傳和表達水平的一個重要因素。轉(zhuǎn)基因植株中以單拷貝形式整合到基因組中的外源基因具有穩(wěn)定遺傳和較好的表達特性[16-17]，而多拷貝則更容易導致外源基因的沉默[18]。因此，通過外源基因拷貝數(shù)測定，獲得低拷貝數(shù)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系對于植物遺傳改良有非常重要作用。檢測外源基因拷貝數(shù)的方法主要有Southern blot和熒光定量PCR，Southern blot所需樣品DNA量大、耗時、費力以及使用放射性同位素等缺點[19]；熒光定量PCR快速靈敏，檢測結(jié)果也與Southern blot相一致，所以應用起來較為方便[15]。本研究對小麥 TaCYP78A5過表達T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株利用TaqMan探針法進行了拷貝數(shù)檢測，14個植株中共有6個單拷貝植株，5個雙拷貝植株，其余3個植株在3拷貝以上，這與Zhang等[20]報道的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化中外源基因主要以單拷貝形式整合到基因組中相一致。

表4 T0∶1代轉(zhuǎn)基因株系目標基因的遺傳分析Table 4 Genetic analysis of target genes in T0∶1 transgenic lines

**：P<0.01.

E和F中標尺為5 mm。 *:P<0.05; **:P<0.01; Scale bars are 5 mm in E and F.

在大規(guī)模轉(zhuǎn)基因后代植株檢測時，傳統(tǒng)PCR步驟繁雜、結(jié)果不穩(wěn)定，而Bar試紙條成本較高，即兩種方法均存在一定的局限性。Sato等[21]對大豆轉(zhuǎn)基因植株葉片涂抹Liberty除草劑所得到的結(jié)果與后期PCR和Southern blot結(jié)果相一致。李 欣等[22]使用葉片涂抹和植株噴灑對含Bar基因的轉(zhuǎn)基因小麥進行鑒定，結(jié)果表明，200 mg·L-1的Liberty涂抹葉片法比PCR結(jié)果更精確，而植株噴灑Basta最適濃度為100 mg·L-1，Liberty最適濃度為150 mg·L-1。Basta溶液涂抹葉片成本低且效率高，不同轉(zhuǎn)基因受體品種對Basta溶液的耐受性不同，因此本研究對小麥JW1轉(zhuǎn)基因陽性植株的最適Basta濃度進行了摸索，結(jié)果表明，在拔節(jié)期涂抹200 mg·L-1的Basta溶液能夠有效地篩選出陽性植株。

細胞色素P450在植物生長發(fā)育進程中發(fā)揮著相當重要的作用，其中， CYP78A是植物細胞色素P450家族中特有的一類[23]。近年來， CYP78A家族中一些成員都已被證實與植物生殖器官的發(fā)育有著密切的關(guān)系，如，擬南芥中的 CYP78A5、 CYP78A6、 CYP78A8和 CYP78A9[24]，水稻中的 CYP78A13[11]，大豆中的 CYP78A10和 CYP78A72[8,25]，麻風樹中的 CYP78A98[26]，以及小麥中的 TaCYP78A3和 TaCYP78A5[5,9]。在擬南芥中，Adamski等[10]通過采用pKLU::vYFPer報告株系發(fā)現(xiàn)， KLUH/CYP78A5在胚珠發(fā)育時的內(nèi)珠被中表達，并且KLU能促進胚珠中珠被細胞的增殖，進而來控制種子的大小。Xu等[4]通過水稻 CYP78A13突變體證實了該基因過表達導致籽粒增大。Zhao等[8]將 CYP78A72基因在擬南芥及大豆中過表達導致擬南芥和大豆種子均增大。Tian等[26]從麻風樹中克隆出 CYP78A98基因，構(gòu)建pINO:: JcCYP78A98過表達載體轉(zhuǎn)化煙草， CYP78A98基因過表達使煙草籽粒大小和粒重增加，并且還提高了種子蛋白和脂肪酸的含量。Ma[5]等利用3種啟動子(Camv35S、pINO和pKLU)啟動 TaCYP78A5基因在擬南芥中過表達，結(jié)果顯示， TaCYP78A5基因通過促進胚表皮細胞增殖來影響胚的發(fā)育，其表達量的高低影響著器官和種子的發(fā)育，過表達可導致擬南芥種子增大，初步證實小麥 TaCYP78A5基因正調(diào)控種子生長。本研究對 TaCYP78A5基因過表達轉(zhuǎn)基因植株進行了鑒定分析，并統(tǒng)計了7個T1代陽性植株的籽粒大小和粒重，在粒寬、粒厚和粒重方面，陽性植株與野生型相比均增大，而在粒長方面，T1A5-13-9和T1A5-24-92與野生型相比變小，其余植株均增大?？傮w來說， TaCYP78A5基因在小麥中過表達能夠增加小麥的籽粒大小并顯著提高粒重，這為后期的小麥高產(chǎn)育種提供了科學依據(jù)。本研究材料為雜合株系，后期仍需要對轉(zhuǎn)基因后代進行追蹤檢測以期獲得轉(zhuǎn)基因純合株系，并能夠?qū)υ摶虻墓δ苓M行深入研究。

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Genetic and Functional Analysis of Transgenic Wheat Overexpressing TaCYP78A5 Gene

CHEN Zhiren1,MA Meng1,SHEN Yuxia1,WU Linnan1,LIU Xiangli1,2,ZHAO Huixian1,2

(1.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.State Key Labaratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

In order to verify the function of TaCYP78A5 gene,which is associated with wheat (TriticumaestivumL.) grain size in the process of wheat grain development,the transgenic wheat lines with the TaCYP78A5 gene overexpression under the controlling of pINO promoter were used as materials. The copy number of target gene in T0generation transgenic plants was detected.The expression of the target gene of seven T1positive plants was tested and the grain size were measured. The results showed that out of 21 regenerated seedlings,14 positive plants were obtained by combining Bar strip test and PCR detection. The results of copy number detection showed that two and one transgenic plants had three and seven copies of target gene,respectively,and the rest eleven transgenic plants each had a copy number of 1 or 2,among which there were six single copy plants.Compared with the wild type JW1,the expression levels of the target gene in seven T1positive plants were significantly increased,the grain width and grain thickness were increased by different rates,and the grain weight were significantly increased.

Wheat; TaCYP78A5 gene;Bargene; Transgenic lines

10.7606/j.issn.1009-1041.2017.06.02

時間：2017-06-07

2017-01-16

2017-04-18

國家自然科學基金項目(31471482，31101205);西北農(nóng)林科技大學基本科研業(yè)務費專項(Z109021565，Z109021568)

E-mail：chenzhiren0405@163.com

劉香利(E-mail:liuxianglii@163.com)；趙惠賢(E-mail:hxzhao212@nwafu.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)06-0721-09

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170607.1004.004.html