大連“7·16”溢油事故后5年間烴的降解與細(xì)菌豐度變化研究

郭立梅，蘇潔，明紅霞，季鳳云，常永凱，石巖，

姚子偉1，馬悅欣2，關(guān)道明1，樊景鳳1

（1.國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023）

大連“7·16”溢油事故后5年間烴的降解與細(xì)菌豐度變化研究

郭立梅1，2，蘇潔1，明紅霞1，季鳳云1，2，常永凱1，2，石巖1，2，

姚子偉1，馬悅欣2，關(guān)道明1，樊景鳳1

（1.國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023）

為了解大連新港7.16溢油事故發(fā)生后5年間大連灣受污染海區(qū)生態(tài)恢復(fù)程度，同時(shí)探究大連灣表層海水和沉積物中微生物對(duì)石油污染的長(zhǎng)期響應(yīng)策略，對(duì)大連灣表層海水和沉積物中石油烴含量的分布、異養(yǎng)細(xì)菌和石油烴降解菌豐度的年度變化特征，以及細(xì)菌豐度與環(huán)境因子間相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，溢油事故發(fā)生后2年間，大連灣表層海水中石油烴含量由溢油初期2010年9月的0.22～0.67 mg/L降到0.0025～0.05 mg/L（2012年5月），海水質(zhì)量也由三類海水轉(zhuǎn)變?yōu)橐活惡Ｋ?；沿岸站位BQ012表層沉積物中石油烴含量也由2011年12月的7 133 μg/g降低到2014年的926 μg/g，其表層沉積物質(zhì)量也由三類轉(zhuǎn)變?yōu)橐活惓练e物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。溢油后2個(gè)月內(nèi)表層海水中異養(yǎng)細(xì)菌及石油烴降解菌豐度升高至105CFU/mL和104CFU/mL，隨著時(shí)間推移各站位細(xì)菌豐度基本呈下降趨勢(shì)，5年后細(xì)菌豐度回落了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)并恢復(fù)到溢油前的歷史水平。表層沉積物中石油烴降解菌豐度由溢油后2個(gè)月的105CFU/g降低到2013年的102CFU/g。石油烴降解菌與異養(yǎng)細(xì)菌的比值（HDB/HB）與石油烴含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），而與營(yíng)養(yǎng)鹽和溶解氧等主要環(huán)境因子相關(guān)性不大，因此認(rèn)為其可作為海水中石油烴類污染評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

7.16大連港溢油；異養(yǎng)細(xì)菌；石油烴降解菌；細(xì)菌豐度

海洋溢油事故的頻繁發(fā)生，嚴(yán)重污染了海洋環(huán)境，給海洋生態(tài)平衡帶來了極大的危害。例如，2010年的墨西哥灣溢油，被美國(guó)稱為生態(tài)的“911”。而2010年7月16日中國(guó)大連新港溢油成為近年來中國(guó)海洋最嚴(yán)重的溢油事故，有超過1 500 t的原油泄漏入海，造成周邊183 km2海域受到不同程度的影響（國(guó)家海洋局，2011），導(dǎo)致包括大連灣在內(nèi)的局部海域受到嚴(yán)重污染。這次事故將會(huì)像歷次溢油事故一樣，對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生長(zhǎng)期負(fù)面影響，其危害可能長(zhǎng)達(dá)十幾年甚至幾十年。許多研究表明，石油降解產(chǎn)物的潛在毒性不僅會(huì)產(chǎn)生生物積累效應(yīng)，還會(huì)引起海洋環(huán)境中生物多樣性降低、微生物活性下降等連鎖性的生態(tài)學(xué)問題，其生態(tài)危害性已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注（Margesin et al，2007；Cai et al，2013；王修林等，2004）。

海洋環(huán)境中的細(xì)菌不僅是能量代謝、物質(zhì)循環(huán)的主要成員之一，而且在污染物的轉(zhuǎn)化降解中起著重要作用（陳忠元等，1991；李金成等，2007）。國(guó)外學(xué)者從20世紀(jì)30年代起，已經(jīng)對(duì)海水中細(xì)菌的數(shù)量和分布、時(shí)空變化以及生態(tài)功能等進(jìn)行了許多研究。Atlas（1981）曾報(bào)道，降解石油烴類的微生物一般僅占微生物群落總數(shù)的不到1%，而當(dāng)有石油污染物存在時(shí)，降解烴類的微生物的比例增加到10%。2010年墨西哥灣溢油發(fā)生后，Kostka等（2011）通過分子技術(shù)檢測(cè)了墨西哥灣北部的美國(guó)佛羅里達(dá)州Pensacola海灘生態(tài)系統(tǒng)中土著微生物對(duì)石油污染的響應(yīng)情況，結(jié)果表明受石油污染的海灘砂中的細(xì)菌SSU rRNA基因豐度比未受污染海灘砂高出近10倍，可培養(yǎng)石油烴降解菌數(shù)量高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。高小玉等（2013）對(duì)大連新港“7.16”事故發(fā)生后1年的石油烴降解菌和異養(yǎng)細(xì)菌豐度的研究表明，溢油發(fā)生后石油烴降解菌和異養(yǎng)細(xì)菌豐度顯著增加，并于1 a后回落1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。細(xì)菌的豐度是各理化因子和生物因子綜合作用的結(jié)果，其多少直接或間接影響著物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，因此細(xì)菌豐度的測(cè)定對(duì)深入了解海洋環(huán)境中石油烴含量的變化和海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化具重要作用。然而目前鮮少有研究對(duì)于受石油污染地區(qū)開展長(zhǎng)期連續(xù)地細(xì)菌豐度監(jiān)測(cè)。

因此，為探索大連新港溢油事故發(fā)生后污染海區(qū)自然凈化過程的規(guī)律，本研究選擇溢油事故影響海域大連灣為研究海區(qū)，展開對(duì)其長(zhǎng)達(dá)5年的石油烴含量、石油烴降解菌及異養(yǎng)細(xì)菌豐度跟蹤調(diào)查研究，進(jìn)而分析表層海水和沉積物中石油烴降解菌及異養(yǎng)細(xì)菌的生態(tài)分布及其與環(huán)境因子（石油烴、氮、磷、溶解氧、化學(xué)需氧量）的相關(guān)性。以期了解石油污染后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)菌生態(tài)學(xué)的影響，揭示石油烴降解菌對(duì)石油污染的長(zhǎng)期響應(yīng)策略，探索指征海區(qū)石油污染程度的微生物學(xué)指標(biāo)，這對(duì)于評(píng)價(jià)石油污染對(duì)微生物生態(tài)的影響及溢油后生態(tài)恢復(fù)程度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 站位設(shè)置和樣品采集

本研究5年間共采集了10個(gè)航次樣品，時(shí)間分別為2010年8月、2010年9月、2011年4月、2011年7月、2011年12月、2012年5月、2012年8月、2012年11月、2013年7月和2014年7月；每個(gè)航次包括5個(gè)站位的表層海水和沉積物樣品，采集站位為BQ001（121.755°E，38.975°N）、BQ003（121.673°E，38.947°N）、BQ004（121.750°E，38.935°N）、BQ007（121.720°E，38.956°N）和BQ012（121.684°E，38.984°N）。其中BQ012和BQ003站位離岸邊較近，BQ001和BQ003位于灣中，BQ004位于灣口離溢油點(diǎn)較近。表層海水樣品通過卡蓋式采水器采集并收集到無菌采樣瓶，表層沉積物樣品通過箱式采泥器采集并收集到無菌采樣袋。所有樣品置冷藏箱中（4℃左右）保存，并于24 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析。具體的見圖1所示。

圖1 調(diào)查海區(qū)及采樣站位

1.2 石油烴和環(huán)境因子的測(cè)定

海水、沉積物中石油烴含量（total petroleum hydrocarbons，TPHs）采用紫外分光光度法測(cè)定分析；海水中活性磷酸鹽（PO4-P）、氨-氮（NH3-N）、硝酸鹽-氮（NO3-N）、亞硝酸鹽-氮（NO2-N）均采用分光光度計(jì)法分析；溶解氧（DO）采用碘量法分析；化學(xué)需氧量（COD）采用堿性高錳酸鉀法分析；上述指標(biāo)的測(cè)定均參照海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范（GB 17378.4-2007）第4部分：海水分析進(jìn)行。

1.3 石油烴降解菌及異養(yǎng)細(xì)菌豐度檢測(cè)

1.3.1 試劑和培養(yǎng)基

試劑：本實(shí)驗(yàn)所使用的20#重柴油購(gòu)自中石化加油站。異養(yǎng)細(xì)菌豐度檢測(cè)采用Zobell 2216E培養(yǎng)基（丁美麗，1979）；石油烴降解菌豐度檢測(cè)采用柴油無機(jī)鹽平板培養(yǎng)基（高小玉等，2013；Zhou et al，2008）。

1.3.2 細(xì)菌豐度檢測(cè)

異養(yǎng)細(xì)菌豐度檢測(cè)方法依據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB17378.7-2007）中的平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行；海水和沉積物中可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌及石油烴降解菌的豐度測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法。選取適當(dāng)稀釋度的稀釋樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，分別于25℃和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0和CANOCO 5.0軟件對(duì)細(xì)菌豐度、石油烴含量及營(yíng)養(yǎng)鹽（PO4-P，NH3-N，NO3-N，NO2-N）、DO、COD等主要環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油烴含量年度變化特征

2.1.1 表層海水

大連灣表層海水中石油烴含量年度變化如圖2所示，其濃度變化范圍為0.002 5～0.665 mg/L，特別是在2010年9月各個(gè)站位的石油烴含量均處在較高的水平（0.22～0.67 mg/L）。隨時(shí)間變化，各站位石油烴含量均逐漸降低，到2012年5月降到較低的水平（0.002 5～0.05 mg/L）。在空間分布上，離海岸較近的BQ003和BQ012兩個(gè)站位石油烴含量相對(duì)較高，而位于灣口附近的BQ004站位石油烴含量相對(duì)較低（如圖2）。

大連灣附近海域的流場(chǎng)主要是正規(guī)半日潮流，且屬于往復(fù)流，夏季多南風(fēng)，加之2010年7月16日大連新港溢油事故發(fā)生后幾日風(fēng)力強(qiáng)勁，洋流運(yùn)動(dòng)較平時(shí)相比幅度更大，海面油膜主要朝東北方向移動(dòng)，之后，油膜繼續(xù)在做往復(fù)運(yùn)動(dòng)（徐淑波，2007）。從而導(dǎo)致溢油后短期內(nèi)位于大連灣南側(cè)污染較輕，所受影響較小，隨著洋流的往復(fù)運(yùn)動(dòng)使石油污染進(jìn)入大連灣內(nèi)及其南側(cè)海域，致使大連灣調(diào)查海域海水石油烴含量急劇增加。于2010年9月石油烴含量達(dá)到峰值（平均0.325 mg/L）明顯高于第二、三類海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB3097-1997）；而后隨時(shí)間的推移，受自然因素及微生物影響海水中石油烴含量逐漸降低，到2012年開始均達(dá)到第一類海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（≤0.05 mg/L）。同時(shí)由于受到大連灣沿岸大連港、造船石油化工、鋼鐵等工業(yè)企業(yè)和7.16大連新港溢油事故影響，導(dǎo)致沿岸站位石油烴含量較高。

圖2 大連灣表層海水中石油烴含量年度變化

圖3 表層沉積物中石油烴含量年度變化

2.1.2 表層沉積物

泄露的石油在經(jīng)過蒸發(fā)、光化學(xué)作用、微生物分解等一系列物理、化學(xué)及生物反應(yīng)過程后，仍有大部分的石油烴以溶解組分或相應(yīng)的降解組分存在于海洋中，且有相當(dāng)部分通過吸附、絮凝和沉降作用進(jìn)入沉積物，使之成為石油烴的“匯”（吳玲玲等，2012；張銀生等，2012）。沉積物中的石油烴類直接影響生活在沉積物中的底棲微生物的生物活動(dòng)，因此本文研究了沉積物中石油烴含量的變化特征。離岸較近的BQ012站位石油烴含量顯著高于其它站位，其范圍為578～7133μg/g。其它站位5年間表層沉積物中石油烴含量變化范圍為48.3～785 μg/g，在2011時(shí)其石油烴含量相對(duì)較低（48.3～519 μg/g），2013-2014年又增加到203～785 μg/g（如圖3）。這可能由于石油烴的絮凝和沉降作用使其在沉積物中不斷累積，而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。石油烴含量由沿岸到離岸方向呈逐漸降低的分布趨勢(shì)，離岸較遠(yuǎn)的站位在溢油發(fā)生后1個(gè)月（2010年8月）石油烴含量較高（230～485 μg/g）。

結(jié)果顯示，溢油發(fā)生后一年間（2010-2011年）大連灣海區(qū)表層沉積物中石油烴含量（670～1 666 μg/g）明顯超過國(guó)家第一類海洋沉積物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求（≤500 μg/g）（GB 18668-2002），離岸較近的BQ012站位超過國(guó)家第二類海洋沉積物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求（≤1 000 μg/g），相較于珠江口（吳玲玲等，2012）、長(zhǎng)江口（李磊等，2014）、大遼河（郭偉等，2007）水域其石油烴污染較為嚴(yán)重。而隨時(shí)間推移，截止到2014年沿岸站位BQ012由第三類海洋沉積物轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙惡Ｑ蟪练e物，其它站位也由第二類海洋沉積物轉(zhuǎn)變?yōu)榈谝活惡Ｑ蟪练e物。

2.2 大連灣溢油海區(qū)細(xì)菌豐度年度變化特征

2.2.1 表層海水中石油烴降解菌與異養(yǎng)細(xì)菌豐度年度變化特征

溢油事故發(fā)生后5 a間大連灣表層海水中石油烴降解菌（Hydrocarbon-Degrading Bacteria，HDB）和異養(yǎng)細(xì)菌（Heterotrophic bacteria，HB）分布如圖4所示。2010年9月位于灣中的BQ001和BQ007站位異養(yǎng)細(xì)菌表現(xiàn)出較高的豐度，顯著高出其它站位1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而在2011年7月后離海岸較近的BQ012、BQ003站位異養(yǎng)細(xì)菌豐度較高。在2010年9月和2012年5月、8月時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌具有較高的豐度，最高時(shí)可達(dá)2.65×105CFU/mL，最低值出現(xiàn)在2011年4月0.44～2.19×102CFU/mL。到2013和2014年細(xì)菌豐度相比于溢油發(fā)生初期降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)（如圖4（a））。各站位石油烴降解菌豐度最大值均出現(xiàn)在2010年9月（數(shù)量范圍為1.01～5.72×104CFU/mL），到2012年5月石油烴降解菌豐度降到較低水平（數(shù)量范圍為3.3～116.2 CFU/mL）接近大連新港溢油事故前歷史數(shù)據(jù)（1.02～1.5×105CFU/L）（李元等，1987）。石油烴降解菌在空間分布上的特征：在溢油發(fā)生半年間（2010年8月～2011年4月）離灣口較近的BQ004站位石油烴降解菌豐度相對(duì)較高，為1.35～5.72×104CFU/mL；到2012-2014年其相對(duì)豐度降低，而離海岸較近的BQ012、BQ003站位其豐度占有相對(duì)較高的比例。

圖4 大連灣表層海水及沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌和石油烴降解菌豐度年度變化特征（以10為底的對(duì)數(shù)值）

結(jié)果表明，溢油發(fā)生后大連灣海區(qū)異養(yǎng)細(xì)菌豐度的年度變化趨勢(shì)明顯，最高相差4個(gè)數(shù)量級(jí)。在2011年4月時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌豐度較低的原因可能是一定程度上受季節(jié)變化的影響。有研究表明溫度影響石油烴在環(huán)境中的狀態(tài)，水溶態(tài)的石油烴更容易被微生物細(xì)胞接觸降解，同時(shí)溫度還影響微生物的種群和酶活性（Nedwell et al，1999）。溢油發(fā)生初期異養(yǎng)細(xì)菌豐度與杭州灣（焦俊鵬等，2000）及深圳海域（李和陽等，2011）歷史數(shù)據(jù)相比高出約1～3個(gè)數(shù)量級(jí)，可知大連灣海區(qū)受污染程度相對(duì)較高。由于7.16溢油事故影響，石油的輸入為細(xì)菌提供碳源，導(dǎo)致處于灣口附近的BQ004站位細(xì)菌迅速增長(zhǎng)，隨著石油烴含量的降低細(xì)菌豐度有所降低；BQ012、BQ003站位由于受海岸大連港、造船石油化工、鋼鐵等工業(yè)企業(yè)污染的影響，在7.16溢油事故影響降低時(shí)，其細(xì)菌豐度依然呈現(xiàn)較高的狀態(tài)。史君賢等（1992）的研究結(jié)果表明，石油烴的降解速度與水體中細(xì)菌數(shù)量有關(guān)，當(dāng)水體中細(xì)菌數(shù)量超過104～105CFU/L時(shí)可加速石油烴的降解速率?？梢娫摵^(qū)石油烴降解速度較高，另一方面也反映了該海區(qū)具有較強(qiáng)的自然凈化能力。本研究結(jié)果顯示，在海水石油烴含量較高時(shí)石油烴降解菌豐度也相對(duì)較高，表層海水中石油烴降解菌豐度與石油烴含量變化趨勢(shì)基本一致。

2.2.2 表層沉積物中石油烴降解菌與異養(yǎng)細(xì)菌豐度年度變化特征

大連灣表層沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌豐度變化如圖4（c）所示，5 a間大連灣表層沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌豐度均呈先降低后上升的趨勢(shì)，在2010年9月達(dá)到最大值（0.43～5.6×107CFU/g），其最低值出現(xiàn)在2012年5月（0.51～1.62×104CFU/g），其變化趨勢(shì)與表層海水中趨勢(shì)顯著不同。在空間分布上，在離岸較近的站位（BQ012和BQ003）異養(yǎng)細(xì)菌豐度相對(duì)較高，而離岸相對(duì)較遠(yuǎn)的站位（BQ004）豐度相對(duì)較低?？赡苡捎贐Q004站位位于灣口水體交換較灣內(nèi)好，油含量及營(yíng)養(yǎng)鹽含量較低，而近岸海域長(zhǎng)年受到陸源污染物的影響，為異養(yǎng)細(xì)菌提供了豐富的有機(jī)和無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，從而促進(jìn)其快速生長(zhǎng)。

石油烴降解菌在2010年9月和2012年5月時(shí)豐度較高，在溢油發(fā)生2個(gè)月后（2010年9月），位于灣口離溢油點(diǎn)相對(duì)較近的站位（BQ004）石油烴降解菌豐度相對(duì)較高，可達(dá)7.61×105CFU/g，高出近岸站位1個(gè)數(shù)量級(jí)；灣中央的站位（BQ001）豐度較低；溢油發(fā)生3 a后（2013年和2014年）BQ004站位石油烴降解菌豐度相對(duì)較低（0.3～10.1×102CFU/g）。而石油烴含量顯著較高的BQ012站位，其石油烴降解菌豐度相較其它站位約低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)（如圖4（d））?？赡苁怯捎诟邼舛鹊囊缬臀廴緦?duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。結(jié)果顯示，表層沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌和石油烴降解菌豐度均顯著高于表層海水，分別高出約2～3和1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

本文研究結(jié)果顯示，在溢油發(fā)生之初（2010年），石油烴類污染物的增加為微生物提供生長(zhǎng)所需的碳源，從而促進(jìn)了細(xì)菌的富集，而隨著石油烴污染物的沉降、累積，使石油烴含量過高而制約微生物的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致細(xì)菌豐度相對(duì)降低；隨著沉積物中石油烴含量的降低細(xì)菌豐度開始增加。王金成等（2012）、李艷艷等（2013）的研究，亦有相同的結(jié)論，即水體或土壤中含有一定濃度的污染油可以很快富集降解菌，但當(dāng)石油污染濃度超過一定限值時(shí)，生物降解將會(huì)趨緩甚至停止。Margesin等（1999）研究表明土壤中石油烴含量高于500 mg/kg時(shí)，會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒性作用，從而抑制石油降解菌的生長(zhǎng)。Forsyth等（1995）研究表明，在土壤中內(nèi)源性烴降解菌數(shù)量大于106CFU/g時(shí)，石油類污染物的降解速率會(huì)較快。由此，在溢油發(fā)生之初（2010年）大連灣海區(qū)表層沉積物中石油烴的降解速率較快，隨著石油烴的積累其降解速率降低。同時(shí)相較于表層海水，2011-2012年間表層沉積物中石油烴降解菌豐度仍然處于較高水平，溢油污染對(duì)其的影響更為深遠(yuǎn)。

2.3 石油烴降解菌與異養(yǎng)細(xì)菌豐度比值的年度變化特征

石油烴降解菌（HDB）與異養(yǎng)細(xì)菌（HB）豐度之間的比值（HDB/HB）被認(rèn)為是水域油污程度的一個(gè)重要指標(biāo)。大連新港溢油發(fā)生后5 a間，大連灣表層海水中HDB/HB值變化如圖5（a），HDB/HB值均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。在溢油事故發(fā)生初期（2010年），石油烴含量較高，HDB/ HB值亦較高；溢油事故發(fā)生2 a后（2012年5月），石油烴含量降為最低值，HDB/HB值也達(dá)最低值，因此我們推斷HDB/HB值有可能在一定程度上反映海水中石油烴污染的狀況。表層沉積物中HDB/HB值與TPHs含量變化均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，這與表層海水中變化趨勢(shì)相反。而且溢油事故發(fā)生2 a后（2012年5月）表層沉積物中HDB/HB值達(dá)到最大（圖5（b））。本文結(jié)果顯示，表層沉積物中HDB/HB值變化與石油烴含量變化趨勢(shì)不同，因此HDB/HB比值不能很好地反映沉積物中石油烴污染的狀況。

圖5 表層海水及沉積物中石油烴降解菌與異養(yǎng)細(xì)菌豐度比值的時(shí)空變化

數(shù)據(jù)還表明，表層海水中HDB/HB值與TPHs含量變化趨勢(shì)較一致，因此，HDB/HB值可能更能反映海水中石油烴類污染水平。然而，2010年9月各站位表層海水中石油烴含量均顯著高于2013年7月（圖2），其比值卻相差不大，分析其可能的原因，一是石油烴含量過高時(shí)會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒性作用，抑制微生物的生長(zhǎng)，不利于污染物的降解；二是石油烴污染刺激微生物的增長(zhǎng)繁殖進(jìn)而大量的消耗環(huán)境中的N、P等無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽，使其C∶N∶P＞120∶10∶1，從而出現(xiàn)上述情況。李輝等（2013）對(duì)遼河口潮間帶研究結(jié)果顯示，較大濃度的石油會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用，而隨著石油污染的降低，石油對(duì)細(xì)菌的毒性作用減弱，細(xì)菌的豐度又有所上升。劉金屏等（1986）的研究表明環(huán)境中生物可利用的C∶N∶P在120∶10∶1時(shí)有利于環(huán)境中微生物對(duì)石油污染物的降解，當(dāng)環(huán)境中石油烴含量的增高接近于C∶N∶P=120∶10∶1時(shí)，可刺激石油降解菌數(shù)量的增多從而促進(jìn)石油污染物的降解。李曉樓等（2014）的模擬實(shí)驗(yàn)表明按適當(dāng)比例向土壤中添加氮源和磷源，土壤中石油烴降解率得到大幅度提高，可達(dá)73.4%，相較于對(duì)照組高出62.4%。另外，自2012年5月后的石油烴濃度相比于2012年5月有一定程度的上升（約2～10倍），這一石油烴濃度可能有助于石油烴降解菌（HDB）的增長(zhǎng)。王金城等（2012）研究發(fā)現(xiàn)土著石油降解菌在生長(zhǎng)的同時(shí)大量消耗了環(huán)境中原有的N，P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而可能影響異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)其的利用而導(dǎo)致異養(yǎng)細(xì)菌（HB）數(shù)量的降低，這可能解釋了HDB/HB比值在2012年5月后普遍升高的現(xiàn)象。

2.4 表層海水中石油烴降解菌及異養(yǎng)細(xì)菌豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性

表層海水中石油烴降解菌、異養(yǎng)細(xì)菌豐度及其比值與環(huán)境因子的冗余度分析（RDA，CANOCO 5.0）如圖6，結(jié)合SPSS 17.0軟件分析多變量間兩兩相關(guān)性分析，結(jié)果表明：HB與TPHs含量呈正相關(guān)（R=0.152，P＞0.05），HDB與TPHs含量呈顯著正相關(guān)（R=0.345，P＜0.05），HB與HDB呈極顯著正相關(guān)（R=0.466，P＜0.01），HDB/HB值與TPHs含量呈極顯著相關(guān)（R=0.421，P＜0.01），HB和HDB與PO4-P，NH3-N，NO3-N，NO2-N、DO、COD等主要環(huán)境因子沒有顯著的相關(guān)性。

已知，環(huán)境中石油烴降解菌豐度與石油烴含量密切相關(guān)，異養(yǎng)細(xì)菌反映環(huán)境中異養(yǎng)型細(xì)菌的污染程度，也間接反映一般營(yíng)養(yǎng)性有機(jī)污染物的污染程度。HDB/HB值與TPHs含量呈極顯著相關(guān)，這說明相較于細(xì)菌豐度，HDB/HB值可更好的反映海水中TPHs的污染程度，此值愈高，則說明含油量愈高，陳忠元等（1991）、史君賢等（1996）、丁美麗等（1978）研究亦得出相似的結(jié)論。

異養(yǎng)細(xì)菌、石油烴降解菌及其比值均與DO、COD呈負(fù)相關(guān)且相關(guān)性不明顯，與NH3-N、NO2-N、NO3-N、PO4-P的相關(guān)性不明顯，可能由于大連灣為一半封閉性內(nèi)灣，由于人口密集、工業(yè)發(fā)達(dá)，大量污水排放進(jìn)入大連灣內(nèi)，導(dǎo)致大連灣海域富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)十分充足（馬嘉蕊等，1990）。從而排除了氮、磷及溶解氧等因素對(duì)細(xì)菌豐度變化影響，TPHs污染成為影響石油烴降解菌豐度變化的主要因素，這與許多國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相同（Dubinsky et al，2013；Lamendella et al，2014）。大多學(xué)者認(rèn)為可用HDB/HB值來作為環(huán)境中石油烴類污染水平的指標(biāo)，但本研究結(jié)果表明HDB/HB值不適用于反映大連灣海域沉積物中石油烴類污染水平，而能較好反映表層海水中石油烴類污染水平。然而HDB/HB值能否準(zhǔn)確反映TPHs污染程度還有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。由于石油烴降解菌的生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)極為復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其豐度的分布狀況是由環(huán)境中許多因子共同影響的結(jié)果，而不是簡(jiǎn)單的單因子相關(guān)性就能描述的。

圖6 冗余度（RDA）分析環(huán)境因子與細(xì)菌豐度的相關(guān)性

通過對(duì)7.16大連新港溢油事故污染海區(qū)連續(xù)開展長(zhǎng)達(dá)5 a的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，表層海水質(zhì)量已由事故發(fā)生后的三類海水轉(zhuǎn)變?yōu)橐活惡Ｋ?、表層沉積物質(zhì)量也由二、三類沉積物轉(zhuǎn)變?yōu)橐活愘|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在溢油事故發(fā)生后2個(gè)月內(nèi)表層海水和沉積物中異養(yǎng)細(xì)菌及石油烴降解菌豐度均處在較高的水平，隨著時(shí)間段推移分別表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，2014年其相較于溢油后2個(gè)月均降低了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。通過HDB/HB值與石油烴含量變化的研究表明，該比值有望成為海水中石油烴類污染水平的一個(gè)重要指標(biāo)。接下來，溢油污染對(duì)細(xì)菌更深層次的影響還需要更進(jìn)一步的研究，如5 a內(nèi)細(xì)菌多樣性以及與石油烴降解相關(guān)的基因豐度及表達(dá)的變化。這將有利于深度了解石油烴對(duì)其影響的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于預(yù)測(cè)海洋環(huán)境中石油污染及環(huán)境恢復(fù)程度變化有一定幫助。

3 結(jié)論

（1）7·16大連新港溢油事故發(fā)生后5年間，大連灣表層海水及沉積物中石油烴含量基本呈下降趨勢(shì)，表層海水質(zhì)量已由事故發(fā)生后的三類海水轉(zhuǎn)變?yōu)橐活惡Ｋ?，表層沉積物質(zhì)量也由二、三類沉積物轉(zhuǎn)變?yōu)橐活愘|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；

（2）大連灣表層海水和沉積物中微生物對(duì)7.16大連新港溢油的響應(yīng)有明顯的差異，表層海水中細(xì)菌豐度對(duì)石油污染反應(yīng)迅速，在短期時(shí)間對(duì)污染作出響應(yīng)（石油烴降解菌在2012年5月回落3個(gè)數(shù)量級(jí)），而石油烴污染對(duì)沉積物中細(xì)菌的影響相對(duì)較遲緩，在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)沒有消失；表層海水中石油烴降解菌豐度均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，表層沉積物中石油烴降解菌在2012年5月時(shí)其豐度仍較高，到2013-2014年降到較低水平；

（3）大連灣表層海水中石油烴降解菌與異養(yǎng)細(xì)菌的比值與石油烴含量呈極顯著的正相關(guān)（R= 0.421，P＜0.01），可在一定程度上反映環(huán)境受油污染的狀況，同時(shí)其與營(yíng)養(yǎng)鹽和溶解氧等主要環(huán)境因子相關(guān)性不大，可以排除營(yíng)養(yǎng)鹽和溶解氧等對(duì)其的影響，因此建議用來作為評(píng)價(jià)海水中石油烴類污染的指標(biāo)。

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（本文編輯：袁澤軼）

Study on the petroleum hydrocarbon degradation and the change of bacterial abundance within 5 years after Dalian"7.16"oil spill accident

GUO Li-mei1,2,SU Jie1,MING Hong-xia1,JI Feng-yun1,CHANG Yong-kai1,2,SHI Yan1,2, YAO Zi-wei1,MA Yue-xin2,GUAN Dao-ming1,FAN Jing-feng1

（1.National Marine Environmental Monitoring Center,Dalian 116023,China;2.College of Aquaculture and Life,Ocean University of Dalian,Dalian 116023,China）

With the aim to study the long term response of marine microbiology to oil contamination,the annual change of petroleum hydrocarbon(TPH)concentration and bacterial abundance in seawater and sediment of Dalian bay were analyzed after oil spill accident.The TPH concentration in surface seawater reduced from 0.22～0.67 mg/L in September 2010 to 0.0025～0.05 mg/L in May 2012 with the seawater quality changing from the third to the first seawater quality standards.The TPH concentration in surface sediments collected along the coastal sites BQ012 reduced from 7 133 μg/g in December 2011 to 926 μg/g in 2014,indicating the sediments quality recovered to the first quality standards in 2014.The abundance ofheterotrophic bacteria and petroleum hydrocarbon degradation bacteria reached to 105CFU/mL and 104CFU/mL,respectively,within the two months of the accident.After 5 years,bacterial abundance decreased 1～2 magnitudes.The ratio of hydrocarbon degradation bacteria and heterotrophic bacteria(HDB/HB)in surface seawater is significantly correlated with petroleum hydrocarbon concentration(P＜0.01).There were no significant correlations between bacterial abundance and concentrations of nutrient salt and dissolved oxygen. Therefore,the value of HDB/HB is recommended to serve as an index of petroleum hydrocarbons pollution levels in the seawater environment.

Dalian“7·16”oil spill;heterotrophic bacteria;petroleum hydrocarbon degradation bacteria;bacterial abundance

P76

A

1001－6932（2017）03－0311－09

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.03.009

2015-12-15；

2016-03-30

蓬萊19-3油田事故對(duì)遼東灣海域生態(tài)環(huán)境后續(xù)影響監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201405007；201305030）；全球變化與海氣交互作用（GASI-03-01-02-05）。

郭立梅（1990-），碩士研究生，從事海洋微生物生態(tài)學(xué)研究。電子郵箱：glm900402@163.com。

樊景鳳，研究員。電子郵箱：jffan@nmemc.org.cn。