肝素抗凝治療監(jiān)測相關(guān)項目的性能驗證*

胡歡榮 李臣賓 周文賓 劉秀麗 彭明婷

肝素抗凝治療監(jiān)測相關(guān)項目的性能驗證*

胡歡榮 李臣賓 周文賓 劉秀麗 彭明婷

目的 對低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）抗-Ⅹa活性、抗凝血酶（antithrombin, AT）活性和活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）檢測系統(tǒng)的性能進行驗證。方法 參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）發(fā)布的多項指南、多項衛(wèi)生行業(yè)標準和試劑廠家的要求，對LMWH抗-Ⅹa活性檢測的批內(nèi)精密度、日間精密度、線性、準確度和檢出限，AT活性檢測的批內(nèi)精密度、日間精密度、線性和準確度，以及APTT檢測的批內(nèi)精密度、日間精密度和可比性進行驗證。結(jié)果 LMWH抗-Ⅹa活性檢測的批內(nèi)精密度分別為0.03抗-Ⅹa IU/ ml和0.05抗-Ⅹa IU/ml，日間精密度分別為0.04 抗-Ⅹa IU/ml和0.05 抗-Ⅹa IU/ml，線性范圍為0～1.83 抗-Ⅹa IU/ml，準確度百分偏差分別為4.3%和2.2%，檢出限驗證結(jié)果為0.05抗-Ⅹa IU/ml，均符合廠家要求。AT活性檢測的批內(nèi)精密度分別為2.0%和3.5%，日間精密度分別為2.7%和5.3%，線性范圍為0～139%，準確度百分偏差分別為0.9%、–1.4%和–2.7%，均符合廠家要求。APTT活性檢測的批內(nèi)精密度分別為0.5%和0.4%，日間精密度分別為3.4%和4.4%，可比性驗證結(jié)果符合行業(yè)標準的要求。結(jié)論 3個項目的性能能夠滿足廠家和行業(yè)標準的要求，性能驗證方法和指標的研究有助于臨床實驗室實施質(zhì)量改進。

肝素 實驗室監(jiān)測 抗-Ⅹa活性 抗凝血酶 性能驗證

使用普通肝素（unfractionated heparin，UFH）和低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）對患者進行抗凝治療時，臨床醫(yī)生常需要依靠實驗室檢測指標對抗凝治療的強度進行監(jiān)測。LMWH抗-Ⅹa活性、抗凝血酶（antithrombin，AT）活性和活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）是肝素抗凝治療監(jiān)測的相關(guān)項目，為保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性，本文參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南H57-A、H26-A2和EP17-A2[1-3]、衛(wèi)生行業(yè)標準（WS/T 408-2012和WS/T 406-2012）[4，5]及試劑生產(chǎn)廠家的要求，對其檢測性能進行驗證，為臨床實驗室開展相關(guān)工作提供參考。

材料與方法

1 儀器 STA-R Evolution全自動血凝儀（法國Stago公司）。

2 試劑 抗-Ⅹa活性測定試劑盒STA?-Liquid Anti-Ⅹa（批號113504）；LMWH校準品STA?-Multi Hep Calibrator（批號113897）；LMWH質(zhì)控品STA?-Quality HBPM/ LMWH（批號113064、114357和114896）；APTT檢測試劑STA?-PTTA（批號114631）；AT活性檢測試劑盒STA?-Stachrom? AT III（批號114915）；通用定標品STA?-Unicalibrator（批號114319）；凝血質(zhì)控品STA?-Coag Control（批號114746和114876）；氯化鈣STA?-CaCl20.025 mol/L（批號114628）；稀釋液STA?-Owren-Koller（批號114803）；特殊清洗液STA?-Desorb U（批號114647）；清洗液STA?-Cleaner Solution（批號201602）；以上試劑均為法國Stago公司生產(chǎn)。2016年全國凝血試驗室間質(zhì)評物（批號201611～201615和201621～201625）。

3 方法

3.1 批內(nèi)精密度：參考H57-A[1]、H26-A2[2]和試劑廠家的要求，使用LMWH抗-Ⅹa活性、AT活性和APTT檢測2個濃度水平質(zhì)控品（低濃度水平L和高濃度水平H，或正常濃度水平N和異常濃度水平P）各1支，分別連續(xù)重復(fù)檢測20次，計算檢測結(jié)果的均值、標準差（s）和變異系數(shù)（CV）。評價標準：按廠家的要求，LMWH抗-Ⅹa活性檢測的批內(nèi)精密度（s）應(yīng)≤0.10 抗-Ⅹa IU/ml；AT 活性檢測正常和異常濃度水平的批內(nèi)精密度（CV）應(yīng)分別≤3.0%和5.0%；APTT檢測的批內(nèi)精密度（CV）應(yīng)≤3.0%。

3.2 日間精密度：參考H57-A[1]、H26-A2[2]和試劑廠家的要求，使用LMWH抗-Ⅹa活性、AT活性和APTT檢測2個濃度水平質(zhì)控品（低濃度水平L和高濃度水平H，或正常濃度水平N和異常濃度水平P），分別于每周一和周四上午、下午各檢測2次，連續(xù)檢測1個月，分別計算檢測結(jié)果的均值、s和CV。評價標準：按廠家的要求，LMWH抗-Ⅹa活性檢測的日間精密度（s）應(yīng)≤0.10 抗-Ⅹa IU/ ml；AT 活性檢測正常和異常濃度水平的日間精密度（CV）應(yīng)分別≤10.0%和15.0%。APTT檢測的日間精密度（CV）應(yīng)≤5.0%。

3.3 線性：參考衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T 408-2012[4]的線性驗證方法，分別對LMWH抗-Ⅹa活性和AT活性檢測的線性進行驗證。對于LMWH抗-Ⅹa活性檢測，使用STA?-Multi Hep Calibrator高、中、低值LMWH校準品兩兩等比例混合配制5個濃度水平的樣本，每個樣本分別檢測2次；對于AT活性檢測，使用0.8 ml無菌注射用水復(fù)溶通用定標品STA?-Unicalibrator獲得高值樣本（H），將緩沖液STA?-Owren-Koller液作為低值樣本（L），按比例（4H、3H+1L、2H+2L、1H+3L和4L）配制5個濃度水平的樣本，每個樣本分別檢測2次。計算2次檢測結(jié)果的均值和每個濃度水平的理論值，將實測均值（Y軸）與理論值（X軸）進行線性回歸分析，并計算實測值與理論值的百分偏差。評價標準：斜率按WS/T 406-2012[5]的要求，應(yīng)在0.95～1.05范圍內(nèi)；相關(guān)系數(shù)（r）和偏差按廠家的要求，r2≥0.99，實測均值與理論值的百分偏差應(yīng)在±10.0%范圍內(nèi)。

3.4 準確度或可比性

3.4.1 LMWH抗-Ⅹa活性和AT活性檢測的準確度：參考衛(wèi)生行業(yè)標準（WS/T 406-2012）[5]和廠家的要求。對于LMWH抗-Ⅹa活性檢測，取STA?-Multi Hep Calibrator高、中值LMWH校準品各1支，分別檢測1次；對于AT活性檢測，取1支通用定標品STA?-Unicalibrator加入1 ml無菌注射用水復(fù)溶后，用STA?-Owren-Koller液按2∶3和1∶3稀釋配制3個濃度水平的樣本，每個樣本分別檢測1次。計算檢測結(jié)果與理論值的百分偏差，要求百分偏差應(yīng)在±10.0%范圍內(nèi)。

3.4.2 APTT檢測的可比性：由于APTT無校準品，本研究采用檢測質(zhì)評物的方式評價其檢測結(jié)果的可比性。分別檢測2016年全國凝血試驗室間質(zhì)評物（批號201611～201615和201621～201625）各1次，計算檢測結(jié)果與靶值（2016年全國室間質(zhì)評中該試劑組實驗室檢測結(jié)果的中位數(shù)）的偏差。評價標準：參考WS/T 406-2012[5]的要求，質(zhì)評物檢測結(jié)果在該組范圍內(nèi)（靶值±15%）的比例應(yīng)≥80%。

3.5 檢出限 ：參考CLSI EP17-A2[3]和廠家說明書的要求，對LMWH抗-Ⅹa活性的檢出限（limit of detection，LoD）進行驗證。選擇10位男性和10位女性自愿者，按照標準操作程序采集靜脈血液樣本，離心分離血漿，將血漿進行等比例混合后作為空白樣本。對空白樣本連續(xù)重復(fù)檢測30次，計算均值（和標準差（s），并根據(jù)公式“LoD=s”計算LoD；此外，計算檢測結(jié)果超出廠家聲稱LoD的比例。評價標準：①按廠家的要求，LoD≤0.10 抗-Ⅹa IU/ml；②按EP17-A2的要求，檢測結(jié)果超出廠家聲稱LoD的比例應(yīng)≤15%。

結(jié)果

1 批內(nèi)精密度 3個項目的批內(nèi)精密度驗證結(jié)果見表1，均符合要求。

2 日間精密度 3個項目的日間精密度驗證結(jié)果見表2，均符合要求。

3 線性 LMWH抗-Ⅹa活性檢測的線性驗證結(jié)果見表3，線性回歸方程為Y=1.05X+0.01，r2=1.00，符合斜率在0.95～1.05范圍內(nèi)、r2≥0.99的要求；除最低濃度水平外，其余4個濃度水平的偏差均在±10%的范圍內(nèi)，故可認為LMWH抗-Ⅹa活性在0～1.83 抗-Ⅹa IU/ml范圍內(nèi)線性良好。AT檢測的線性驗證結(jié)果見表4，線性回歸方程為Y=0.99X+0.99，r2= 1.00，符合斜率在0.95～1.05范圍內(nèi)、r2≥0.99的要求；除最低濃度水平外，其余4個濃度水平的偏差均在±10%的范圍內(nèi)，故可認為AT活性檢測在0～139%范圍內(nèi)線性良好。

4 LMWH抗-Ⅹa活性和AT活性檢測結(jié)果的準確度驗證結(jié)果見表5，各濃度水平實測值與理論值的百分偏差均在±10.0%的范圍內(nèi)，可認為2個項目的準確度均符合要求。

表1 LMWH抗-Ⅹa活性、AT活性和APTT檢測批內(nèi)精密度驗證結(jié)果

表2 LMWH抗-Ⅹa活性、AT活性和APTT檢測日間精密度驗證結(jié)果

表3 LMWH抗-Ⅹa活性檢測線性驗證結(jié)果

表4 AT活性檢測線性驗證結(jié)果

表5 LMWH抗-Ⅹa活性和AT活性檢測準確度驗證結(jié)果

表6 APTT檢測可比性驗證結(jié)果

5 APTT檢測結(jié)果的可比性 驗證結(jié)果見表6，各批號質(zhì)評物檢測結(jié)果均在允許范圍內(nèi)（靶值±15%），可比性符合要求。

6 檢出限 LMWH抗-Ⅹa活性LoD驗證檢測結(jié)果的均值為0.02 抗-Ⅹa IU/ml，標準差為0.01 抗-Ⅹa IU/ml，LoD=0.05 抗-Ⅹa IU/ml，小于廠家聲稱的LoD（0.10 抗-Ⅹa IU/ ml），所有檢測結(jié)果均小于廠家聲稱的LoD，LoD驗證結(jié)果符合要求。

討 論

UFH和LMWH是臨床常用的抗凝治療藥物，常用于預(yù)防和治療血栓性疾病如肺栓塞、深靜脈血栓、急性冠脈綜合征以及繼發(fā)于房顫的栓塞性腦卒中[6]。UFH因藥代動力學(xué)不穩(wěn)定、特異性結(jié)合力低等缺點，為了優(yōu)化療效、降低藥物的副作用，目前主要使用APTT進行監(jiān)測[7，8]。雖然一般情況下認為不需要監(jiān)測LMWH，但目前多數(shù)指南和文獻認為特定患者如老年、肥胖、孕婦、兒童和腎功能不全患者等需要進行監(jiān)測[7-10]?？?Ⅹa活性檢測是美國胸科醫(yī)師協(xié)會（American College of Chest Physicians，ACCP）[7]、英國血液學(xué)標準委員會（British Committee for Standards in Haematology,BCSH）[8]指南及加拿大[9]和中國[10]專家共識推薦的監(jiān)測LMWH治療藥物濃度的方法。由于LMWH必須與AT結(jié)合才能發(fā)揮抗凝作用，AT缺乏會影響其抗凝效果[11]，因此使用抗-Ⅹa活性監(jiān)測LMWH藥物濃度時，還需確認患者AT活性水平[7]。目前，關(guān)于肝素抗凝治療監(jiān)測相關(guān)項目（尤其是抗-Ⅹa活性和AT活性）性能驗證的研究較少，故本研究參考CLSI指南、衛(wèi)生行業(yè)標準和試劑廠家的要求，對上述3個項目的性能進行驗證。

精密度驗證結(jié)果顯示，3個項目的批內(nèi)精密度和日間精密度均符合廠家說明書要求。值得注意的是，對于LMWH抗-Ⅹa活性檢測結(jié)果的精密度，本研究依據(jù)廠家建議以標準差（s）作為評價指標，2個濃度水平質(zhì)控品檢測結(jié)果的s均小于廠家的要求（s≤0.10抗-Ⅹa IU/ml）。若以變異系數(shù)（CV）表示，本研究CV為2.3%～3.5%，與相近濃度水平范圍廠家試劑說明書給出的實測CV（3.0%～4.8%）和Suzuki等[12]研究結(jié)果（2.4%～6.4%）較接近。由于抗-Ⅹa活性數(shù)值較小，CV值的大小易受濃度水平的影響，如Houbouyan等[13]檢測濃度水平為0.23～0.78 抗-Ⅹa IU/ml質(zhì)控品的CV為1.9 %～16.7%。不同廠家的精密度評價指標存在差異，一般在低濃度水平時宜使用標準差，在較高濃度水平時宜使用變異系數(shù)。

LMWH抗-Ⅹa活性和AT活性檢測結(jié)果在一定范圍內(nèi)呈線性且有配套校準品，故能夠進行線性和準確度驗證。線性驗證方法主要參考行業(yè)標準WS/T 408-2012的方案，結(jié)果分析以回歸方程的斜率和相關(guān)系數(shù)作為評價指標，簡便易行。LMWH抗-Ⅹa活性檢測廠家聲稱的線性范圍為0.1～2.0抗-Ⅹa IU/ml，本研究結(jié)果顯示，在0～1.83抗-Ⅹa IU/ml范圍內(nèi)線性良好；AT活性檢測廠家聲稱的線性范圍為9%～140%，本研究結(jié)果顯示，在0～139%范圍內(nèi)線性良好。不足之處是本次驗證的線性范圍未能包括廠家聲稱線性范圍的上限。APTT檢測結(jié)果不呈線性且無配套校準品，故無法進行線性和準確度驗證，其結(jié)果的可靠性常通過檢測定值質(zhì)控品、參加室間質(zhì)量評價和結(jié)果比對等方式進行驗證。本研究通過檢測2016年全國室間質(zhì)評10個批號質(zhì)評物的方式進行可比性驗證，結(jié)果符合要求。APTT檢測結(jié)果易受試劑敏感度的影響，為保證檢測結(jié)果的可靠性，實驗室除規(guī)范做好室內(nèi)質(zhì)控外，在使用新批號試劑時還應(yīng)對其參考區(qū)間和UFH治療范圍進行驗證，必要時應(yīng)建立新的參考區(qū)間和UFH治療范圍[1]。

正常人血漿LMWH抗-Ⅹa活性檢測結(jié)果幾乎為0，接受LMWH治療的患者血漿抗-Ⅹa活性能夠被檢出，但水平仍然較低，故驗證檢測系統(tǒng)的抗-Ⅹa活性檢出能力非常重要。本研究通過分析廠家聲稱的LoD對其檢出能力進行驗證。根據(jù)CLSI EP17-A2指南，LoD的驗證方法是對空白樣本進行至少20次檢測，若檢測結(jié)果超出廠家聲稱LoD的比例不超過15%，則可接受廠家聲稱的LoD。本研究以健康自愿者的血漿作為空白樣本，為減少個體差異的影響，將20位自愿者（男女各半）的血漿進行等比例混合，并連續(xù)進行30次檢測。結(jié)果顯示，采用兩種結(jié)果判斷方法的LMWH抗-Ⅹa活性檢測的LoD均符合要求。

為保證性能驗證結(jié)果的可靠性，本研究在正式開始前首先嚴格按照標準操作程序進行試劑準備、建立了LMWH抗-Ⅹa活性和AT活性檢測的定標曲線、規(guī)范開展了3個項目的室內(nèi)質(zhì)控。建立室內(nèi)質(zhì)控過程中發(fā)現(xiàn)LMWH抗-Ⅹa活性檢測，個別批號質(zhì)控品廠家給出的質(zhì)控靶值和實際檢測均值存在較大差異，實驗室應(yīng)按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》實施細則的要求，使用一段時間內(nèi)質(zhì)控品實際檢測的均值作為質(zhì)控均值，否則易出現(xiàn)假失控。

綜上所述，本研究對STA-R Evolution血凝儀LMWH抗-Ⅹa活性、AT活性和APTT檢測性能進行了驗證，結(jié)果符合廠家和衛(wèi)生行業(yè)標準的要求。肝素抗凝治療監(jiān)測對于指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要價值，只有檢測系統(tǒng)的性能驗證符合要求，才能保證檢測結(jié)果準確可靠。不同廠家的性能驗證方法和指標存在差異，探討性能驗證方法和指標對臨床實驗室的質(zhì)量改進具有重要意義。

1 CLSI. Protocol for the Evaluation，Validation，and Implementation of Coagulometers; Approved Guideline：H57-A[S]. Wayne，PA： Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

2 CLSI. Validation，Verification，and Quality Assurance of Automated Hematology Analyzers; ApprovedStandard-Second Edition： H26-A2[S]. Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2010.

3 CLSI. Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline-Second Edition： EP17-A2[S]. Wayne，PA： Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

4 衛(wèi)生部臨床檢驗標準專業(yè)委員會.臨床化學(xué)設(shè)備線性評價指南： WS/T 408-2012[S]. 北京： 中國標準出版社，2012.

5 衛(wèi)生部臨床檢驗標準專業(yè)委員會.臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求： WS/T 406-2012[S]. 北京： 中國標準出版社，2012.

6 Baglin T，Barrowcliffe TW，Cohen A，et al. Guidelines on the use and monitoring of heparin[J]. Br J Haematol，2006，133（1）：19-34.

7 David A，Garcia MD，Trevor P，et al. Parenteral Anticoagulants： Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis，9th ed： American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines [J]. Chest，2012，141（Suppl 2） ：e419S-94S.

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12 Suzuki T，Ishii-Watabe A，Hashii N，et al. The establishment and validation of efficient assays for anti-Ⅱa and anti-Ⅹa activities of Heparin sodium and heparin calcium[J]. Biologicals，2013，41（6）：415-423.

13 Houbouyan L，Boutière B，Contant G，et al. Validation protocol of analytical hemostasis systems：measurement of anti-Ⅹa activity of low-molecularweight heparins[J]. Clin Chem，1996，42（8 Pt 1）：1223-1230.

Verification of Assays for Heparin Therapy Monitoring

HU Huan-rong，LI Chen-bin，ZHOU Wen-bin，et al.
Graduate School of Peking Union Medical College，National Center for Clinical Laboratories，Beijing Engineering Technology Research Center of Clinical Laboratory，Beijing Hospital，National Center of Gerontology，Beijing 100730

Objective To verify the measurement performance of low molecular weight heparin（LMWH）anti-Ⅹa activity assay，antithrombin（AT）activity assay and activated partial thromboplastin time （APTT） test. Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI） guidelines，the professional standards and manufacturer's instructions，the performance characteristics of LMWH anti-Ⅹa activity assay，AT activity assay and APTT test were verified as follows： within-run precision，between-day precision，linearity，accuracy or comparability and the limit of detection （LoD，only for LMWH anti-Ⅹa activity assay）. Results The within-run precision，betweenday precision，linear range，bias for accuracy and LoD of LMWH anti-Ⅹa activity assay were 0.03 anti-Ⅹa IU/ml and 0.05 anti-Ⅹa IU/ml，0.04 anti-Ⅹa IU/ml and 0.05 anti-Ⅹa IU/ml，0-1.83 anti-Ⅹ a IU/ml，4.3% and 2.2%，0.05 anti-Ⅹa IU/ml，respectively，all of which were acceptable following manufacturer’s instructions. The within-run precision，between-day precision，linear range and bias for accuracy of AT activity assay were 2.0% and 3.5%，2.7% and 5.3%，0%-139%，0.9%，-1.4% and -2.7%，respectively，all of which were acceptable following manufacturer's instructions. The within-run precision，between-day precision and bias for comparability of APTT test were 0.5% and 0.4%，3.4% and 4.4%，within ±15.0%，respectively，all of which were acceptable according to professional standards and manufacturer's instructions. Conclusion The verified data of the LMWH anti-Ⅹa activity，AT activity and APTT detection systems were acceptable according to the professional standards and manufacturer's instructions. It is very important to set up the methods and specifications of verification for clinical laboratories to implement quality improvement.

Heparin Laboratory monitoring Anti-Ⅹa activity Antithrombin Performance verification

R446.11

A

1671-2587（2017）03-0252-06

2017-02-01）

（本文編輯：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.013

*本課題受國家科技基礎(chǔ)性工作專項基金（No.2013FY113800）資助

100730 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京醫(yī)院，國家老年醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京市臨床檢驗工程技術(shù)研究中心（胡歡榮，劉秀麗，彭明婷）；北京醫(yī)院，國家老年醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京市臨床檢驗工程技術(shù)研究中心（李臣賓，周文賓）

胡歡榮（1990–），女，江西上饒人，在讀碩士研究生，（E-mail）41232956@qq.com。

彭明婷，女，研究員，主要從事臨床血液與體液檢驗標準化及質(zhì)量控制研究，（E-mail）mtpeng@nccl.org.cn。