高效實用的組織芯片免疫組織化學對照體系的建立

陳杰偉，劉君，張淦梅，盧佳斌，楊遠忠，廖定準，蔡木炎，肖永波*

（1中山大學腫瘤醫(yī)院病理科，廣州 510060；2佛山市第一人民醫(yī)院病理科，佛山 528000）

技術(shù)方法

高效實用的組織芯片免疫組織化學對照體系的建立

陳杰偉1，劉君1，張淦梅2，盧佳斌1，楊遠忠1，廖定準1，蔡木炎1，肖永波1*

（1中山大學腫瘤醫(yī)院病理科，廣州 510060；2佛山市第一人民醫(yī)院病理科，佛山 528000）

目的開發(fā)一種高效實用的組織芯片對照體系應(yīng)用于免疫組織化學質(zhì)量控制。方法根據(jù)臨床病理診斷的需求，以組織獲取的難易程度、提高工作效率及實用性強為原則，運用組織芯片技術(shù)，設(shè)計多種對照組織芯片的微陣列，并用多種抗體測試驗證。結(jié)果建立了5種組織芯片對照系統(tǒng)，可為約190種抗體的免疫組織化學染色提供相應(yīng)的陽性和陰性組織對照片，其中1號芯片覆蓋的抗體達80余種。結(jié)論科學合理設(shè)計和反復(fù)驗證的組織芯片對照體系，組織耗費少、實用性強和效益高，可廣泛推廣應(yīng)用于日常大規(guī)模的免疫組織化學質(zhì)量控制工作中。

免疫組織化學；組織芯片；對照體系；質(zhì)量控制

近年來，隨著個體化診療時代的來臨，精準醫(yī)學的快速發(fā)展，免疫組織化學已成為病理醫(yī)生不可或缺的輔助診斷手段。隨著免疫組織化學染色過程逐步自動化，免疫組織化學在病理診斷中的作用日益廣泛。如今，免疫組織化學技術(shù)已不僅僅用于判斷腫瘤的來源、分類及鑒別診斷，而且廣泛應(yīng)用于檢測相關(guān)指標來判斷預(yù)后和指導(dǎo)臨床個性化治療[1-3]，因此其準確性和可靠性至關(guān)重要。盡管免疫組織化學染色在臨床病理診斷的應(yīng)用超過40年，但質(zhì)量控制的標準化仍有待進一步完善，免疫組織化學染色過程中有很多因素可對染色結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響[4-7]。為了促進臨床免疫組織化學標準化，提高染色結(jié)果的可靠性，每批次染色時都應(yīng)該進行有效的質(zhì)量控制，不可或缺的便是陰陽性對照的設(shè)立。只有設(shè)立適當?shù)年庩栃詫φ詹拍艽_保免疫組織化學染色過程的準確性、抗體及相關(guān)試劑的有效性。下面介紹一種實用高效的免疫組織化學染色芯片對照體系。

材料與方法

1 材料

組織包埋石蠟(Paraplast，Leica)，熔點60℃。

組織芯片的組織來源：中山大學腫瘤醫(yī)院病理科外科手術(shù)標本，組織離體0.5h內(nèi)浸泡于相當于組織十倍體積的10%中性福爾馬林固定時間24～48h，常規(guī)進行組織的脫水，浸蠟和包埋，取病理診斷明確的剩余的組織蠟塊為供體蠟塊。

受體蠟塊制模器（圖1A）和受體蠟塊與組織芯融合器（圖1B）由我們自行設(shè)計，分別用不銹鋼和鋼化玻璃加工而成；受體蠟塊模具和組織芯片槍購自北京中杉金橋公司（Unitma-Quick-Ray，圖1C）。

受體蠟塊制模器上陣列排列有54個直經(jīng)為1.5mm的針芯，用來制成含有54個孔徑為1.5mm 的小孔的受體空白蠟塊；受體蠟塊和組織芯融合器上有兩個孔位，可同時融合兩個組織芯片蠟塊，左右兩個鋼化玻璃片用于上下按壓輔助融合；受體蠟塊模具用于制作受體蠟?zāi)r輔助受體蠟塊制模器定型蠟?zāi)＃唤M織芯片點樣槍用于從供體組織蠟塊取樣和向受體蠟塊注芯。

圖1 手工制作芯片的工具。A，受體蠟塊制模器；B，受體蠟塊和組織芯融合器；C，受體蠟塊模具和組織芯片點樣槍Fig. 1 The tools used for making microarrays manually. A, receptor parafn block molding machine; B, receptor parafn block and tissue core fusion machine; C, receptor parafn mould and tissue microarray sampler

2 對照組織芯片體系構(gòu)建

根據(jù)使用頻率和組織獲取的難易程度來設(shè)計組織芯片的組織陣列，每種組織芯片盡量覆蓋多種抗體，從而達到組織耗費少、方法操作簡便、省時高效的目的。經(jīng)過反復(fù)征求病理科醫(yī)生意見和反復(fù)有效的驗證，根據(jù)科室的實際情況，多次設(shè)計調(diào)整優(yōu)化后，構(gòu)建了5個系統(tǒng)化的對照組織芯片（圖2）。

1號芯片：涵蓋多種組織成分，包括不同的上皮組織、淋巴組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等，主要用于診斷淋巴、上皮、間葉和神經(jīng)來源的腫瘤類抗體質(zhì)量控制。

2號芯片：包括甲狀腺癌、肺癌、胸腺瘤和膠質(zhì)瘤的腫瘤組織，主要用于診斷這些腫瘤特異性比較高的抗體質(zhì)量控制。

3號芯片：包括宮頸癌、乳腺癌、大汗腺癌、肝癌、卵巢漿液性癌等腫瘤組織主要用于診斷這些腫瘤特異性比較高的抗體質(zhì)量控制。

4號芯片：包括惡性黑色素瘤、間質(zhì)瘤和嗜鉻細胞瘤腫瘤組織主要用于診斷這些特異性比較高的抗體質(zhì)量控制。

5號芯片：包括間皮瘤、精原細胞瘤、霍奇金，間變，NK淋巴瘤等腫瘤組織主要用于診斷這些腫瘤特異性比較高的抗體質(zhì)量控制。

除上述5種組織芯片外，還構(gòu)建了一些只為一種抗體提供特定組織對照片的單點對照或三點對照，因為這些抗體的陽性組織較難獲取或者這是一種需要定量分析的抗體，尤其是靶向藥物的單克隆抗體需要獨立質(zhì)量控制，如Her-2對照組織芯片上的三個點分別為待測抗體陰性、中等強度陽性和強陽性的組織，MyoD1, Myogenin等用于鑒別診斷少見病例的抗體也常采用單點對照，避免與其他抗體組織對照放在一起造成浪費。

構(gòu)建的組織芯片為常用抗體質(zhì)量控制設(shè)置了陽性對照及陰性對照，每個對照芯片進行相應(yīng)抗體的染色后至少能觀察到一個位點的組織有陽性表達，其余的位點就可作為陰性對照。

3 收集質(zhì)量控制抗體相應(yīng)的陽性組織蠟塊

根據(jù)上述設(shè)計好的組織陣列，收集相應(yīng)的陰陽性對照組織蠟塊并在這些供體蠟塊上圈出陽性區(qū)域。1號芯片所需的組織蠟塊需要進行切片并行HE染色后，在鏡下觀察組織形態(tài)并圈出符合要求的部位，例如：肺組織要有正常的肺泡結(jié)構(gòu)，扁桃體組織要有被覆的鱗狀上皮及淋巴小結(jié)，甲狀腺組織要有正常濾泡結(jié)構(gòu)，腎組織要有腎小管，子宮組織要有子宮內(nèi)膜層或肌層，結(jié)腸組織要有黏膜層，闌尾組織要有大腸腺和淋巴小結(jié)，胎盤組織要有絨毛結(jié)構(gòu)，并一律避開壞死和鈣化的區(qū)域。其余4種芯片對應(yīng)的組織蠟塊經(jīng)過切片和對應(yīng)質(zhì)量控制的抗體免疫組織化學染色后，在鏡下比對選定陽性部位并在切片上畫圈標記，然后比對蠟塊的相應(yīng)位置并圈出。這些工作由質(zhì)量控制小組（由病理醫(yī)師和技術(shù)人員組成）一起完成。

4 受體蠟塊的制作

將石蠟放置在65℃烤箱中60min，達到熔融狀態(tài)取出并注入固定在受體蠟塊制模器上的模具內(nèi)，制成含有孔徑為1.5mm小孔的空白蠟塊(圖3A)。

5 組織芯的取樣與填充組織

用組織芯片點樣槍取供體蠟塊上標記好的目標組織，注意避開鈣化點及壞死處。取樣時芯片槍的針頭垂直于蠟塊加壓，拔出后慢推芯片搶的內(nèi)芯將蠟塊組織芯注入受體蠟塊孔中。同一受體蠟塊的各位點的組織芯長度應(yīng)相當，如果某個位點的組織芯長度與其它位點相差大，可在同一供體蠟塊取兩塊組織芯疊在一起。按預(yù)先設(shè)計好的芯片陣列填充完所有的組織后，向受體蠟塊的背面填補烤軟的石蠟，空白孔也須填充石蠟，以防蠟塊組織芯與受體蠟塊融合時蠟塊變形而導(dǎo)致組織移位。

圖2 5個對照組織陣列Fig. 2 Five tissue microarray control systems

6 蠟塊組織芯與受體蠟塊的融合及組織芯片的蠟塊包埋

將做好的蠟塊放入玻璃模具內(nèi)，并用兩塊干凈玻璃夾住蠟塊置于65℃烤箱15min，使蠟塊成微熔融狀態(tài)；取出后雙手均勻用力按壓上下兩塊玻璃，將蠟塊壓平、壓實，并放入冰水中冷卻，蠟?zāi)Ｄ毯蟛Ａ＞咧腥〕觯▓D3B）。

將融合好的多組織蠟塊稍稍烤軟，然后按預(yù)先劃分好的線分割出相應(yīng)的組織芯片蠟塊，每個組織芯片蠟塊單獨用包埋盒包埋成型（圖3C）。

7 組織芯片蠟塊有效性檢測、組織芯片切片與保存

每個組織芯片蠟塊切片后進行相應(yīng)抗體的免疫組織化學染色，由質(zhì)量控制小組閱片，確定抗體染色的特異性及陽性染色信號定位，從而確定制成的組織芯片蠟塊是否可用于對照的抗體的實際有效種類，并做好記錄。

對組織芯片進行連續(xù)地切片，置于40℃的溫水中展片，隨后裱于干凈的防脫載玻片上端或者下端（圖3D），標明組織芯片的類型，60℃的烤箱中1h，室溫或4℃保存；切片量最好是一周之內(nèi)用完，最長不超過一個月，否則部分不穩(wěn)定抗原的丟失較嚴重。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建了5個高效實用的陰性陽性對照組織芯片體系

5個對照芯片體系經(jīng)過兩年時間、中山大學腫瘤醫(yī)院診斷的近5萬個病例、約30萬張檢測片應(yīng)用，反復(fù)有效的驗證可為190多種抗體提供穩(wěn)定可靠的陰陽性組織對照片，其中，1號芯片覆蓋的抗體范圍達80余種，覆蓋了部分淋巴瘤，上皮和間葉來源腫瘤的鑒別診斷抗體對照；2號芯片為臨床病理診斷提供了甲狀腺癌、常見類型肺癌、膠質(zhì)瘤、胸腺瘤的鑒別診斷抗體對照；3號芯片提供了乳腺癌、宮頸癌、肝癌、卵巢癌相應(yīng)的鑒別診斷抗體對照；4號芯片提供了惡性黑色素瘤、間質(zhì)瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的鑒別診斷抗體對照；5號芯片提供了前列腺癌、精原細胞瘤、間皮瘤、霍奇金淋巴瘤、NKT淋巴瘤、間變淋巴瘤的鑒別診斷抗體對照（表1）。

圖3 組織芯片制作步驟示意圖。A，用圖1A模具制作的帶有1.5 mm直徑小孔的受體蠟塊；B，含有組織芯的受體蠟塊；C，分割并包埋后的組織芯片對照蠟塊；D，裱于玻片上的對照組織芯片F(xiàn)ig. 3 Fabrication of tissue microarrays. A, a receptor parafn block with holes of 1.5mm diameter made with the molding machine indicated in Figure 1A; B, receptor parafn blocks containing tissue cores; C, segmented and embedded tissue microarray control parafn blocks; D, control tissue chips mounted on slides

表1 組織芯片各點組織的抗體陽性表達對照情況Tab. 1 Positive antibody expression specific to each tissue spot on the microarrays

圖4 1號組織芯片對照免疫組織化學染色舉例。A，扁桃體組織的LCA細胞膜陽性；B，闌尾組織的LCA細胞膜陽性；C，肺組織的TTF-1細胞核陽性；D，甲狀腺組織的TTF-1細胞核陽性；比例尺，100μmFig. 4 An example of immunohistochemical staining on No. 1 tissue microarray. A, tonsil tissue∶ LCA positive in cell membrane; B, appendix tissue∶LCA positive in cell membrane; C, lung tissue∶ TTF1 positive in the nucleus; D, thyroid tissue∶ TTF1 positive in the nucleus; scale bar, 100μm

2 幾乎全覆蓋的芯片對照系統(tǒng)從多角度有效提高了質(zhì)量控制水平

5個對照芯片體系基本覆蓋了臨床常用診斷抗體，每種抗體加了芯片對照可以在日常質(zhì)量控制中很容易找到并排除失控（假陽性和假陰性）的原因，有效地推動了實驗室自動化和標準化進程。因為是多點控制，每種抗體有了陽性對照的同時也自動具備陰性對照；而且，還可觀察到同一抗原在同一種組織芯片上的不同組織中表達。例如，在應(yīng)用1號芯片作為質(zhì)量控制時，LCA不僅表達于扁桃體，還表達于闌尾；TTF-1不僅表達于肺上皮而且表達于甲狀腺的上皮（圖4）。同樣，也可以觀察到多種抗原表達于同一組織：扁桃體組織中，在上皮細胞胞質(zhì)可見CK、CK5/6、EMA等陽性表達；血管肌層可見SMA、HHF35、Calponin等陽性表達，間質(zhì)細胞胞質(zhì)可見Vimentin等陽性表達，濾泡周圍副皮質(zhì)區(qū)可見CD3、CD4、CD5、CD8等陽性表達，血管內(nèi)皮可見CD31、CD34，淋巴管內(nèi)皮可見D2-40、Factor Ⅷ等陽性表達，淋巴結(jié)濾泡生發(fā)中心可見LCA、CD20、CD79α、CD10、 CD21、CD23等陽性表達。

討 論

為了保證病理診斷中免疫組織化學結(jié)果的可靠性，每批次染色無論手工操作還是自動化都應(yīng)進行有效的質(zhì)量控制。設(shè)立適當穩(wěn)定的對照并且合理地應(yīng)用則是質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟，是對免疫組織化學染色過程的準確性、抗體及相關(guān)試劑的有效性進行有效的控制，進而有利于醫(yī)生對染色結(jié)果的正確判斷，有利于病理診斷的準確性。

免疫組織化學染色對照包括陽性組織對照、陰性組織對照、陰性試劑對照和內(nèi)部對照[10-11]。一般來說，不需要專門設(shè)立陰性組織對照，而且，陽性對照組織芯片已包含其陰性組織。陰性試劑對照是針對內(nèi)源性的生物素而設(shè)立的對照，由于應(yīng)用聚合物類檢測系統(tǒng)的染色程序，如果完成了最初的校驗，可以取消陰性試劑對照[11]。內(nèi)部對照通常是被測試組織中的正常細胞，例如，正常的上皮細胞，內(nèi)皮細胞，肌纖維等，內(nèi)部陽性對照可用于確認包括組織固定包埋等在內(nèi)的所有步驟的可靠性[6,8]。雖然本文所介紹的陽性對照設(shè)立可廣泛應(yīng)用于免疫組織化學染色對照，卻不能監(jiān)控標本的前處理（包括固定），內(nèi)部陽性和陰性對照便是克服這一弱點的最佳選擇，甚至其抗原含量可以進一步用于定量免疫組織化學[6,8,9,10]。內(nèi)部陰陽性對照是每一張被測試的組織切片上都存在的細胞成分，它是目前比較可行的一種評價標本制備和定量免疫組織化學方法[6,9]。

理想的陽性對照材料應(yīng)符合以下要求：①與待測組織切片的標本制備過程完全等同，包括組織的固定包埋等處理程序；②與待測的組織切片一起進行免疫組織化學染色的全過程；③含有已知的陽性待測分析物；④廉價并可無限量提供；⑤普遍通用性[8]。目前尚未找到這樣的標準對照材料。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的陽性對照材料來源，包括細胞系、異種移植物、工程化多肽，由于技術(shù)原因目前還不能大規(guī)模地應(yīng)用于臨床實踐中[13]。這些新的材料來源也許能提供更為標準的對照過程，減輕病理科日常工作量，提高工作效率。但目前較難推廣，原因之一就是每個單位的組織固定處理方法沒有達到一致或標準化。免疫組織化學對照研究進展緩慢，很重要的原因之一就是組織固定等前處理的標準化還沒完全有效的推進，因而抗原修復(fù)的標準化也遠沒達到一致的要求。

目前，在免疫組織化學染色中使用多組織對照是最有保證的質(zhì)量控制方法，它是一種比較節(jié)省且有效的方法，將多種不同的組織制成多組織對照蠟塊，并在切片后與待測病例組織放在同一張玻片上，與待測病例組織進行完全相同的免疫組織化學染色過程。應(yīng)用較為廣泛的多組織蠟塊制作方法包括，“香腸”蠟塊技術(shù)、組織芯片技術(shù)和三點組織對照技術(shù)[14-17]?！跋隳c”蠟塊技術(shù)無需特殊儀器，全手工操作，適用于所有的免疫組織化學實驗室，在病理實驗室中應(yīng)用較為廣泛，但是“香腸”法制作過程較為復(fù)雜，須從新鮮標本開始，需要較長時間，制作所需組織較多。而本文中所用的組織芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點：①組織可以從石蠟包埋組織上獲取，對照組織與待測病例組織的前處理有較好的一致性；②所需組織少，1.5mm的組織即足夠；③每例芯片上組織獲取的難易程度和使用頻率相近，減少使用過程中組織的耗費；④利用組織芯片儀，操作易學簡單方便，效率高。目前，陽性對照的材料來源主要是病理診斷明確的剩余的組織蠟塊。由于組織來源有限，新興的免疫組織化學對照材料(細胞，工程多肽等)開發(fā)仍不具規(guī)模，組織芯片對照技術(shù)相對于“香腸”蠟塊技術(shù)來說更具優(yōu)勢。同時，組織芯片技術(shù)也有一定的局限性，因其需要一些特殊的工具。另外，存在陽性區(qū)域不同深度層次分布不均等問題，在切到較下層面時，陽性區(qū)域和陽性細胞就會急劇減少，甚至是陰性，所以制作好的組織芯片切到一定數(shù)量后需要再次驗證芯片切片上的陽性區(qū)域是否還存在以及面積的大小。

本研究所設(shè)計的組織芯片可根據(jù)各個層次的醫(yī)院臨床病理需求進行有效的組合，可操作性強，各個單位能靈活效仿應(yīng)用；同時也致力為病理室間質(zhì)量控制提供免疫組織化學熟練水平測試的材料，從而提高整個病理免疫組織化學技術(shù)的質(zhì)量控制水平。

總之，經(jīng)過科學合理設(shè)計的免疫組織化學組織芯片對照片組織耗費少、實用性強和效益性高，操作簡單，易學，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可廣泛應(yīng)用到日常大規(guī)模的免疫組織化學質(zhì)量控制工作，為免疫組織化學室內(nèi)及室間質(zhì)量控制帶來極大的穩(wěn)定和便利。

致謝：中山大學腫瘤醫(yī)院病理科醫(yī)生和技術(shù)團隊在本研究過程中為閱片和設(shè)計制作提供有益的付出和建議，在此表示感謝！

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Development of a practical and effective tissue microarray system for immunohistochemical quality control

Chen Jiewei1，Liu Jun1，Zhang Ganmei2，Lu Jiabin1，Yang Yuanzhong1，Liao Dingzhun1，Cai Muyan1，Xiao Yongbo1＊
(1Department of Pathology,SunYat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, 510060;2Department of Pathology, The First People,s Hospital of Foshan, Foshan,528000)

ObjectiveTo develop a practical and efective tissue microarray system for immunohistochemical quality control.MethodsA variety of tissue microarray control systems were designed based on clinicopathological diagnostic requirements and the difculty of obtaining tissue, and were tested with various antibodies.ResultsThe fve systems developed in this study can provide positive and negative controls for immunohistochemical staining of more than 190 antibodies, over 80 of which are included in No.1 microarray alone.ConclusionBy proper design and repeated validation, the tissue microarray control systems developed in this study have the advantages of low tissue consumption, good practicability and high efciency, and are widely applicable in the quality control in large-scale immunohistochemical routine.

Immunohistochemistry; tissue microarray; control system; quality control

R392-33

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.013

2016-11-18

2017-03-26

2015中大青年項目（520101210104）

陳杰偉，男（1984年），漢族，主管技師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：xiaoyb@sysucc.org.cn