磷脂酰肌醇3激酶p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端氨基酸表達(dá)水平對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的影響及分子機(jī)制

張雪蓮 胡光瑞

(白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生化教研室，吉林 白城 137000)

磷脂酰肌醇3激酶p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端氨基酸表達(dá)水平對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的影響及分子機(jī)制

張雪蓮 胡光瑞1

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部生化教研室，吉林 白城 137000)

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端氨基酸表達(dá)水平對(duì)人乳腺癌細(xì)胞黏附性的影響及其分子機(jī)制。方法 使用空載體質(zhì)粒pEGFP-C和重組質(zhì)粒pEGFP-N24分別對(duì)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，建立融合蛋白GFP-N24和GFP穩(wěn)定表達(dá)的SK-BR-3細(xì)胞系。顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)變化并鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的蛋白表達(dá)；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的黏附性；Western印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞黏附分子E-cadherin和鈣緊張素表達(dá)；酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和尿激酶纖溶酶原活化因子(uPA)表達(dá)。結(jié)果 建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP-N24的SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞系和表達(dá)GFP的SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞系，GFP-N24的表達(dá)量明顯高于 GFP。 SK-BR-3/GFP-N24細(xì)胞在纖黏連蛋白和鼠尾膠原上的黏附性均明顯低于SK-BR-3、SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞(P<0.01)。SK-BR-3/GFP-N24細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯高于SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞和SK-BR-3細(xì)胞，鈣緊張素蛋白表達(dá)量明顯低于SK-BR-3/pEGFP-C和SK-BR-3細(xì)胞(P<0.01)。SK-BR-3/pEGFP-C與SK-BR-3細(xì)胞之間E-cadherin和鈣緊張素蛋白的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組細(xì)胞上清液中均檢測(cè)到分子量為79 kD的MMP和60 kD的uPA，且MMP、uPA表達(dá)量3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 磷脂酰肌醇3激酶p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端氨基酸過表達(dá)是通過影響E-cadherin和Wnt通路關(guān)鍵分子鈣緊張素表達(dá)來抑制人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的胞黏附性來實(shí)現(xiàn)的。

磷脂酰肌醇3激酶；乳腺癌；細(xì)胞黏附；E-cadherin；鈣緊張素

磷脂酰肌醇3激酶可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1〕；其p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端結(jié)構(gòu)域不僅能與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤蛋白結(jié)合調(diào)控細(xì)胞周期，還可與增殖細(xì)胞核抗原結(jié)合促進(jìn)脫氧核糖核酸合成以及腫瘤發(fā)生〔2〕。p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端24個(gè)氨基(N24)過表達(dá)可顯著抑制乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞的活性〔3〕。本文旨在探究p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端過表達(dá)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞黏附性的影響，進(jìn)而分析其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3購于上海斯信生物科技有限公司；空載體質(zhì)粒pEGFP-C和重組質(zhì)粒pEGFP-N24(含磷脂酰肌醇3激酶p55γ調(diào)節(jié)亞基N末端24個(gè)氨基酸cDNA，在EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)植入pEGFP載體而成)均購于上海芃碩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-BR-3細(xì)胞分為兩組，轉(zhuǎn)染前24 h接種至6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋面積>80%，取4～6 μg的空載體質(zhì)粒pEGFP-C、重組質(zhì)粒pEGFP-N24分別進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，36 h后用含500 mg/L G418的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行抗性克隆株的篩選，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后記為SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3/pEGFP-N24，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后按1×106/孔密度接種于6孔板中，孵育48 h后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；Western印跡法鑒定蛋白表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 分別用3 g/L牛血清白蛋白、30 mg/L纖黏連蛋白、25 ng/L鼠尾膠原包被96孔板，37℃孵育3 h，4℃過夜。在包被不同基質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)孔中按1×105/孔密度分別接種SK-BR-3、SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3/GFP-N24細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)4 h后洗去未黏附的細(xì)胞。黏附細(xì)胞經(jīng)10%甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色5 min，磷酸緩沖液漂洗，1%十二烷基苯磺酸鈉溶解30 min，以590 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值為細(xì)胞黏附指標(biāo)。

1.2.3 細(xì)胞黏附分子E-cadherin和Wnt通路關(guān)鍵分子表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡法進(jìn)行檢測(cè)，分別提取SK-BR-3、SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量后行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，室溫封閉3 h；滴加E-cadherin多克隆抗體(1∶500稀釋)、鈣緊張素單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，5%TBST清洗后滴加二抗(1∶1 000稀釋)，室溫靜置1 h，洗凈后行ECL顯色。ChemiDoc MP 多功能成像系統(tǒng)掃描雜交條帶。

1.2.4 酶譜實(shí)驗(yàn) 按1×106/孔密度在6孔板中分別接種SK-BR-3、SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞，無血清培養(yǎng)24 h后取上清行SDS-PAGE電泳；在分離膠配置過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)實(shí)驗(yàn)加1%明膠至終濃度0.1%；尿激酶纖溶酶原活化因子(uPA)實(shí)驗(yàn)加10 mg/L纖溶酶原和1 g/L的酪蛋白。電泳完成后用蒸餾水沖洗電泳膠，3%聚乙二醇辛基苯基醚中室溫輕搖2 h。沖洗后分別轉(zhuǎn)入明膠酶緩沖液和甘氨酸緩沖液中，37℃反應(yīng)10 h，Coomassie brilliant blue R250染色6 h，脫色至出現(xiàn)負(fù)染帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和蛋白表達(dá)情況 光學(xué)顯微鏡下觀察SK-BR-3細(xì)胞為圓形或梭形，平鋪式生長(zhǎng)；基因轉(zhuǎn)染后SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄降拈L(zhǎng)梭形，尤其是表達(dá)GFP-N24的細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槌衫w維形且胞質(zhì)中存在大量分泌顆粒，見圖1。Western印跡檢測(cè)顯示，在SK-BR-3細(xì)胞裂解液中未出現(xiàn)蛋白條帶，兩組基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中可見蛋白條帶，融合蛋白GFP-N24的表達(dá)量為(6.39±0.51)，明顯高于空載體中的(2.76±0.18)(P<0.01)。見圖2。

圖1 pEGFP轉(zhuǎn)染對(duì)SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 3組細(xì)胞中GFP-N24蛋白表達(dá)情況

2.2 GFP-N24過表達(dá)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞黏附的影響 3組細(xì)胞在牛血清白蛋白上的黏附性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SK-BR-3/ GFP-N24細(xì)胞在纖黏連蛋白和鼠尾膠原上的黏附性均明顯低于SK-BR-3、SK-BR-3/pEGFP-C細(xì)胞(P<0.01)。見表1。

表1 3組細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與SK-BR-3組比較：1)P<0.01；與SK-BR-3/pEGFP-C組比較：2)P<0.01

2.3 GFP-N24過表達(dá)對(duì)E-cadherin和鈣緊張素表達(dá)的影響 SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量分別為(3.95±0.42)、(2.18±0.20)、(2.03±0.09)，鈣緊張素蛋白表達(dá)量分別為(2.46±0.38)、(2.95±0.52)、(1.21±0.16)。GFP-N24過表達(dá)的SK-BR-3細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞和SK-BR-3細(xì)胞，鈣緊張素蛋白表達(dá)量明顯低于轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞和SK-BR-3細(xì)胞(P<0.01)。轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞與SK-BR-3細(xì)胞之間E-cadherin蛋白和鈣緊張素蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 GFP-N24過表達(dá)對(duì)MMP和uPA表達(dá)的影響 3組細(xì)胞上清液中均有檢測(cè)到分子量為79 kD的MMP和60 kD的uPA，SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3細(xì)胞MMP表達(dá)量分別為(9.25±1.48)、(9.06±1.13)、(8.93±1.85)，uPA表達(dá)量分別為(4.01±1.62)、(4.18±1.93)、(4.11±1.40)。3組細(xì)胞中MMP、uPA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 3組細(xì)胞中E-cadherin和鈣緊張素蛋白表達(dá)情況

圖4 酶譜法檢測(cè)3組細(xì)胞中MMP和uPA表達(dá)情況

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生與PI3K信號(hào)通路的持續(xù)激活密切相關(guān)，p55γ可通過調(diào)節(jié)催化亞基的生物學(xué)活性，影響亞細(xì)胞定位來調(diào)控PI3K的活性，其還可繞過PI3K/Akt信號(hào)通路來發(fā)揮特有的細(xì)胞生物學(xué)功能〔4〕。在胃癌中，p55γ通過NF-κB信號(hào)通路提升HIF-1α表達(dá)，抑制VEGF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌組織的血管生成〔2〕。本次研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) GFP-N24的乳腺癌細(xì)胞系，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)由初始的平鋪式生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維形，胞質(zhì)中分泌大量顆粒。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，GFP-N24過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力，因細(xì)胞遷移與黏附之間相互關(guān)聯(lián)，當(dāng)癌細(xì)胞間黏附力降低時(shí)會(huì)誘發(fā)癌細(xì)胞脫離原發(fā)瘤組織，而癌細(xì)胞與胞外基質(zhì)、脈管內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附能力增加是腫瘤侵襲的關(guān)鍵〔5〕。本次研究顯示，GFP-N24過表達(dá)可降低SK-BR-3細(xì)胞在纖黏連蛋白和膠原上的黏附性，削弱細(xì)胞經(jīng)胞外基質(zhì)和脈管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙、侵襲力。細(xì)胞黏附因子E-cadherin高表達(dá)被證實(shí)為抑癌轉(zhuǎn)移因素，本次研究中GFP-N24過表達(dá)可提升SK-BR-3細(xì)胞E-cadherin表達(dá)量，提升癌細(xì)胞與正常組織細(xì)胞間的黏附性，同時(shí)還可下調(diào)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子鈣緊張素的表達(dá)，最終抑制Wnt/鈣緊張素信號(hào)通路，兩者共同作用從而有效抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。MMP是胞外基質(zhì)降解、重建的關(guān)鍵酶，可消除細(xì)胞遷移屏障，有研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力與自身分泌MMP的能力呈正相關(guān)〔7〕。uPA可降解胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘睦w溶酶，其可直接介導(dǎo)纖黏蛋白、降解膠原或間接作用于MMP相關(guān)的侵襲〔7〕。MMP和uPA在癌細(xì)胞胞外基質(zhì)降解中起到協(xié)調(diào)作用，uPA表達(dá)上調(diào)是PI3K影響細(xì)胞侵襲力的主要因素，但本研究發(fā)現(xiàn)GFP-N24過表達(dá)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞MMP和uPA表達(dá)及分泌無明顯影響，其具體原因和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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〔2017-01-16修回〕

(編輯 郭 菁)

張雪蓮(1984-)，女，講師，主要從事生化教學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2654-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.023

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院