不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織前列腺素E2表達(dá)及破骨細(xì)胞水平的影響

黃婉靈 杜 穎

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院口腔科，福建 泉州 362000)

不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織前列腺素E2表達(dá)及破骨細(xì)胞水平的影響

黃婉靈 杜 穎1

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院口腔科，福建 泉州 362000)

目的 探討不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織前列腺素(PG)E2表達(dá)及破骨細(xì)胞水平的影響。方法 160只SPF級SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)3組，每組40只，分別給予0.9%氯化鈉溶液，0.50、0.75、1.00 mg/kg尼古丁酒石酸鹽腹腔注射；比較4組大鼠加力后1、3，5、7、14 d牙周組織PGE2表達(dá)及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)水平。結(jié)果 4組大鼠牙周組織中PGE2表達(dá)水平及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)隨加力時間延長而逐漸上升，且在加力后5 d達(dá)到最大，隨后又下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；4組加力后不同時間PGE2表達(dá)水平及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)3組>實(shí)驗(yàn)2組>實(shí)驗(yàn)1組>對照組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 尼古丁會導(dǎo)致大鼠正畸牙移動過程中牙周組織PGE2表達(dá)和破骨細(xì)胞形成水平上升，且隨劑量增加上升更明顯，故在正畸過程中應(yīng)建議患者戒煙，并有效控制牙周炎癥。

尼古??；正畸；牙周組織；前列腺素E2；破骨細(xì)胞

目前成人正畸患者已占牙齒矯治總數(shù)的15%～20%〔1〕。吸煙已被證實(shí)是牙齒矯治失敗的重要危險因素之一，這與香煙中尼古丁成分損害牙周組織健康、誘發(fā)牙周炎癥及促進(jìn)牙槽骨吸收關(guān)系密切〔2〕；同時，前列腺素(PG)E2已被證實(shí)參與到正畸牙移動過程中骨質(zhì)及牙周組織改建過程〔3〕；但正畸治療患者吸煙行為是否會加重牙周組織損傷，PGE2、破骨細(xì)胞水平在其中動態(tài)變化情況尚缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本次研究通過建立大鼠正畸牙移動+尼古丁干預(yù)模型，觀察牙周組織PGE2表達(dá)及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)水平變化，探討不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織PGE2表達(dá)及破骨細(xì)胞水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 由西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室提供SPF級健康雄性SD大鼠(合格證0015367)共160只，鼠齡64～70 d，體質(zhì)量(200.0±10.0)g。實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：①兔抗鼠PGE2多克隆抗體，由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；②免疫組化檢測試劑盒，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；③二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；④pH7.4～7.6磷酸鹽緩沖液(PBS)，由泉暉貿(mào)易國際有限公司提供；⑤胃蛋白酶，由西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司提供；⑥尼古丁酒石酸鹽，由武漢豐竹林化學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；⑦正畸拉簧，由杭州新亞齒科材料有限公司提供，規(guī)格0.012英寸；⑧結(jié)扎絲，由杭州愛麗思口腔醫(yī)療器材有限公司提供，規(guī)格0.2 mm；⑨德國Leica公司生產(chǎn)RM2235石蠟切片機(jī)；⑩日本OLYMPUS公司生產(chǎn)BX53型自動光學(xué)顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 入選大鼠在高壓滅菌飲用水及飼料分籠喂養(yǎng)7 d后行腹腔注射麻醉，麻醉藥物為氯胺酮100 mg/kg；于上頜中切牙唇舌及第一磨牙近中軸頸緣處磨切淺溝，深度0.5 mm，再采用結(jié)扎絲對鎳鈦拉簧進(jìn)行結(jié)扎，位置為上頜切牙和第一磨牙間，確保第一恒磨牙向近中移動矯治，鎳鈦拉簧規(guī)格長6 mm、直徑0.012英寸，力值約50 g。入選大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)3組，每組40只，分別給予0.9%氯化鈉溶液，0.50、0.75、1.00 mg/kg尼古丁酒石酸鹽腹腔注射，5 s內(nèi)注射完畢；每天定時查看加力裝置有無脫落，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)立即重裝。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 組織取材和切片 分別于每組加力50 g后1、3、5、7、14 d后選取8只大鼠處死，處死方法采用心內(nèi)灌注法；切取鎳鈦拉簧所在位置磨牙及切牙處上頜骨，固定24 h，固定液采用多聚甲醛；再采用螯合劑法脫鈣6～7 w，脫鈣液采用0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；脫鈣完成后采用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟浸沒及包埋，切片方向以第一磨牙近中根處作為矢狀面，切片厚度4～5 μm，并裱片于黏附載玻片上。

1.3.2 牙周組織破骨細(xì)胞計(jì)數(shù) 切片脫蠟后進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色后，盲法下由兩名中級及以上職稱的病理科診斷醫(yī)師繼續(xù)閱片，光鏡下選取5個視野記錄破骨細(xì)胞個數(shù)，并計(jì)算平均值。

1.3.3 牙周組織PGE2表達(dá) 切片脫蠟后以3%過氧化氫水溶液浸泡10 min，超純水與PBS各沖洗2 min；放入37℃恒溫水浴箱以胃蛋白酶法進(jìn)行抗原修復(fù)，時間30 min，再以超純水與PBS各沖洗2 min；滴加1∶400稀釋兔抗鼠PGE2多克隆抗體50 μl；4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，2 min/次，再滴加非生物素二抗，放入37℃恒溫水浴箱孵育30 min；最后以超純水與PBS各沖洗2 min，滴加DAB顯色，復(fù)染蘇木素1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片；PG-E2陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色顆?！?〕。自陽性區(qū)域選擇5個高倍視野，采用Imagine-proplus 5.0圖像分析軟件測定平均光密度(OD)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

4組大鼠牙周組織中PGE2表達(dá)水平及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)隨加力時間延長逐漸上升，且在加力后5 d達(dá)到最大，隨后又下降(P<0.05)；加力后不同時間PGE2表達(dá)水平及破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)3組>實(shí)驗(yàn)2組>實(shí)驗(yàn)1組>對照組(P<0.05)。見表1，表2。

表1 4組大鼠不同時間點(diǎn)牙周組織PGE2表達(dá)水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較：2)P<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組比較：3)P<0.05；加力后5 d與本組其他時間點(diǎn)比較：4)P<0.05

表2 4組大鼠不同時間點(diǎn)牙周組織破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)水平比較±s,n=40,個)

3 討 論

有報道顯示，尼古丁可對骨質(zhì)改建產(chǎn)生不利影響，并可加速骨質(zhì)吸收進(jìn)程；同時吸煙人群牙周附著喪失率約為未吸煙人群的3～4倍，進(jìn)一步證實(shí)尼古丁在牙槽骨喪失過程中發(fā)揮著重要作用，是導(dǎo)致牙周損傷加重的獨(dú)立危險因素之一〔5〕。已有研究證實(shí)，正畸牙移動主要依靠牙周組織改建方可完成，而牙周組織在受到機(jī)械刺激時機(jī)體PGE類合成增加，可激活牙周炎癥反應(yīng)，進(jìn)而為牙周組織改建創(chuàng)造良好環(huán)境；其中E2是公認(rèn)正畸牙移動過程骨質(zhì)吸收和形成穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)之一〔6〕。而國外學(xué)者認(rèn)為，尼古丁可顯著刺激牙齦成纖維細(xì)胞PGE2合成釋放，具有明顯劑量及時間依賴性〔7〕，說明吸煙誘發(fā)骨質(zhì)吸收可能與干擾骨質(zhì)代謝、降低牙周血流、促進(jìn)PGE釋放及刺激破骨細(xì)胞分化成熟有關(guān)。也有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，較正常動物模型，尼古丁可增加正畸牙齒移動速度及移動量，這一效應(yīng)亦呈明顯劑量及時間依賴特征；同時其還能夠提高破骨細(xì)胞合成數(shù)量，提高自身骨質(zhì)吸收能力〔8〕。筆者認(rèn)為這一現(xiàn)象可能與尼古丁除具有調(diào)節(jié)牙槽骨代謝作用外，還能夠刺激牙周血管管徑縮小、降低牙周膜血流分布量有關(guān)。此外，其對于牙周組織中破骨細(xì)胞骨吸收增強(qiáng)作用亦可增加正畸牙齒移動速率〔9〕。

相關(guān)研究顯示〔10〕，正畸牙移動過程中，骨吸收是由破骨細(xì)胞介導(dǎo)，而牙根吸收則是由破牙骨質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，本研究結(jié)果提示尼古丁注射會增加破骨細(xì)胞數(shù)量及PGE2表達(dá)水平，且與劑量呈正比?？赡苁且?yàn)槟峁哦】杉铀僬拦琴|(zhì)吸收，可能與改變PGE2表達(dá)有關(guān)，因正畸牙移動過程中PGE2主要于破骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，間接提示尼古丁對于局部牙周組織炎癥反應(yīng)水平及骨質(zhì)吸收水平的影響情況。

本研究結(jié)果還說明正畸牙移動過程中骨質(zhì)改建、吸收交替進(jìn)行；而且尼古丁對于牙周組織損傷作用具有劑量相關(guān)性。Vandevska-Radunovic等〔11〕建立類似模型中，HE染色下隨加力時間的延長，牙根周圍炎性細(xì)胞浸潤程度增加，壓力側(cè)、張力側(cè)以及分叉處牙根表面開始出現(xiàn)吸收陷窩、破牙骨質(zhì)細(xì)胞；且隨尼古丁注射的劑量越大，牙根表面吸收陷窩加深，且破牙骨質(zhì)細(xì)胞顯著增加，與本次研究趨勢基本相符。因此，在正畸過程中應(yīng)建議患者戒煙，并進(jìn)行有效牙周炎癥控制。

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〔2017-01-20修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

黃婉靈(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事口腔正畸研究。

R78

A

1005-9202(2017)11-2615-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.006

1 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？谇会t(yī)學(xué)系基礎(chǔ)教研室