表面等離子體共振生物芯片無標(biāo)記實時檢測蝦血藍蛋白

李 瑩，齊 攀，李仕萍，趙明路，黃建芳，馬 驍，王 宏，鐘金鋼,*

（1.暨南大學(xué) 光電信息與傳感 技術(shù)廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)預(yù)科部， 廣東 廣州 510610；3.廣東交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院電子與通信工程學(xué)院電子工程系，廣東 廣州 510650；4.暨南大學(xué)理工學(xué)院光電工程系，廣東 廣州 510632；5.暨南大學(xué) 廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣東 廣州 510632）

表面等離子體共振生物芯片無標(biāo)記實時檢測蝦血藍蛋白

李 瑩1,2，齊 攀3，李仕萍1,4，趙明路4，黃建芳5，馬 驍4，王 宏5，鐘金鋼1,4,*

（1.暨南大學(xué) 光電信息與傳感 技術(shù)廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)預(yù)科部， 廣東 廣州 510610；3.廣東交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院電子與通信工程學(xué)院電子工程系，廣東 廣州 510650；4.暨南大學(xué)理工學(xué)院光電工程系，廣東 廣州 510632；5.暨南大學(xué) 廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣東 廣州 510632）

利用自行研制的便攜式表面等離子體共振生物芯片檢測系統(tǒng)，在生物芯片表面分別固定蝦血藍蛋白、蝦血藍蛋白的單克隆抗體、蝦血藍蛋白的單克隆抗體腹水作為生物探針，利用免疫反應(yīng)的特異性，研究蝦血藍蛋白與其單克隆抗體的相互作用，分析動力學(xué)反應(yīng)過程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同一個生物芯片檢測了8 個抗體樣品、7 個未純化的抗體腹水，為現(xiàn)場檢測大量食品中過敏原、檢測臨床血清中過敏原特異性抗體進行基礎(chǔ)研究。表面等離子體共振生物芯片檢測過敏原，儀器便攜、操作簡便、無需標(biāo)記、無污染、成本低，可進行現(xiàn)場大量樣品的實時連續(xù)檢測和快速篩選，適用于超市、集市、工廠等需要實時快速檢測和質(zhì)量監(jiān)控的場所，也可以應(yīng)用于臨床上患者血清樣品的過敏原抗體檢測。

過敏原；表面等離子體共振；生物芯片；無標(biāo)記；快速檢測；免疫反應(yīng)

全世界約有30%～40%的人患有各種各樣的過敏疾病[1]。食品過敏反應(yīng)是機體受同一抗原再次刺激后，表現(xiàn)為組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應(yīng)，臨床表現(xiàn)包括蕁麻疹、皰疹樣皮炎、口腔過敏綜合癥、腸病綜合癥、哮喘及過敏性鼻炎等，甚至?xí)疬^敏性休克，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2-4]。食物過敏是涉及食品安全的重要問題，海產(chǎn)品是其中重要的一類。蝦及其制品味道鮮美，營養(yǎng)豐富，但具有較高的致敏性，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的八大類過敏食物之一，過敏患者中約有20%對蝦過敏，小兒發(fā)病率甚至高達60%，已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[5]。世界很多地區(qū)都出產(chǎn)蝦，產(chǎn)量豐富，隨著水產(chǎn)品貿(mào)易的全球化，水產(chǎn)品的過敏原問題日益受到廣泛關(guān)注，美國食品藥品管理局、歐洲食品安全局、日本和中國香港都先后針對食品中的過敏原成分制定了相應(yīng)的法規(guī)，對過敏原的種類及標(biāo)簽標(biāo)示做出了明確的規(guī)定[6-10]。很多國家對進口食品過敏原標(biāo)簽 的要求越來越嚴(yán)格，食品中過敏原的檢測已成為新的食品國際貿(mào)易技術(shù)壁壘。因此食品中過敏原的檢測、控制與安全評價尤為重要，已成為食品安全研究領(lǐng)域一個重要的課題。因此，蝦過敏原的檢測、過敏反應(yīng)的研究、抗過敏藥物的研制是亟需研究的課題。為現(xiàn)場檢測食品中蝦過敏原、臨床上檢測血清中蝦過敏原特異性抗體，研究特異、靈敏、快捷的方法意義重大。

目前，過敏原的檢測主要是酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），該方法檢測限低，但是檢測過程復(fù)雜，使用的熒光標(biāo)記物污染環(huán)境，儀器價格昂貴，更主要的是ELISA方法需要標(biāo)記抗體，可能影響抗體的生物活性，降低檢測靈敏度，在實際應(yīng)用中受到限制[11-16]。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物芯片不需要標(biāo)記，可對分子間的相互作用進行實時檢測，已被廣泛用于藥物分析、食品分析、環(huán)境監(jiān)測等許多領(lǐng)域[17-25]。本研究采用自行開發(fā)的便攜式SPR生物芯片檢測系統(tǒng)[23-25]，利用免疫反應(yīng)的特異性，研究蝦血藍蛋白與其單克隆抗體的相互作用，分析動力學(xué)反應(yīng)過程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，為現(xiàn)場檢測大量食品中過敏原、檢測臨床血清中過敏原特異性抗體進行基礎(chǔ)研究。與ELISA方法相比，本研究儀器便攜、操作簡便、無需標(biāo)記、無污染、成本低，可進行現(xiàn)場大量樣品的實時連續(xù)檢測和快速篩選，適用于超市、集市、工廠等需要實時檢測的場所進行質(zhì)量監(jiān)控，并有望用于臨床上患者血清樣品的過敏原抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

過敏原為重組蝦血藍蛋白（分子質(zhì)量為80 kD，質(zhì)量濃度為4.62 mg/mL），蝦血藍蛋白（蝦中提?。┘捌鋯慰寺】贵w（質(zhì)量濃度2.1 mg/mL，滴度為16萬）由廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室惠贈[26-27]；巰基十一酸（HS(CH2)10COOH）、巰基己酸（HS(CH2)6OH）、乙醇胺（Eth）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、碳二亞胺（N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimid hydrochlorid，EDC） 美國Sigma公司；其他試劑購自北京化學(xué)試劑公司。免疫反應(yīng)的緩沖液為磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（2 mmol/ L NaH2PO4、2 mmol/L Na2HPO4、150 mmol/L NaCl、pH 7.4），蝦血藍蛋白、蝦血藍蛋白單克隆抗體用PBS稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液。

自主研制了便攜型SPR檢測儀。該儀器為角度掃描型，用Labview軟件編寫控制程序，檢測不同入射角光強的變化，靈敏度高，方法簡便易行。檢測儀由光路系統(tǒng)、機械掃描系統(tǒng)、樣品輸送系統(tǒng)、生物傳感芯片、控制及分析軟件組成[23-25]。

1.2 方法

在直徑20 mm厚度1 mm的圓形玻璃片上沉積50 nm的金。將鍍有金膜的傳感芯片固定到儀器上，安裝好流通系統(tǒng)，通入PBS，基線穩(wěn)定幾分鐘后進行生物芯片的自組裝，流通池中通入1 mmmol/L的HS(CH2)10COOH和HS(CH2)6OH的乙醇溶液，質(zhì)量比為1∶9，對金膜表面進行化學(xué)修飾2 h，然后通入PBS清洗?；€穩(wěn)定后加入0.1 mol/L的NHS和0.1 mol/L的EDC混合液（1∶1，V/V），活化芯片表面15 min，之后用PBS沖洗2 min，這時的基線比活化前略有升高。然后進行生物探針的固定，制備不同用途的生物芯片。在生物芯片表面分別固定蝦血藍蛋白、蝦血藍蛋白的單克隆抗體腹水（未純化），此時SPR響應(yīng)值明顯升高，30 min后完成探針固定，通入PBS沖洗2 min，響應(yīng)值只有小幅下降，說明探針固定效果較好。加入1 mol/L的乙醇胺（pH 8.5）封閉滅活剩余的酯鍵，4～6 min，PBS沖洗后，生物芯片制備完成，可用于下一步的免疫檢測。SPR檢測過敏原的過程如圖1所示。

圖1 SPR生物芯片檢測過敏原的示意圖Fig.1 Schematic of allergen detection by surface plasmon resonance-based chip

2 結(jié)果與分析

2.1 過敏原的固定及抗體的檢測

圖2 SPR生物芯片檢測純化抗體的動力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves showing the dependence of SPR response on antibody concentration by shrimp hemocyanin-fixed SPR biochip

將稀釋20 倍的過敏原——重組蝦血藍蛋白，固定在生物芯片表面，檢測對象是蝦血藍蛋白單克隆抗體，抗體分別稀釋300、200、150、75、50 倍。過敏原作為探針檢測抗體的動力學(xué)曲線如圖2所示。每個樣品檢測時間是330 s，樣品中的抗體與芯片表面的抗原（蝦血藍蛋白）發(fā)生免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體結(jié)合物，SPR響應(yīng)值增大，蝦血藍蛋白與抗體結(jié)合能力較強。隨樣品中抗體質(zhì)量濃度的增大，即稀釋度小，相同反應(yīng)時間，更多的抗體與抗原結(jié)合，SPR響應(yīng)值增大。由圖2可見，330 s時動力學(xué)曲線仍處于上升階段，檢測時間約10 min，曲線不再上升，達到飽和。固定蝦血藍蛋白的生物芯片檢測蝦血藍蛋白抗體的曲線如圖3所示，隨稀釋倍數(shù)的增大，SPR響應(yīng)值下降，呈倒S曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為f（x）=1.959×10－8x3－1.133×10－5x2+0.001 11x+ 0.167 5，R2=0.989。血藍蛋白作為探針檢測特異性抗體的方法適合過敏原抗體篩選、患者血清樣品中過敏原特異性抗體檢測等。

圖3 固定過敏原的SPR生物芯片檢測抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard calibration curve for allergen-specific antibodies by using allergen-fixed SPR biosensor

將質(zhì)量濃度為2.1 mg/mL的蝦血藍蛋白單克隆抗體，分別稀釋200、100、50 倍的抗體質(zhì)量濃度分別為0.010 5、0.021、0.042 mg/mL，記為真實值。將稀釋后的蝦血藍蛋白單克隆抗體作為待測樣品通入流通池，與SPR生物芯片上的探針發(fā)生免疫反應(yīng)，對芯片反應(yīng)區(qū)進行SPR掃描，記錄SPR共振角的變化，獲得未知樣品的SPR動力學(xué)曲線，結(jié)合圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出未知樣品中抗體的質(zhì)量濃度，作為檢測值，檢測值與真實值進行對比，如表1所示。檢測值與真實值的絕對偏差均較小，其相對偏差亦較小，說明SPR生物芯片檢測系統(tǒng)具有良好的預(yù)測能力，實驗方法可行。2.2 同一芯片檢測多個樣品

表1 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測蝦血藍蛋白單克隆抗體的結(jié)果分析Table1 Analysis of monoclonal antibodies against shrimp hemocyanin by standard curve

SPR生物芯片可以連續(xù)檢測多個樣品，能進行大量樣品的現(xiàn)場檢測和初步篩選。在生物芯片表面固定稀釋20 倍的重組蝦血藍蛋白，連續(xù)檢測了8 個蝦血藍蛋白抗體樣品和7 個未純化的腹水抗體樣品，效果良好。生物芯片制備和檢測15 個樣品的動力學(xué)過程如圖4所示。通過實驗驗證生物芯片檢測樣品的穩(wěn)定性。用固定過敏原（重組蝦血藍蛋白）的同一芯片連續(xù)檢測1 組稀釋10 倍的蝦血藍蛋白抗 體樣品，結(jié)果顯示，至少可以穩(wěn)定地連續(xù)檢測70 個樣品，如圖5所示，超過70 個樣品，檢測靈敏度明顯降低，芯片需再生。

圖4 同一芯片檢測多個樣品的動力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curves for different samples detected with the same chip

圖5 連續(xù)檢測樣品的穩(wěn)定性測試Fig.5 Stability of continuous detection of samples

2.2.1 抗原的固定及抗體的檢測

圖6 固定過敏原的同一生物芯片檢測抗體Fig.6 Kinetic curves for a group of allergen-specific antibody samples detected by the same allergen-fixed biosensor

如圖4所示，階段1是PBS基線，2是芯片活化的過程，3是活化后的芯片用PBS清洗，這時SPR響應(yīng)值比基線略有上升。4是抗原（重組蝦血藍蛋白）固定，5是固定后用PBS清洗，此時SPR響應(yīng)值僅略有下降，與3相比升幅較大，說明生物芯片表面的探針固定率高，固定效果良好，蝦血藍蛋白與芯片表面的結(jié)合能力較強。6是封閉的過程，7為用PBS清洗。8、9、11～16階段分別記錄了稀釋1 500、1 000、500、400、200、100、50、10 倍的抗體與芯片表面生物探針的 免疫反應(yīng)，SPR響應(yīng)值增大，動力學(xué)曲線為上升趨勢。SDS-HCl溶液可以使抗原-抗體結(jié)合物解離，每個樣品檢測完都通入SDS-HCl溶液洗脫，10～15 s，例如階段10、24，其他洗脫過程未標(biāo)出。每次免疫反應(yīng)完成后、洗脫（注入SDS-HCl溶液）完成后，都通入PBS溶液清洗，圖中未做標(biāo)示。依據(jù)圖4得出的固定蝦血藍蛋白的生物芯片檢測抗體的動力學(xué)曲線如圖6所示，4 條曲線分別記錄了稀釋10、100、500、1 500 倍的抗體與生物芯片表面抗原的免疫反應(yīng)。隨著樣品稀釋倍數(shù)的增加，SPR響應(yīng)值下降。稀釋1 500 倍的樣品，仍能檢測到免疫反應(yīng)，如果延遲反應(yīng)時間，可以檢測到稀釋倍數(shù)更高的樣品，檢測限可降低。

2.2.2 抗原的固定及抗體腹水的檢測

圖4中后半段為檢測完1組純化抗體樣品的芯片繼續(xù)連續(xù)檢測1組未純化的抗體腹水樣品，17～23分別記錄了稀釋150、100、80、50、40、20、10 倍的抗體腹水的免疫反應(yīng)。圖7為依據(jù)圖4得出的稀釋10、50、100、150 倍的抗體腹水免疫反應(yīng)的動力學(xué)曲線。檢測每個樣品時，隨免疫反應(yīng)的進行，SPR響應(yīng)值增大。不同樣品，相同反應(yīng)時間，當(dāng)稀釋倍數(shù)增加，SPR響應(yīng)值降低。該方法檢測的是未純化的抗體腹水，有望直接用于臨床初步篩查，檢測患者血清中的過敏原特異性抗體，檢測速度快，每個樣品檢測時間為3～4 min。

圖7 固定蝦血藍蛋白的同一生物芯片檢測抗體腹水Fig.7 Kinetic curves showing the dependence of SPR response on antiallergen antibodies in ascites with the same biochip

2.3 抗體腹水的固定及過敏原的檢測

圖8 未純化抗體腹水檢測蝦血藍蛋白Fig.8 Responses to allergen detected using biosensor with unpurified ascites antiboby fixed on its surface

為探索大量食品中過敏原的檢測與安全評價，本研究在生物芯片表面固定稀釋100 倍的未純化抗體腹水，作為生物探針，檢測抗原-蝦血藍蛋白，該蝦血藍蛋白為蝦中提取，不是重組蛋白。抗原分別稀釋10、50、100 倍，檢測時間為3～5 min。如圖8所示，3 種質(zhì)量濃度的樣品檢測3 min時的SP R共振曲線，隨樣品質(zhì)量濃度升高，共振角增大，共振曲線右移。該方法使用未純化抗體腹水作為探針，降低了成本，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，便于進行大量樣品的初步篩查。與ELISA方法相比，SPR生物芯片檢測方法不需要標(biāo)記和二抗，對環(huán)境無污染，不影響抗體生物活性，有利于提高檢測靈敏度。

3 討 論

過敏原又稱為變應(yīng)原，是能誘導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)的抗原；過敏反應(yīng)，又稱變態(tài)反應(yīng)，是異常、有害、病理性的免疫反應(yīng)[5,28-30]。蝦過敏屬于Ⅰ型過敏反應(yīng)，其機理是過敏原進入機體后，誘發(fā)能合成IgE的B細胞產(chǎn)生特異性IgE，IgE與肥大細胞、嗜堿性顆粒細胞結(jié)合成為致敏靶細胞。IgE一旦與靶細胞結(jié)合，機體就會呈現(xiàn)致敏狀態(tài)。當(dāng)機體再次接觸同樣的過敏原刺激時，再次進入的相同過敏原與已經(jīng)結(jié)合的靶細胞上的IgE結(jié)合發(fā)生特異性反應(yīng)，引起水腫、哮喘、蕁麻疹、腹瀉等過敏癥狀，伴隨著患者血清IgE水平升高。目前國內(nèi)對過敏性疾病的實驗診斷，主要采用過敏原檢測和特異性IgE、IgG檢測法，檢測試劑主要依賴進口，檢測費用較高。同時，食品中過敏原的檢測、控制與安全評價是食品安全領(lǐng)域的重要課題。

SPR生物芯片檢測過敏原及單克隆抗體，為直接法檢測，靈敏度比間接ELISA方法低，但設(shè)備便攜、實驗操作簡單、成本低廉、檢測時間短、不需標(biāo)記、不使用二抗、不影響抗體的生物活性，對環(huán)境無污染，適合大量樣品的現(xiàn)場檢測和快速篩查。本研究使用的蝦血藍蛋白和單抗，間接ELISA實驗抗原包被質(zhì)量濃度為100 μg/mL，OD值為1時抗體的質(zhì)量濃度為46.2 ng/mL（該數(shù)據(jù)由廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室提供）。SPR生物芯片方法為我國食品安全領(lǐng)域過敏原的檢測、臨床診斷、蝦過敏原疫苗設(shè)計和制定我國食品過敏原標(biāo)簽管理提供了一定的技術(shù)基礎(chǔ)，為食品過敏原的檢測和食品中致敏成分的標(biāo)識管理提供技術(shù)支持。

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A Label-Free Surface Plasmon Resonance Biochip for in Situ Detection of Shrimp Hemocyanin

LI Ying1,2, QI Pan3, LI Shiping1,4, ZHAO Minglu4, HUANG Jianfang5, MA Xiao4, WANG Hong5, ZHONG Jingang1,4,*
(1. Key Laboratory of Optoelectronic Information and Sensing Technologies of Guangdong Higher Education Institutes, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Department of Pre-university, Jinan University, Guangzhou 510610, China; 3. Department of Electronics Engineering, School of Electronics and Communication Engineering, Guangdong Communication Polytechnic, Guangzhou 510650, China; 4. Department of Optoelectronic Engineering, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 5. Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering of Guangdong Province, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

In this paper, a rapid label-free method to analyze the immune response to allergens by using a portable surface plasmon resonance (SPR) biochip was presented. Shrimp hemocyanin, monoclonal antibody against shrimp hemocyanin, and ascites fluid containing the monoclonal antibody were immobilized onto the surface of the biochip as probes, respectively. The biochip was then used to detect the immune response between shrimp hemocyanin and the corresponding monoclonal antibody. The kinetics of the reaction was analyzed, and the standard curve was constructed. Eight different batches of samples and seven different batches of unpurified ascites were detected on the same chip. This method allowed real-time, label-free, low-cost, environment-friendly and easy-to-control detections. It was suitable for real-time and continuous detectio n and rapid screening of a large number of samples. The developed portable SPR biochip detection system can be widely applicable to real-time rapid detection and quality control in factories, markets, supermarkets and other fields. It can also be applied in the clinical detection of allergen-specific antibody in serum of patients.

allergen; surface plasmon resonance; biochip; label-free; rapid detection; immunoreaction

10.7506/spkx1002-6630-201712036

TS254；R155.5

A

1002-6630（2017）12-0234-06

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（41206081；61605063）；廣東省自然科學(xué)基金項目（2014A030310483；2015A030310458）；廣東省高等職業(yè)院校珠江學(xué)者崗位計劃資助項目（2016年度）

李瑩（1976—），女，教授，博士，研究方向為食品安全檢測、生物醫(yī)學(xué)信息技術(shù)。E-mail：916407691@qq.com

*通信作者：鐘金鋼（1964—），男，教授，博士，研究方向為光電信息獲取與處理、生物醫(yī)學(xué)光學(xué)。E-mail：tzjg@jnu.edu.cn

李瑩, 齊攀, 李仕萍, 等. 表面等離子體共振生物芯片無標(biāo)記實時檢測蝦血藍蛋白[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 234-239.

10.7506/spkx1002-6630-201712036. http：//www.spkx.net.cn

LI Ying, QI Pan, LI Shiping, et al. A label-free surface plasmon resonance biochip for in situ detection of shrimp hemocyanin[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 234-239. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712036. http：//www. spkx.net.cn