基于間接競爭法的表面等離子共振免疫傳感技術(shù)檢測雌二醇

賈映彤，彭 媛，白家磊，張希浩，寧保安，高志賢,*，崔建升*

（1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300050）

基于間接競爭法的表面等離子共振免疫傳感技術(shù)檢測雌二醇

賈映彤1,2，彭 媛2，白家磊2，張希浩2，寧保安2，高志賢2,*，崔建升1,*

（1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300050）

建立一種基于間接競爭法的表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）免疫傳感技術(shù)檢測雌二醇（estradiol，E2），這種方法無需標(biāo)記，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測競爭過程。在間接競爭實(shí)驗(yàn)中，E2和E2的單克隆抗體（monoclonal antibody，E2-mAb）等體積混合后共同競爭被固定在了SPR傳感器的芯片表面的E2-牛血清白蛋白包被原（E2-bovine serum albumin，E2-BSA），SPR產(chǎn)生的信號和E2的質(zhì)量濃度呈反比。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)如抗體質(zhì)量濃度、再生次數(shù)等，最后再用全脂牛奶做E2的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的線性范圍為15.63～500 ng/mL，最低檢出限為11.13 ng/mL。本研究的SPR免疫傳感技術(shù)構(gòu)建了一種通用的方法，可以用來無標(biāo)記檢測其他不同的小分子。

表面等離子共振；無標(biāo)記；雌二醇；實(shí)時(shí)；間接競爭

雌二醇（estradiol，E2）屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1]，是一種自然產(chǎn)生的雌激素[2]?，F(xiàn)今越來越多的養(yǎng)殖場在飼料中會(huì)加入過量的E2作為生長促進(jìn)劑來促進(jìn)動(dòng)物食欲、增加動(dòng)物體重、使蛋白轉(zhuǎn)化率提高來增加瘦肉比率從而提高產(chǎn)率[3]。但是過量的E2會(huì)通過食物鏈富集在如牛奶、雞肉等動(dòng)物性農(nóng)產(chǎn)品中，對人體造成嚴(yán)重的危害。E2會(huì)使男性的生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能異常，精子數(shù)量和質(zhì)量下降[4]，嚴(yán)重時(shí)甚至引發(fā)尿道下裂、性腺萎縮和睪丸癌等疾病[5]。研究表明，長期暴露在雌激素下的職業(yè)男性患陽痿的幾率會(huì)大大增加[6]。而外源性的E2也會(huì)引起女性的月經(jīng)不調(diào)、卵巢萎縮等疾病，引起流產(chǎn)甚至不孕、子宮內(nèi)膜異位，卵巢癌等疾病，女性組子宮肌瘤、宮頸癌等疾病也被證實(shí)與E2有關(guān)[7]。E2的殘留還會(huì)使女性兒童提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育呈女性化的趨勢[8]，由于嬰幼兒身體的組織和器官血液分布尚未建立用來阻止或減緩?fù)獠课廴疚锏钠琳蟍9]，所以E2對嬰幼兒和青少年兒童比成人的毒性更大。因此，考慮到食品安全問題，需要有效的檢測技術(shù)來檢測E2。

目前針對食品中的E2的檢測方法眾多，主要包括如化學(xué)發(fā)光[10]、氣相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12]，高效液相色譜[13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]，然而這些方法需要繁瑣的程序和復(fù)雜的預(yù)處理過程[143]，所以不適合快速和實(shí)時(shí)檢測食品中的E2殘留。最近十幾年，不同的生物方法被用于檢測E2，如酶聯(lián)免疫分析[15]、電化學(xué)傳感器[16]、酶熱傳感器[17]和表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器等[18]。

現(xiàn)在SPR傳感器由于其無需標(biāo)記、可以實(shí)時(shí)快速動(dòng)態(tài)檢測的優(yōu)點(diǎn)[19]已經(jīng)成為了最有希望用于生物痕量檢測的技術(shù)之一[20]。當(dāng)傳感器芯片表面和分析物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，SPR傳感器可以精確檢測到折射率的變化[21]，SPR傳感技術(shù)已經(jīng)得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用。SPR傳感器研究對象最初主要是病毒、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、藥物、細(xì)胞、多肽、RNA類脂等物質(zhì)，而隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，SPR傳感技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測[22]、食品安全[23]、遺傳分析[24]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)基于間接競爭法利用SPR免疫傳感技術(shù)定量檢測E2，將完全抗原固定在芯片表面之后注入靶標(biāo)小分子與一定質(zhì)量濃度抗體的混合液，使表面固定的完全抗原和溶液中的被測分析物競爭結(jié)合溶液中抗體，所以當(dāng)溶液中被測分析物質(zhì)量濃度減少時(shí)，芯片表面抗原結(jié)合的抗體就變多，SPR的響應(yīng)信號就大，即SPR傳感器的信號變化與被測物的質(zhì)量濃度呈反比。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了E2-mAb、E2-BSA質(zhì)量濃度、再生次數(shù)、再生液等條件，以牛奶為試劑樣品做了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，擬建立一種基于間接競爭法的SPR免疫傳感技術(shù)檢測E2的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶 天津市購。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫20、乙醇胺等試劑均為國產(chǎn)分析純；E2、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 百靈威科技有限公司；E2-BSA、E2-mAb由實(shí)驗(yàn)室自制[25]。

E2-mAb用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4，用前超聲脫氣）溶解；E2-BSA溶解于0.01 mol/L的醋酸鹽緩沖液（NaAc-HAc，pH 4.5）中；E2溶解于含5%甲醇的PBS中；封閉液為1 mol/L，pH 8.5的乙醇胺溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Autolab ESPRIT SPR傳感器 荷蘭Eco Chemie B.V.公司；AL-204分析天平 美國Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 E2包被原的固定及其穩(wěn)定性分析

將SPR芯片（表面鍍有金膜）用預(yù)先配制的Pirahha洗液（V（H2SO4）∶V（H2O）=7∶3）浸泡1～2 h以除去所有的有機(jī)物質(zhì)，使金芯片羥基化[26]，取出洗凈，氮?dú)獯蹈伞崈舻腟PR芯片浸入1 mmol/L 11-巰基十一烷（11-mercaptoundecanoic acid，MUA）溶液中，室溫過夜，使芯片上自組裝上羧基，取出后用去離子水和無水乙醇交替沖洗，氮?dú)獯蹈伞?/p>

將SPR芯片裝入傳感器中，以pH 4.5的醋酸鹽緩沖溶液做為偶合緩沖溶液，在反應(yīng)池中依次加入0.4 mol/L的EDC和0.1 mol/L的NHS溶液來活化芯片表面的羧基，用來進(jìn)行抗原的固定。之后用偶合溶液配制一定質(zhì)量濃度的E2-BSA，以pH 8.5的乙醇胺為封閉液，0.05 mol/L的NaOH溶液為再生溶液，緩沖溶液作參比。將這些溶液加入樣品池進(jìn)行固定化程序。

E2-BSA固定好后，每天檢測同一質(zhì)量濃度的E2抗體（14.22 μg/mL），考察E2-BSA的穩(wěn)定性。

1.3.2 間接競爭實(shí)驗(yàn)

檢測流程如圖1所示。將一定質(zhì)量濃度的抗體，與不同質(zhì)量濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)液等體積混合后室溫孵育加入樣品池中（混合后E2終質(zhì)量濃度分別為3.91、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ng/mL）使E2和E2-BSA共同競爭E2-mAb，然后分別測定SPR響應(yīng)值。在循環(huán)測試后會(huì)用再生液將和E2-BSA結(jié)合的E2-mAb洗掉從而對芯片進(jìn)行再生。為保證檢測結(jié)果的重復(fù)性，每次實(shí)驗(yàn)均測量3 次。

圖1 間接競爭法的檢測流程Fig.1 Schematic diagram of estradiol detection, including E2-BSA immobilization, E2and E2-BSA competition for E2-mAb and regeneration

1.3.3 特異性實(shí)驗(yàn)

選擇E2的結(jié)構(gòu)和功能類似物：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚、雌酮和雌三醇。將這些物質(zhì)分別配制成不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用間接競爭法進(jìn)行檢測，考察該方法的特異性。

1.3.4 牛奶樣品的處理

奶樣中每100 mL含蛋白質(zhì)3.0 g、脂肪3.5 g、碳水化合物5.0 g、鈉50 mg。1 mL不同質(zhì)量濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)液分別加入1 mL的牛奶樣品中，然后加入等體積的乙酸乙酯到牛奶樣品，因?yàn)橄嗨葡嗳茉韽亩鴮⑵渲械腅2萃取出來。輕輕振蕩靜置至分層，取上層乙酸乙酯并用氮?dú)獯蹈?，最后? mL含5%甲醇的PBS定容。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2-BSA的固定質(zhì)量濃度的優(yōu)化

圖2 不同質(zhì)量濃度的E2-BSA產(chǎn)生的SSPPRR信號Fig.2 SPR signal response to different E2-BSA concentrations

不同質(zhì)量濃度的E2-BSA與SPR信號變化關(guān)系如圖2所示，可以看出隨著E2-BSA質(zhì)量濃度的增加，傳感信號變化增大，這說明E2-BSA在芯片表面的固定量逐漸增大，在1.0 mg/mL處固定量幾乎接近飽和，所以選擇1.0 mg/mL為E2-BSA的最佳固定質(zhì)量濃度。

由于E2-BSA固定在SPR的芯片表面之后，不可能再將其取出保存到4 ℃中，只能加入PBS密封保存，所以有必要考察E2-BSA在該保存條件下的穩(wěn)定性。在SPR芯片表面固定優(yōu)化好的質(zhì)量濃度即1 mg/mL的E2-BSA，然后每天測定混合后質(zhì)量濃度為7.11 μg/mL抗體產(chǎn)生的SPR響應(yīng)。將第1次檢測到的SPR信號記為R0，以后每天檢測到的SPR信號記為R，以R/R0為縱坐標(biāo)，作為對穩(wěn)定性的參考，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，第5天時(shí)仍能產(chǎn)生75%以上的響應(yīng)，第7天才降至50%以下，表明直接固定在芯片上的E2-BSA穩(wěn)定性良好。

圖 33 EE2-BSA的穩(wěn)定性Fig.3 Study of antigen stability

2.2 最佳抗體質(zhì)量濃度的選擇

將一系列質(zhì)量濃度梯度稀釋的E2-mAb分別加入樣品池，使抗體和E2-BSA特異性結(jié)合，之后用PBS沖掉非特異性吸附，以PBS為參比溶液，觀察SPR信號，最終確定最佳使用質(zhì)量濃度。

間接競爭反應(yīng)中抗體用量應(yīng)遵從的原則：為使待測液中的E2小分子與芯片表面固定的E2-BSA能夠有效地與E2-mAb競爭，所用抗體的量需要接近其和芯片表面抗原特異性結(jié)合時(shí)達(dá)到飽和時(shí)的用量[27]。用不同的抗體質(zhì)量濃度和對應(yīng)的SPR信號變化如圖4所示，可以看出混合后最終質(zhì)量濃度為7.11 μg/mL的E2-mAb就可以產(chǎn)生足夠的SPR響應(yīng)信號，曲線也進(jìn)入平臺(tái)期，說明芯片表面結(jié)合的抗體趨于飽和，所以選擇7.11 μg/mL的抗體作為最佳質(zhì)量濃度抗體進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同質(zhì)量濃度抗體產(chǎn)生的SPR信號Fig.4 SPR signal with different concentrations of E2-mAb

2.3 再生條件的優(yōu)化

分別用0.1 mol/L鹽酸溶液、0.1 mol/L鹽酸+0.1% SDS溶液、0.1 mol/L鹽酸+0.1% TritonX-100、0.05 mol/ L NaOH溶液進(jìn)行再生，每次再生時(shí)為120 s。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.05 mol/L NaOH溶液可以去除99.70%的結(jié)合抗體。0.1 mol/L鹽酸+0.1% SDS溶液可以去除97.03%的結(jié)合抗體，而0.1 mol/L鹽酸+ 0.1% Triton X-100可以去除98.57%的結(jié)合抗體，0.1 mol/L鹽酸溶液能去除94.10%的結(jié)合抗體。所以選擇0.05 mol/L NaOH溶液作為再生液。

同時(shí)研究再生次數(shù)對金膜表面的E2-BSA活性的影響。檢測同一最終質(zhì)量濃度為7.11 μg/mL的抗體，以0.05 mol/L NaOH溶液為再生液。由圖5可以看出，經(jīng)過38 次的再生，抗體產(chǎn)生的信號同第一次的信號比較依然在75%以上，表明固定在SPR芯片上的抗原在多次再生之后依然可以保持良好的活性，重復(fù)性良好。

圖5 再生次數(shù)對E2-BSA穩(wěn)定性的影響Fig.5 Influence of number of regenerations on the stability of E2-BSA

2.4 間接競爭實(shí)驗(yàn)結(jié)果

E2-BSA固定化質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，將14.22 μg/mL的抗體，與一系列質(zhì)量濃度梯度的E2標(biāo)準(zhǔn)液（3.1～1 000 ng/mL）等體積混合，進(jìn)行間接競爭實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測曲線如圖6所示，包括基線、競爭、洗去非特異性吸附和再生。

圖6 SPR間接競爭實(shí)時(shí)監(jiān)測曲線Fig.6 Real-time monitoring curve of indirect competition

間接競爭結(jié)果如圖7a所示，可以看出隨著E2質(zhì)量濃度的增加，SPR傳感信號顯著降低，競爭明顯。以E2小分子質(zhì)量濃度為0時(shí)的SPR響應(yīng)值為R0，一定質(zhì)量濃度E2的響應(yīng)值為R，抑制率/%＝（R0－R）/R0×100。以E2質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，對E2質(zhì)量濃度取對數(shù)即以lgC（E2）繪制間接競爭抑制曲線（圖7b）。

圖7 不同質(zhì)量濃度E2的SPR信號（a）和間接競爭抑制回歸曲線（bb）Fig.7 Indirect competition results (a) and indirect competitive inhibition regression curve (b)

根據(jù)3 倍信噪比（RSN=3）原理，計(jì)算出方法的最低檢出限為11.13 ng/mL。檢測范圍為15.63～500 ng/mL，y=0.200 3x－0.125 56，R2為0.996 82。

此外，將其他檢測E2的方法測定的檢出限和線性范圍同本實(shí)驗(yàn)方法做了對比，結(jié)果如表1所示，和其他方法相比，本實(shí)驗(yàn)擁有更低的檢測限和更寬的線性范圍。并且本實(shí)驗(yàn)無需標(biāo)記，可以實(shí)時(shí)觀察信號的變化和競爭的情況，一次間接競爭的過程僅需要約20 min。2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 其他方法和本實(shí)驗(yàn)方法的比較Table1 Comparison of the developed label-free immunoassay with other reported methods for the detection of E

首先參照趙金蓮等[30]的實(shí)驗(yàn)，通過高效液相色譜分析驗(yàn)證了牛奶樣品中并無E2檢出，未加標(biāo)準(zhǔn)品和加了E2標(biāo)準(zhǔn)品（250、125、62.5、20.0 ng/mL）的經(jīng)過簡單處理的牛奶樣品用間接競爭法計(jì)算加標(biāo)回收率，每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行測定6 次。在用乙酸乙酯萃取時(shí)奶中的脂肪等有機(jī)物質(zhì)可能也被萃取出來，但是由于本實(shí)驗(yàn)原理依據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，即小分子和抗原只和體系中的抗體競爭結(jié)合不會(huì)和萃取出的有機(jī)物質(zhì)結(jié)合，并且在SPR檢測程序中可以去除非特異性吸附，所以牛奶中的某些脂肪等物質(zhì)對加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)影響很小。如表2所示，加標(biāo)回收率在90.57%～8.47%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在4.65%～12.28%之間，說明該方法準(zhǔn)確可靠，也證明了可能被萃取出的脂肪等有機(jī)物質(zhì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以用于實(shí)際牛奶樣品的測定。在實(shí)際應(yīng)用中如果待檢測的樣品E2質(zhì)量濃度較低時(shí)，可以采取一個(gè)富集濃縮的步驟來檢測E2殘留。

表 22 EE2加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table2 Recovery of E2from spiked milk

2.6 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇E2的功能結(jié)構(gòu)和類似物：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚、雌酮和雌三醇進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。將各類似物的不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液、5 種類似物和E2的混合液（即6 種物質(zhì)全部混合，混合液中6 種物質(zhì)質(zhì)量濃度相同，分別是500、250、125 ng/mL）分別與E2-mAb等體積混合（混合后的最終質(zhì)量濃度分別為250、125、62.5 ng/mL），然后用與2.4節(jié)相同的方法進(jìn)行間接競爭法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8所示，抑制率反映了各目標(biāo)物與E2-mAb之間的反應(yīng)程度，抑制率越高，表明目標(biāo)物與抗體結(jié)合的越多。所有類似物的抑制率均低于7%，表明它們幾乎不與抗體結(jié)合，并且6 種混合物的特異性與只有E2的特異性基本一致，所以其他類似物對檢測E2幾乎無影響。該方法的特異性良好。

圖8 E8 E2及其類似物的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Specificities for E2and its analogues

3 結(jié) 論

建立了基于間接競爭法的無需標(biāo)記的用于檢測E2殘留的SPR免疫傳感技術(shù)，得到了良好的回收率和線性范圍。在優(yōu)化條件下，得到了15.63～500 ng/mL的線性范圍，最低檢出限為11.13 ng/mL。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，樣品的前處理過程操作簡單、耗時(shí)少（單個(gè)樣品約20 min），具有可觀的應(yīng)用前景。檢測中以固定在芯片上的抗原為傳感層，實(shí)現(xiàn)了更換抗原-抗體即可更換檢測目標(biāo)物的目的，這樣使這一傳感技術(shù)有良好的通用性，即本研究提供了一種簡單實(shí)時(shí)無需標(biāo)記的方法可以用于檢測其他類型的小分子。

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A Label-Free Immunoassay with a Surface Plasmon Resonance Biosensor for the Determination of Estradiol in Milk

JIA Yingtong1,2, PENG Yuan2, BAI Jialei2, ZHANG Xihao2, NING Bao’an2, GAO Zhixian2,*, CUI Jiansheng1,*
(1. School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety, Institute of Health and Environment Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

A surface plasmon resonance (SPR) biosensor system was developed for the determination of estradiol (E2) using an indirect competition method without labeling in real time. In the indirect competition method, the antigen (E2-BSA) was immobilized on the sensor chip surface and competed with E2in samples for binding with the antibodies. Then the SPR response decreased in the presence of E2, which prevented the coupling of antibodies and E2-BSA, and so the SPR response was inversely proportional to E2concentration. Assay parameters, including antibody concentration and number of regenerations, were optimized and E2-spiked milk samples were detected by this method. A linear relationship was obtained between inhibition percentage and common logarithmic value of E2concentration over the range of 15.63 to 500 ng/mL and the limit of detection (LOD) was 11.13 ng/mL. The present study demonstrated a simple and general strategy for label-free detection of various small molecules.

surface plasmon resonance (SPR); label-free; estradiol; real-time; indirect competition

10.7506/spkx1002-6630-201712034

X836

A

1002-6630（2017）12-0223-06

賈映彤, 彭媛, 白家磊, 等. 基于間接競爭法的表面等離子共振免疫傳感技術(shù)檢測雌二醇[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 223-228.

10.7506/spkx1002-6630-201712034. http：//www.spkx.net.cn

JIA Yingtong, PENG Yuan, BAI Jialei, et al. A label-free immunoassay with a surface plasmon resonance biosensor for the determination of estradiol in milk[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 223-228. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712034. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21207161）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81472985）；軍隊(duì)重大專項(xiàng)（AWS15J006）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（15JCYBJC51200）

賈映彤（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：15614135637@163.com

*通信作者：高志賢（1966—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榧{米技術(shù)、食品安全和生物傳感器。E-mail：gaozhx@163.com崔建升（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境監(jiān)測技術(shù)。E-mail：cui1603@163.com