一種基于多重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)熔解曲線分析的肉及肉制品摻假鑒別方法

周 彤，李家鵬*，李金春，喬曉玲*，黃 鑫，陳 曦，楊君娜，郭 雅

（中國肉類食品綜合研究中心 肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

一種基于多重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)熔解曲線分析的肉及肉制品摻假鑒別方法

周 彤，李家鵬*，李金春，喬曉玲*，黃 鑫，陳 曦，楊君娜，郭 雅

（中國肉類食品綜合研究中心 肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

為實現(xiàn)肉及肉制品摻假快速鑒別，分別以豬、牛線粒體DNA的COXⅠ，綿羊、山羊、狗、狐貍、貉線粒體DNA的16S rRNA及雞、鴨線粒體DNA的12S rRNA基因為靶位點，設(shè)計擴增產(chǎn)物熔解溫度（Tm值）具有顯著性差異的特異性引物，建立一種用于快速鑒別肉或肉制品中豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉9 種源性成 分的5重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)熔解曲線分析方法，通過特異性、靈敏度及市售樣品的檢測，對該方法進行檢驗和評價。結(jié)果表明：方法具有良好的特異性 及靈敏度，單物種DNA檢出限為0.001～1 ng，多物種混合DNA檢出限均為0.1 ng，通過市售樣品檢測表明該方法可用于實際樣品（包括生鮮樣品和熟制樣品）摻假的快速鑒別。

肉類摻假；多重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)；熔解曲線分析；SYBR Green染料；動物源性成分

近年來國內(nèi)外肉類摻假事件頻發(fā)，巨大的價格差異驅(qū)動著一些不法經(jīng)營者以低價肉替代高價肉而未在標簽上注明來降低成本。這不僅嚴重侵害了消費者利益，而且更嚴重的是造成惡劣的社會影響，對整個肉類產(chǎn)業(yè)也會造成巨大傷害，因此急需開發(fā)可靠的真?zhèn)舞b別技術(shù)，保護消費者權(quán)益和肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

目前，應(yīng)用DNA分子序列特異性開發(fā)動物源性成分檢測技術(shù)仍是該領(lǐng)域的研究焦點和主流，也是多數(shù)國家檢測方法標準中指定的檢測方法，基于DNA序列特異性的動物源性檢測技術(shù)中以聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）技術(shù)應(yīng)用最為廣泛[1-9]，單重PCR檢測物種少、檢測效率低、檢測成本高，因此多重PCR技術(shù)逐漸成為研究熱點，多重PCR技術(shù)的開發(fā)是提高摻假鑒別檢測效率與通量、簡化檢測流程的最有效途徑之一。此項技術(shù)保留了常規(guī)PCR特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢，同時又簡化了操作步驟、縮短了檢測周期、降低了人員和試劑耗材成本[10]，滿足了當前動物源性成分檢測技術(shù)快速、簡便、低成本的趨勢和需求，引起了國內(nèi)外學者的巨大關(guān)注。Matsunaga等[11]首次將常規(guī)多重PCR技術(shù)應(yīng)用在物種鑒定上，近些年，國內(nèi)[12-16,21]及國外學者[17-20,22-23]應(yīng)用常規(guī)多重PCR與電泳結(jié)合的技術(shù)進行了多種動物源性成分檢測的研究，但此方法存在無法定量、流程復雜、污染環(huán)境等缺點和局限性。多重實時熒光PCR（real-time fluorescent-PCR，RT-PCR）技術(shù)克服了上述問題，在不需要電泳的情況下可實現(xiàn)高靈敏度檢測[24-27]。Safdar等[28]應(yīng)用SYBR Green雙重RT-PCR熔解曲線分析方法實現(xiàn)了飼料中牛和禽類源性成分的檢測，還應(yīng)用EvaGreen雙重RT-PCR熔解曲線分析方法實現(xiàn)了香腸中牛肉和大豆源性成分的同步快速測定[29]。

由于引物設(shè)計方法局限和多重PCR體系間干擾等因素，現(xiàn)有文獻報道能同時檢測的成分數(shù)多為5 個及以下且檢出限較高。本實驗應(yīng)用引物的簡并性設(shè)計，即尋找遺傳相近的物種（雞鴨、狗狐貉、山羊綿羊等）通用而與其他物種特異的DNA序列來設(shè)計引物，實現(xiàn)不增加PCR反應(yīng)重數(shù)的前提下，提高可檢測物種的種類，開發(fā)一種基于5重RT-PCR熔解曲線分析的肉及肉制品中豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉9 種源性成分的同步鑒別方法，為相關(guān)部門提供可靠的技術(shù)手段和執(zhí)法依據(jù)，具有巨大的市場需求和廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉 北京資源公司；牛肉 北京御香苑畜牧有限公司；綿羊、山羊肉 內(nèi)蒙古金戈爾有機畜牧有限公司；雞肉、鴨肉、狗肉、狐貍?cè)?、貉子肉、鹿肉、驢肉、胖頭魚肉、馬肉 市購；貓血、鼠血 北京某寵物醫(yī)院采集。

DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒 凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；SYBR Green酶體系預混液、8聯(lián)排RT-PCR反應(yīng)管 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；引物合成由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Prep多樣品均質(zhì)儀 美國Omni公司；BT224S分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；S-100渦旋振蕩器 大洋科學工業(yè)株式會社；5417 C/R型離心機 艾本德中國有限公司；Cascada BIO超純水系統(tǒng) 美國頗爾公司；GI54DWS全自動高壓滅菌器 美國致微（廈門）儀器有限公司；Synergy H4多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；LightCycler 480實時熒光PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉類組織DNA提取

將肉去筋膜、剪碎，按照肉水比1∶4（m/m）準確稱取并進行勻漿，均質(zhì)儀轉(zhuǎn)速13 000 r/min，勻漿時間10 min，吸取100 μL勻漿液于1.5 mL離心管中，采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取DNA，DNA溶解于100 μL TE緩沖液中，4 ℃保存，利用酶標儀測定DNA的純度及濃度。

1.3.2 適用于多重RT-PCR熔解曲線分析（Tm值顯著性差異）的物種特異性引物設(shè)計

利用Mega 5.1軟件將不同物種線粒體DNA上某一特定基因序列對齊比較，選取物種間序列變異大、種內(nèi)亞種序列保守的區(qū)域應(yīng)用引物設(shè)計軟件Oligo 7.0進行物種特異性引物的設(shè)計，以豬、牛線粒體DNA的COXⅠ基因，綿羊、山羊、狗、狐貍、貉線粒體DNA的16S rRNA基因及雞、鴨線粒體DNA的12S rRNA基因為靶位點設(shè)計各特異性引物。

由于本方法是基于各物種特異性引物擴增產(chǎn)物的Tm值的顯著性差異所建立的，因此選擇如表1中所示的5 對引物作為多重RT-PCR引物組合，進行后續(xù)研究，其中，羊特異性引物可同時擴增綿羊和山羊源性成分；雞鴨特異性引物可同時擴增雞源性和鴨源性成分；狗狐貉特異性引物可同時擴增狗源性、狐貍源性和貉源性成分。

表1 多重RT-PCR反應(yīng)引物信息Table1 Multiplex RT-PCR primer sequences used in this study

1.3.3 多重RT-PCR反應(yīng)

多重RT-PCR反應(yīng)體系（總體積為20 μL）如表2所示。多重RT-PCR擴增反應(yīng)及熔解曲線制作條件為：95 ℃、5 min預變性；95 ℃、10 s變性；57 ℃、45 s退火+延伸，30 個循環(huán)；熔解曲線制作：95 ℃、1 min，70 ℃、1 min，以0.02 ℃/s速率升溫至95 ℃，同時連續(xù)檢測熒光強度；降溫：40 ℃、60 s。

表2 多重RT-PCR反應(yīng)體系組分及配比（總體積20 μLTable2 Reaction system o f multiplex RT-PCR (total volume 20 μL

以熒光信號對溫度的一階負導數(shù)為縱坐標，溫度為橫坐標，得到熔解峰值圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢驗

分別使用豬、牛、羊、雞鴨、狗狐貉及5 對特異性引物的混合體系對提取好的豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、鹿、魚、狐貍、貉子、馬、貓、驢、鼠15 個物種DNA（稀釋到相同質(zhì)量濃度5 ng/μL）進行RT-PCR檢測，如表3所示。5 對引物均表現(xiàn)出了良好的特異性，只對測試引物相對應(yīng)的物種產(chǎn)生陽性特異性擴增，而對其他物種在30 個循環(huán)內(nèi)無典型擴增曲線出現(xiàn)。5 對引物混合后對各物種DNA的多重RT-PCR檢測擴增曲線如圖1所示，結(jié)果與單一引物檢測相同，這為開發(fā)完整的基于多重RT-PCR熔解曲線分析的摻假檢測技術(shù)提供理論依據(jù)。

目前，國內(nèi)外學者利用多重PCR方法進行動物源性成分檢測的研究中，PCR反應(yīng)重數(shù)多為5重及以下[12-16,21-23,28-29]，PCR重數(shù)越高，引物對之間相互影響越大，對檢測結(jié)果影響也越大。在本研究的特異性引物設(shè)計中，采用大類特異小類保守的線粒體DNA序列作為擴增靶序列，這使得在不增加引物對數(shù)的情況下增加了同步檢測物種數(shù)量，大幅提 高了檢測通量和效率，例如狗狐貉引物對能擴增狗狐貉3 種犬科動物源性成分，而無法擴增其他源性成分。

圖1 多重RT-PCR混合引物特異性檢測擴增曲線Fig.1 Multiplex RT-PCR amplification curves showing the specificity of mixed primers

按照表4制作不同物種組合的樣品（混合樣品中各肉種成分比例相同），采用5重RT-PCR體系對各樣品進行檢測和熔解曲線分析，進一步驗證方法體系的特異性，同時確定各物種成分特異性熔解峰的Tm值范圍。所有樣品出現(xiàn)熔解峰的位置均與樣品已知肉種組成相符，未出現(xiàn)非特異性擴增，表明方法具有較好的特異性，多重RT-PCR熔解曲線圖譜中各源性成分Tm值的分布范圍分別為：綿羊源性成分Tm值（71.8±0.6） ℃，山羊源性成分Tm值（73.3±0.4） ℃，牛源性成分Tm值（74.7±0.7） ℃，狗、狐貍、貉源性成分Tm值（77.2±0.9） ℃，豬源性成分Tm值（ 80.8±0.5） ℃，雞源性成分Tm值（85.1±0.4） ℃，鴨源性成分Tm值（87.4±0.2） ℃。

各源性成分中Tm值跨度范圍最小的是鴨源性成分，為0.4 ℃；跨度最大的是狗、狐貍、貉源性成分，為1.8 ℃。表明方法穩(wěn)定性較好，源性成分Tm值偏移跨度小，并且每種源性成分Tm值范圍之間并無重疊，因此，本方法體系可以根據(jù)熔解峰值圖中峰的個數(shù)和位置準確的同步檢測食品中豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉9 種源性成分，不同源性成分Tm值的差異主要是由于擴增產(chǎn)物長度和堿基組成不同造成的。建立5重RT-PCR體系同時鑒別9 種源性成分如圖2所示。

表3 多重RT-PCR的引物特異性Table3 Specificity of multiplex RT-PCR primers

表4 不同物種組合中各物種成分特異性熔解峰Tm值Table4 Tm of different species in meat mixtures℃

圖2 多重RT-PCR鑒別9 種動物源性成分的熔解峰值圖Fig.2 Melting curve for identification of nine animal-derived ingredients by multiplex RT-PCR

2.2 方法的靈敏度檢驗結(jié)果

圖3 單物種成分（A～I）和多物種混合DNA（J）靈敏度檢驗Fig.3 Sensitivity o f ingredients from single species (A-I) and mixed species DNA (J)

將10、1、0.1、0.01、0.001 ng豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐貍、貉子9 個肉種DNA樣品及豬、牛、綿羊、鴨、狐貍混合DNA樣品，進行5重RT-PCR及熔解曲線分析，檢測本方法靈敏度。從圖3A～I可以看出，采用本方法多重RT-PCR體系檢測單物種DNA，綿羊、狗、狐貍、貉子源性成分的檢出限為0.001 ng，豬、牛、山羊源性成分的檢出限為0.01 ng，鴨源性成分的檢出限為0.1 ng，雞源性成分的檢出限為1 ng。從圖3J可以看出，采用本方法體系檢測多物種混合DNA，豬、牛、羊、狐貍、鴨5 種源性成分的檢出限均為0.1 ng。

Hanapi等[18]開發(fā)了可檢測豬、反芻動物、鳥、兔4 種成分的多重PCR方法，檢出限為0.1 ng。Hou Bo等[21]開發(fā)了一種可同時檢測肉制品中雞、鴨、鵝源性成分的多重PCR方法，方法檢出限為0.05 ng。Bai Weibin[30]和Hanapi[18]等研究表明0.1 ng DNA的靈敏度對于肉制品摻假檢測已經(jīng)足夠。

2.3 市售肉類樣品檢測

為了進一步考察本方法的準確性和實際應(yīng)用性，對100 份隨機采集的市售肉類樣品進行檢測，結(jié)果表明，Tm值在（71.8±0.6） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（綿羊源性成分）的有18 份樣品；Tm值在（73.3±0.4） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（山羊源性成分）的有3 份樣品；Tm值在（74.7±0.7） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（牛源性成分）的有50 份樣品；Tm值在（80.8±0.5） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（豬源性成分）的有28 份樣品；Tm值在（85.1±0.4） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（雞源性成分）的有10 份樣品；Tm值在（87.4±0.2） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（鴨源性成分）的有10 份樣品。

表5 市售肉類樣品分類及檢測結(jié)果Table5 Detection of commercial meat products

如表5所示，生肉片肉卷、醬鹵肉制品、肉串、干制品、香腸和火腿制品等各類肉制品中均存在摻假情況，摻假率達27.0%，其中肉串類食品摻假最為嚴重，摻假率高達40.7%，大多采用雞、鴨等低價肉種替代或摻假。上述結(jié)果表明，該方法可以用于實際樣品（包括生鮮樣品和熟制樣品）摻假的快速鑒別。

3 結(jié) 論

本研究建立的一種基于5重RT-PCR熔解曲線分析的肉及肉制品摻假鑒別方法，可以準確同時檢測肉及肉制品中豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、狗、狐、貉9 種源性成分。該方法具有良好的特異性及靈敏度，可用于實際樣品（包括生鮮樣品和熟制樣品）摻假鑒別，大幅降低了檢測成本，提高了檢測效率和準確率，對加強肉類市場監(jiān)管、有效抵御肉制品摻假，保護消費者和相關(guān)肉制品企業(yè)利益是十分重要的，為相關(guān)部門提供可靠的技術(shù)手段和執(zhí)法依據(jù)，具有巨大市場需求和廣闊的應(yīng)用前景。

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A Multiplex RT-PCR Melting Curve Analysis Method for Adulteration Identification in Meat and Meat Products

ZHOU Tong, LI Jiapeng*, LI Jinchun, QIAO Xiaoling*, HUANG Xin, CHEN Xi, YANG Junna, GUO Ya
(Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, China Meat Food Research Center, Beijing 100068, China)

This study was aimed to establish a rapid method for the identification of adulterated meat and meat products. Five pairs of species-specific primers, yielding amplicons having significantly different melting temperatures (Tm), were designed targeting the mitochondrial COXⅠ gene of pig and bovine, the 16S rRNA gene of sheep, goat, dog, fox and raccoon, and the 12S rRNA gene of chicken and duck, respectively. The established multiplex RT-PCR-melting curve analysis method was evaluated in term of specificity and sensitivity and was applied in the detection of commercial meat products. The method showed a good specif i city and sensitivity, and was able to detect 0.001-1 ng of DNA from single species and 0.1 ng of DNA form mixed species. Thus, it can be used to test both raw and processed meat products.

meat adulteration; multiplex real-time PCR; melting curve analysis; SYBR Green dye; animal- derived ingredient

10.7506/spkx1002-6630-201712033

TS207.7

A

1002-6630（2017）12-0217-06

周彤, 李家鵬, 李金春, 等. 一種基于多重實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)熔解曲線分析的肉及肉制品摻假鑒別方法[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 217-222.

10.7506/spkx1002-6630-201712033. http：//www.spkx.net.cn

ZHOU Tong, LI Jiapeng, LI Jinchun, et al. A multiplex RT-PCR melting curve analysis method for adulteration identification in meat and meat products[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 217-222. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712033. http：//www.spkx.net.cn

2016-10-13

國家自然科學基金面上項目（31271877）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B05）

周彤（1984—），男，高級工程師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zhoubai767@126.com

*通信作者：李家鵬（1979—），男，高級工程師，碩士，研究方向為生物技術(shù)。E-mail：ljp7915@126.com喬曉玲（1964—），女，教授級高級工程師，本科，研究方向為肉品科學和加工技術(shù)。E-mail：cmrcsen@126.com