發(fā)酵肉制品中高抗氧化肉品發(fā)酵劑的篩選鑒定

李 默，朱 暢，趙冬兵，王利媛，茍夢星，劉學(xué)軍,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002；3.吉林工程職業(yè)學(xué)院食品工程分院，吉林 四平 136000）

發(fā)酵肉制品中高抗氧化肉品發(fā)酵劑的篩選鑒定

李 默1,2，朱 暢3，趙冬兵1，王利媛1，茍夢星1，劉學(xué)軍1,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002；3.吉林工程職業(yè)學(xué)院食品工程分院，吉林 四平 136000）

為獲得高抗氧化活性的天然肉品發(fā)酵劑，通過清除自由基、還原能力和抗脂質(zhì)過氧化實驗對來源于5 種發(fā)酵肉制品中30 株乳酸菌的發(fā)酵上清液、菌體細(xì)胞和胞內(nèi)提取物的抗氧化活性進行研究，并按照肉品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)對高抗氧化性的菌株進行篩選，鑒定出符合要求的菌株。結(jié)果表明：這30 株乳酸菌具有不同的抗氧化能力且不同組分的抗氧化活性之間存在很大差異，發(fā)現(xiàn)菌株L23、L26和L28具有較高的抗氧化活性，其中L23符合肉品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)，可作為天然高抗氧化性肉品發(fā)酵劑用于生產(chǎn)。經(jīng)鑒定L23為希臘魏斯氏菌。

發(fā)酵肉制品；乳酸菌；抗氧化活性；鑒定；希臘魏斯氏菌

肉及肉制品由于自身脂肪和蛋白質(zhì)含量豐富，且水分活度高，在加工和貯運過程中極易發(fā)生氧化變質(zhì)，從而影響其感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值[1-2]，所以在肉制品中添加一些抗氧化劑對減緩甚至防止肉制品的氧化腐敗非常重要[3]。工業(yè)上常使用一些產(chǎn)量大、價格低、抗氧化性強的合成抗氧化劑（如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、丁基羥基茴香醚和叔丁基對苯二酚等）[4-5]，但有研究顯示合成抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用，存在許多安全性問題[6-8]。因此，開發(fā)新型、天然、安全的抗氧化劑成為當(dāng)今社會研究的熱點[9-11]。目前許多研究證實一些乳酸菌具有抗氧化活性[12-14]，能夠抗癌、降低膽固醇、增強機體免疫力、延緩衰老等[15-16]，是一種常見的天然抗氧化劑。

我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品主要依賴環(huán)境中的微生物自然生長進行發(fā)酵，產(chǎn)品中富集了大量生長特性良好的乳酸菌[17-19]。近年來有許多關(guān)于發(fā)酵肉制品中優(yōu)良菌株篩選方面的報道，周超[20]從4 種不同的酸肉中篩選出2 株能產(chǎn)NO，具有KatA基因的希臘魏斯氏菌。呂彩霞[21]從傳統(tǒng)牛干巴中得到具有肉品發(fā)酵劑的德式乳桿菌和干酪乳桿菌。Pringsulaka等[22]從泰國發(fā)酵魚肉制品中分離出能夠產(chǎn)生細(xì)菌素的魏斯氏菌。但對發(fā)酵肉制品中抗氧化乳酸菌的研究的報道很少，本研究從金華火腿、四川臘肉、宣威火腿、云南牛干巴和建昌板鴨5 種發(fā)酵肉制品中篩選出高抗氧化活性的乳酸菌菌株作為肉品發(fā)酵劑，在保持肉制品良好品質(zhì)的同時延緩肉制品在加工貯藏過程中的脂肪氧化，并為天然抗氧化劑的開發(fā)和功能性食品的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及培養(yǎng)基

實驗所用乳酸菌菌株均為5 種發(fā)酵肉制品中分離得到。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；吐溫20、亞油酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、鄰羅菲琳、鐵氰化鉀、乙二胺四乙酸、鄰苯三酚等均為國產(chǎn)分析純。

MRS液體/固體培養(yǎng)基[20]、系列篩選培養(yǎng)基[20]均為實驗室配制。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MCV-131BNF（T）無菌操作臺 日本Sanyo公司；JY99-IIDN超聲波細(xì)胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；LPZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離

取25 g樣品加入225 g無菌生理鹽水置于均質(zhì)拍打機中拍打5 min，取梯度稀釋后的樣品涂布于含有3% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取產(chǎn)生透明溶鈣圈的菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，分離純化革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株。用50%甘油在－20 ℃條件下保藏菌種。

1.3.2 乳酸菌的活化與培養(yǎng)

將保存的菌種接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，傳代3 次。將活化好的菌種以1%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.3 乳酸菌各組分的制備

培養(yǎng)好的菌液5 000 r/min離心20 min，收集發(fā)酵上清液備用。菌體細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗3 次，再將菌體重懸于PBS中，溶液分為2 組，一組收集備用，另一組菌液置于冰浴中超聲破碎30 min，10 000 r/min冷凍離心20 min，收集上層清液備用即無細(xì)胞提取物。

1.3.4 乳酸菌抗氧化活性的檢測

清除羥自由基（·OH）能力的測定參照文獻[23]；清除超氧陰離子自由基（O2－·）能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法，具體方法參照文獻[24]；清除DPPH自由基能力的測定參照文獻[25]；抗脂質(zhì)過氧化能力的測定參考文獻[26]；還原能力的測定參照文獻[27]。

1.3.5 肉品發(fā)酵劑的篩選

將具有高抗氧化性的菌株進行耐鹽、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S、產(chǎn)黏、氨基酸脫羧酶等肉品發(fā)酵劑篩選實驗，具體實驗方法參照文獻[28]。

1.3.6 乳酸菌的鑒定

1.3.6.1 乳酸菌形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定

挑取菌株單菌落進行革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)檢測，以及觸酶實驗、硝酸鹽還原實驗、產(chǎn)硫化氫實驗及碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸實驗等生理生化實驗。生理生化特征分析參照文獻[28-30]。

1.3.6.2 乳酸菌的16S rDNA鑒定和進化分析

將保存的目標(biāo)菌株活化3 代后，在MRS固體平板上劃線。在37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取乳酸菌單菌落，觀察菌落形態(tài)和顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，送生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA測序和測序結(jié)果比對工作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從發(fā)酵肉制品中分離出127 株菌株，進一步篩選出能夠產(chǎn)生明顯透明鈣圈、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的30 株菌株，初步定為乳酸菌，并編號為L1～L30。

2.2 乳酸菌抗氧化活性比較結(jié)果

2.2.1 清除?OH實驗結(jié)果

通過對30 株乳酸菌的?OH清除能力的研究，結(jié)果顯示，各組分呈現(xiàn)出不同的清除效果。其中胞內(nèi)提取物表現(xiàn)出相對較弱的清除效果，清除率為0%～29.30%，而發(fā)酵上清液和菌體細(xì)胞都表現(xiàn)出相對較強的清除活性。如表1所示，除L19、L20、L21、L28和L30的菌體細(xì)胞對?OH的清除率高于發(fā)酵上清液外，其他25 株乳酸菌的發(fā)酵上清液對?OH的清除率均高于菌體細(xì)胞。此外，不同乳酸菌也表現(xiàn)出不同的清除效果。其中，L23的發(fā)酵上清液和L28的菌體細(xì)胞表現(xiàn)出相對較強的清除能力，清除率分別為64.28%和64.43%。結(jié)果表明，不同乳酸菌對?OH的清除效果不同，且清除?OH的活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液和菌體細(xì)胞表面。

表1 乳酸菌OH的清除率Table1 Hydroxyl radical scavenging-activity of lactic acid bacteria %

表2 乳酸菌·清除率Table2 Superoxide anion radical scavenging activity of lactic acid bacteria %

表2 乳酸菌·清除率Table2 Superoxide anion radical scavenging activity of lactic acid bacteria %

?

由表2可知，30 株乳酸菌的菌體細(xì)胞和胞內(nèi)提取物表現(xiàn)出極其微弱的清除效果，清除率范圍為0%～15.43%，而各菌株的發(fā)酵上清液均表現(xiàn)出相對較強的O2－·清除活性。L15和L23的發(fā)酵上清液表現(xiàn)出較強的清除效果，清除率分別為30.96%和46.94%。這一實驗結(jié)果表明，不同乳酸菌對O2－·的清除效果不同，且乳酸菌清除O2－·的活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中。

2.2.3 清除DPPH自由基實驗結(jié)果由表3可知，30 株菌株的菌體細(xì)胞和胞內(nèi)提取物表現(xiàn)出相對較弱的清除能力，清除率范圍為0%～34.76%。而發(fā)酵上清液的清除率范圍為47.26%～91.24%，L26和L23的發(fā)酵上清液表現(xiàn)出相對較強的清除活性，清除率分別為

表3 乳酸菌對DPPH自由基的清除率Table3 DPPH free radical scavenging activity of lactic acid bacteria %

91.24 %和89.32%。實驗結(jié)果表明，清除DPPH自由基的活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中。

2.2.4 還原能力測定結(jié)果

表4 乳酸菌還原能力Table4 Reducing powder of lactic acid bacteria

由表4可知，乳酸菌的菌體細(xì)胞和胞內(nèi)提取物表現(xiàn)出極其微弱的還原活性，OD700nm為0～0.080，而發(fā)酵上清液表現(xiàn)出相對較強的還原活性，OD700nm為0.179～2.639。L23的發(fā)酵上清液表現(xiàn)出最強的還原活性，OD700nm為2.639。這一實驗結(jié)果表明不同乳酸菌具有還原能力的活性物質(zhì)含量不同，且活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中。

2.2.5 抗脂質(zhì)過氧化能力測定結(jié)果

表5 乳酸菌對脂質(zhì)過氧化的抑制率Table5 Inhibitory percentages of lactic acid bacteria on lipoperoxidation %

通過測定30 株乳酸菌各組分在亞油酸氧化體系中抑制脂質(zhì)過氧化的能力，結(jié)果顯示，乳酸菌菌體細(xì)胞的抑制活性為0%～28.57%，均低于相應(yīng)菌株的胞內(nèi)提取物。如表5所示，除L11、L12、L14、L21、L23和L27外，其他24 株乳酸菌胞內(nèi)提取物的抑制活性均高于發(fā)酵上清液的抑制活性，然而L23的發(fā)酵上清液表現(xiàn)出最強的抗脂質(zhì)過氧化能力，抑制率為62.01%。結(jié)果表明不同乳酸菌的抗脂質(zhì)過氧化能力不同且抗脂質(zhì)過氧化的活性物質(zhì)存在部位不同或活性物質(zhì)在不同部位的含量不同。

經(jīng)過上述5 種體外抗氧化的篩選實驗可知，L28的菌體細(xì)胞具有最強的清除?OH能力（清除率為64.43%）；L26的發(fā)酵上清液具有最強的DPPH自由基清除能力（清除率為91.24%）；L23的發(fā)酵上清液具有最強的還原能力（OD700nm為2.639），并具有最強的抗脂質(zhì)過氧化能力（抑制率為62.01%）和最強的清除O2－·能力（清除率為46.94%）。由此，篩選得到L23、L26和L28三株抗氧化能力較強的乳酸菌進行下一步研究。

2.3 抗氧化肉品發(fā)酵劑的篩選結(jié)果

將篩選得到的L23、L26和L28三株抗氧化能力較強的乳酸菌進行肉品發(fā)酵劑的復(fù)篩實驗，實驗結(jié)果如表6所示，其中L26和L28都表現(xiàn)出氨基酸脫羧酶陽性、產(chǎn)氨陽性，且L26還表現(xiàn)出產(chǎn)H2S陽性，這些指標(biāo)都不符合肉品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)。然而，L23符合肉品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)，可以作為肉品發(fā)酵劑進行進一步的研究。

表6 菌株主要發(fā)酵特性Table6 Fermentation characteristics of the selected strains

注：+.表示陽性；－.表示陰性。表8、9同。

2.4 乳酸菌L23的鑒定

2.4.1 乳酸菌L23的形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定結(jié)果

表7 乳酸菌L23的菌落特征Table7 Colony characteristics of strain L23

表8 乳酸菌L23的生理生化鑒定結(jié)果Table8 Physiological and biochemical identification of L23

表9 乳酸菌L23的糖發(fā)酵實驗結(jié)果Table9 Carbohydrate fermentation characteristics of L23

將菌株L23在MRS固體平板培養(yǎng)基上劃線分離，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀察單菌落的形態(tài)特征（表7）。經(jīng)顯微鏡觀察菌株L23細(xì)胞為短桿，成短鏈狀，革蘭氏陽性，再結(jié)合生理生化特征（表8）和碳水化合物發(fā)酵實驗結(jié)果（表9），根據(jù)文獻[28-30]，可初步鑒定菌株L23為希臘魏斯氏菌（Weissella hellenica）。

2.4.2 乳酸菌L23 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

對菌株L23的16S rDNA序列進行PCR擴增并進行電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)該菌株的序列在1 000～2 000 bp之間，進一步測序后，得到菌株L23的16S rDNA序列為1 494 bp。將所測得的菌株序列用BLAST軟件在GenBank中進行相似性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株L23與希臘魏斯氏菌的相似度達99%。將GenBank中與菌株L23序列同源性高于98%的幾株菌株進行BLAST分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖2所示，菌株L23與Weissella hellenica FJ654466親緣關(guān)系最近，由此確定L23為希臘魏斯氏菌。

圖1 菌株L23 16S rDNA PCR產(chǎn)物擴增圖Fig.1 Electrophorogram of PCR-amplified 16S rDNA products from strain L23

圖2 菌株L23 16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain L23

3 結(jié)論與討論

本研究從發(fā)酵肉制品中分離出127 株菌株，進一步篩選出能夠產(chǎn)生明顯透明鈣圈、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的30 株菌株乳酸菌。這30 株乳酸菌不同組分的抗氧化活性進行了研究，結(jié)果表明這30 種乳酸菌具有不同的抗氧化能力且不同組分的抗氧化能力之間存在很大差異，其中菌株L23、L26和L28具有較高的抗氧化活性。本研究還通過肉品發(fā)酵劑的篩選實驗，確定菌株L23滿足肉品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)。并結(jié)合菌株L23的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA的分析鑒定，L23為希臘魏斯氏菌。

乳酸菌在自然界中廣泛存在，而來源于肉制品的乳酸菌更有利于應(yīng)用到肉制品中?？寡趸樗峋鷮ρ泳徣庵破返闹狙趸l(fā)揮重要作用。這一研究結(jié)果將為天然抗氧化劑的開發(fā)、抗氧化成分的提取以及功能性食品的研制等方面提供參考。

本研究從5 種發(fā)酵肉制品中篩選出一株具有較高抗氧化活性的肉品發(fā)酵劑希臘魏斯氏菌，該菌在肉品發(fā)酵劑方面的研究較罕見，由于時間關(guān)系并未對該菌的安全性方面進行評估，在以后的研究中還需進一步檢測該菌的安全性問題；同時本研究只從5 種發(fā)酵肉制品中篩選出一株較高抗氧化活性的乳酸菌，并未進一步探討該菌的具體抗氧化成分，在以后的研究中可以對該菌的抗氧化成分進行分析，并可以對其抗氧化成分進行分離提取，為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論支持。

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Screening and Identification of Meat Starters with High Antioxidant Activity from Fermented Meat Products

LI Mo1,2, ZHU Chang3, ZHAO Dongbing1, WANG Liyuan1, GOU Mengxing1, LIU Xuejun1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. College of Pharmaceutics and Food Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, China; 3. College of Food Engineering, Jilin Engineering Vocational College, Siping 136000, China)

This study aimed to obtain lactic acid bacteria (LAB) with high antioxidant activity for meat fermentation. Intact cells, cell-free extracts and fermentation supernatant of 30 LAB isolated from5 kinds of fermented meat products were evaluated for antioxidant activity by free radical scavenging assays, reducing power assay and linoleic acid peroxidation inhibition assay. According to the meat starters screening standard, eligible strains were identified. The results showed that the 30 strains of LAB had different antioxidant capacities and there were big differences between the antioxidant activities of their intact cells, cell-free extracts and fermentation supernatant. Strains L23, L26 and L28 were screened for excellent antioxidant activity, and L23, reaching the requirement of the meat starters screening standard, could be used as a natural meat starter for the production of fermented meat products. Strain L23 was identified as Weissella hellenica.

fermented meat products; lactic acid bacteria; antioxidant activity; identification; Weissella hellenica

10.7506/spkx1002-6630-201712013

TS201.3

A

1002-6630（2017）12-0083-06

李默, 朱暢, 趙冬兵, 等. 發(fā)酵肉制品中高抗氧化肉品發(fā)酵劑的篩選鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 83-88.

10.7506/ spkx1002-6630-201712013. http：//www.spkx.net.cn

LI Mo, ZHU Chang, ZHAO Dongbing, et al. Screening and identification of meat starters with high antioxidant activity from fermented meat products[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 83-88. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712013. http：//www.spkx.net.cn

2016-09-24

吉林省重點科技攻關(guān)項目（20140204010NY）

李默（1989—），女，助教，碩士研究生，研究方向為動物食品科學(xué)。E-mail：lm6739099@163.com

*通信作者：劉學(xué)軍（1963—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：liuxuejun63@163.com