牦牛發(fā)酵酸奶中耐久腸球菌的篩選鑒定和益生特性

黃 堅(jiān)，童京京，岳 華，湯 承*

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

牦牛發(fā)酵酸奶中耐久腸球菌的篩選鑒定和益生特性

黃 堅(jiān)，童京京，岳 華，湯 承*

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

為從牦牛發(fā)酵酸奶中篩選出新的食源性益生菌株，通過培養(yǎng)分離、16S rRNA基因測序分析和生化實(shí)驗(yàn)鑒定出4 株耐久腸球菌。這4 株分離株與已報(bào)道的8 株耐久腸球菌的同源性高達(dá)99.4%～99.9%，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹中單獨(dú)聚為一支。其中耐久腸球菌SWUN5857的體外抗酸和抗膽鹽能力最強(qiáng)，在體外可以有效抑制致病性大腸桿菌（抑菌圈直徑（17.0±0.3） mm）和沙門氏菌（抑菌圈直徑（18.0±0.2） mm）的生長，對常見的大多數(shù)抗生素都敏感，并且可以很好地與小鼠各段腸黏液產(chǎn)生黏附。短期喂服耐久腸球菌SWUN5857可以顯著提高小鼠體質(zhì)量（P＜0.01），促進(jìn)動(dòng)物脾臟和胸腺的發(fā)育，同時(shí)還可提升動(dòng)物體液和細(xì)胞免疫水平（P＜0.01）以及腸道SIgA的表達(dá)水平（P＜0.01）。綜上所述，分離得到的耐久腸球菌SWUN5857能很好地適應(yīng)胃腸環(huán)境壓力，有效提高動(dòng)物的生長性能和免疫功能，可以作為候選的益生性菌株。

牦牛酸奶；耐久腸球菌；分離鑒定；益生作用

牦牛發(fā)酵酸奶是青藏高原地區(qū)牧民的傳統(tǒng)特色食品，其營養(yǎng)價(jià)值出眾，包含豐富的乳酸菌資源。不同牧區(qū)牦牛發(fā)酵乳制品中的乳酸菌群組成各異，包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬等，并呈現(xiàn)出豐富的生物遺傳多樣性[1-2]。從多種乳制品和發(fā)酵食物中都可分離得到腸球菌，如糞腸球菌、屎腸球菌和耐久腸球菌等，其生物學(xué)表型和屬性各異[3-5]。雖然從乳制品分離得到的乳酸菌中，腸球菌不是主要的優(yōu)勢菌群，但部分動(dòng)物源性的腸球菌分離株已顯示出了良好的益生屬性，對維持腸道正常菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用，已經(jīng)用于食品發(fā)酵和臨床微生物學(xué)的研究[6-8]。優(yōu)良的益生菌能夠耐受胃腸道內(nèi)的環(huán)境壓力、在腸道內(nèi)定植、抑制病原菌的生長和提高機(jī)體免疫力等屬性[4,9]，并且易于培養(yǎng)保存和便于生產(chǎn)應(yīng)用，因此在篩選時(shí)需要在這些方面進(jìn)行考察。

目前，現(xiàn)有對牦牛酸奶中乳酸菌資源的研究仍集中于菌種的篩選以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化[2,4]，而對其中可能具有益生屬性的腸球菌研究較少。不同來源的耐久腸球菌已經(jīng)被分離得到，其生物學(xué)特性和作用也各不相同[10-12]，但鮮見有關(guān)牦牛酸奶源耐久腸球菌在體內(nèi)發(fā)揮微生物效應(yīng)的報(bào)道，因此值得進(jìn)一步研究。因此，本研究擬從牦牛發(fā)酵酸奶中分離鑒定出耐久腸球菌，研究其遺傳特征及益生性能，以期為食源性益生菌的開發(fā)提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、疫苗及樣本

雞致病性大腸桿菌CVCC 79301、豬霍亂沙門氏菌CVCC 503 中國微生物菌種保藏中心；雞新城疫La Sota活毒凍干疫苗 成都生物技術(shù)有限公司。

牦牛酸奶樣本采集于川西北阿壩州和甘孜州牧區(qū)，共采集得到10 份自然發(fā)酵牦牛酸奶，在4 ℃條件下轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，并立即進(jìn)行乳酸菌的分離培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠（清潔級），21 日齡，體質(zhì)量（20±2）g，雌性，由成都里來生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.1.3 試劑

MRS培養(yǎng)基 杭州微生物有限公司；VETEK 2細(xì)菌生化鑒定試劑、藥敏片 法國生物梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、核酸染料GELVIEW、DNA Marker DL2000、瓊脂糖 大連寶生物公司；SIgA檢測試劑盒 上海心語生物科技有限公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)液、小鼠外周淋巴細(xì)胞分離液、CCK-8試劑盒 日本同仁化學(xué)研究所；刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA） 美國Sigma公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）試劑盒、Bradford蛋白檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

My CyclerTM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Ver SaDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac UniversalTM核酸電泳儀 美國Bio-Rad公司；DELTA 320PH酸度計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；Biophotometer紫外分光光度計(jì) 德國Eppendorf公司；全自動(dòng)細(xì)菌生化分析儀HX-21 合肥恒星科技開發(fā)有限公司；EX808酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸球菌的分離純化

將適當(dāng)稀釋后的酸奶溶液均勻涂布于含2% CaCO3乳液的MRS培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)平板，置于37 ℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落特征，并挑取培養(yǎng)平板上產(chǎn)生溶鈣圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色。根據(jù)乳酸球菌的圓形或橢圓形菌落特征對革蘭氏染色陽性菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)。將純化得到的乳酸球菌用含30%甘油的培養(yǎng)基重懸后置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸球菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增和序列測定

按照操作說明提取上述細(xì)菌純化培養(yǎng)物的基因組DNA作為PCR模板。PCR擴(kuò)增16S rRNA區(qū)域上1 505 bp大小的片段，設(shè)計(jì)以下引物序列。上游引物：5’-CAGGTTCCCCTACGGTTA-3’；下游引物：5’-ATGGCTCAGATTGAACGC-3’，交由上海生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol）、4×dNTPs（10 mmo l/L）2 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.125 μL、Mg2＋3 μL（10 mmol/L）、10×PCR buffer 2.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR設(shè)定程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s、52 ℃退火60 s、72 ℃延伸90 s，共36 個(gè)循環(huán)。以無菌ddH2O設(shè)立陰性對照。將獲得的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，經(jīng)純化回收送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。將擴(kuò)增片段的序列與GenBank上已知的耐久腸球菌序列進(jìn)行BLAST比對和同源性分析。

1.3.3 耐久腸球菌的生化鑒定

挑取分子鑒定為耐久腸球菌的菌株單菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂平面，37 ℃培養(yǎng)24 h后無菌蘸取適量菌落制成懸液，按照VETEK 2細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)操作要求上機(jī)分析并判讀結(jié)果（四川省獸藥監(jiān)察所）。

1.3.4 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將初步抗壓篩選得到的耐久腸球菌分離株的16S rRNA基因序列與已報(bào)道的耐久腸球菌基因序列進(jìn)行同源性分析，同時(shí)調(diào)取GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的8 株同源性最高的耐久腸球菌基因序列，用Mega 5.2軟件采用鄰位相連法1 000 次Bootstrap抽樣構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.5 耐久腸球菌的生長曲線

將充分活化的菌株按照1%的量接入200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，于不同時(shí)間取樣。每隔2 h取樣，測定樣本OD600nm，并記錄數(shù)據(jù)，構(gòu)建生長曲線。

1.3.6 耐酸和耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

將耐久腸球菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，將菌體用培養(yǎng)基浸洗后重懸并調(diào)整濃度為3.0×108CFU/mL。將菌液調(diào)整pH值為1.0、2.0、3.0或0.3%牛膽酸鹽條件，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h后，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，并按公式（1）計(jì)算細(xì)菌存活率，以存活率表征菌株對酸或者膽鹽的耐受性。

1.3.7 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

取活化的耐久腸球菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。在制備好的上層含指示菌的米勒-海頓（Mueller-Hinton，MH）肉湯培養(yǎng)雙層平板上，于牛津杯中加入200 μL測試菌液樣本，做好標(biāo)記，并設(shè)立陰性對照。37 ℃培養(yǎng)15 h后測定抑菌圈的大小。用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，當(dāng)抑菌圈直徑大于10 mm，即認(rèn)為檢測樣品對指示菌有抑菌作用。

1.3.8 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)

將耐久腸球菌接種于MH培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后用無菌棉簽蘸取少許菌落，添加到MH肉湯中，調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1 000（V/V）稀釋后備用。將100 μL上述菌液加入96 孔藥敏板（陽性腸球菌專用）中，并設(shè)立生長和空白對照。用封口膜將96 孔板密封后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育20 h后在Vitek Compact 2全自動(dòng)微生物分析儀上判讀結(jié)果。

1.3.9 體外腸黏液黏附實(shí)驗(yàn)

[20-21]的方法。剖殺昆明小鼠后無菌操作刮取各段腸道的腸黏液，用無菌0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）離心浸洗后，過濾膜除菌。根據(jù)Bradford法測定蛋白質(zhì)量濃度，用0.01 mol/L PBS調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL后于－20 ℃保存?zhèn)溆?。將制備好的腸黏液100 μL加入96 孔培養(yǎng)板中于4 ℃固定過夜。200 μL PBS洗滌2 次，去除未黏附的黏液；加100 μL耐久腸球菌懸液（108CFU/mL）；加入50 μL PBS及20 μL MTT（5 mg/mL），30 ℃孵育1 h后，加裂解液（含20%十二烷基硫酸鈉及50%二甲基亞砜）振蕩30 min。酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔吸光度。以脫脂奶粉作為陰性對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。黏附率按公式（2）計(jì)算。

式中：A1、A0、A空分別代表實(shí)驗(yàn)組、菌懸液、空白對照吸光度。

1.3.10 小鼠體增質(zhì)量和臟器指數(shù)的測定

經(jīng)1 周的適應(yīng)性飼喂后，將48 只小鼠隨機(jī)分為2 組，每組24 只。根據(jù)前期飼喂?jié)舛葘π∈篌w增重影響的結(jié)果，確定105CFU/mL為最佳的飼喂?jié)舛取Ｒ虼?，?shí)驗(yàn)組小鼠灌胃飼喂0.5 mL耐久腸球菌液（105CFU/mL），對照組小鼠灌服等量的MRS培養(yǎng)基，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均自由采食。在灌胃結(jié)束后的第1、7、14、21天對各組小鼠進(jìn)行稱質(zhì)量，并記錄結(jié)果。同時(shí)，剖殺小鼠后摘取脾臟和胸腺稱質(zhì)量，按公式（3）計(jì)算臟器指數(shù)并記錄結(jié)果。

1.3.11 腸黏膜SIgA分泌的測定

在灌胃7 d后的第1、7、14、21天各組隨機(jī)取出6 只小鼠，解剖小鼠空腸和回腸，刮取腸黏膜放于1 mL PBS中，充分?jǐn)嚢瑁?2 000×g離心15 min，獲得上清液于－20 ℃保存。采用雙抗夾心ELISA法定量測定其中的SIgA含量。

1.3.12 微量間接血凝抑制實(shí)驗(yàn)

在最后一次灌胃后間隔12 h，對所有昆明小鼠肌注雞新城疫弱毒雞新城疫La Sota活毒凍干疫苗2 頭份/只。在免疫結(jié)束后第7、14、21天每組取出6 只小鼠，每只鼠無菌采集得0.3 mL眼球非抗凝血，制備血清并標(biāo)記編號，置于56 ℃水浴中滅活30 min，然后采用β微量法[24]血凝抑制實(shí)驗(yàn)測定小鼠血清中新城疫抗體的效價(jià)。血清的血凝抑制HI抗體效價(jià)為該血清100%抑制凝集的最大稀釋度（X），結(jié)果以log2X表示。

1.3.13 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[25]的方法，將無菌采集得到的0.5 mL小鼠眼球血貯存于肝素抗凝管中，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血中的淋巴細(xì)胞懸液，用PBS重復(fù)洗滌3 次后在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8法測定對照孔和刺激孔在450 nm波長處的吸光度。按公式（4）計(jì)算對應(yīng)小鼠樣本的刺激指數(shù)（stimulating index，SI）。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸球菌的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征

圖1 乳酸球菌革蘭氏染色陽性（×40）Fig.1 Positive Gram staining of Lactococcus lactics (× 40)

用雙層MRS選擇培養(yǎng)平板從10 份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中分離得到38 株乳酸菌，菌落形態(tài)呈圓形，顏色呈乳白色，表面光滑濕潤，周圍有溶鈣圈。由圖1可知，顯微鏡下呈圓形或橢圓形，無芽孢，革蘭氏染色呈陽性，符合乳酸球菌的形態(tài)特征。

2.2 乳酸球菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果及基因測序同源比對

圖2 乳酸球菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene from Lactococcus lactics

由圖2可知，乳酸球菌16S rRNA基因擴(kuò)增片段大小約為1 500 bp，與預(yù)期片段大小相符。經(jīng)16S rRNA基因測序并與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的耐久腸球菌序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，分離得到的38 株乳酸球菌中，有4 株分離菌（SWUN5856、SWUN5857、SWUN5858和SWUN5859）與耐久腸球菌的同源性最高，同源性均大于99%，因此初步認(rèn)定這些分離菌為耐久腸球菌。

2.3 耐久腸球菌16S rRNA的同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用M E G A 5.2軟件，將本實(shí)驗(yàn)分離株SWUN5856～SWUN5859（GenBank登錄號：KX687981～KX687984）與16S rRNA序列同源性高于99%的8 株耐久腸球菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析并建立進(jìn)化樹，結(jié)果顯示這12 株耐久腸球菌形成2 個(gè)分支，本研究的分離株單獨(dú)聚為一支（圖3）。

圖3 4 株耐久腸球菌分離株和8 株同源性耐久腸球菌株16S rRNA基因片段的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenic tree of4 strains of Enterococcus durans and8 homologous isolates based on 16S rRNA gene sequences

2.4 耐久腸球菌的生化鑒定結(jié)果

表1 耐久腸球菌的生化鑒定分析Table1 Biochemical analysis of Enterococcus durans

使用VITEK2鑒定系統(tǒng)對4 株分離株進(jìn)行生化特性分析（表1），結(jié)果顯示這4 株乳酸球菌均為耐久腸球菌。2.5 體外耐酸和抗膽鹽能力優(yōu)勢耐久腸球菌的篩選

表2 耐久腸球菌在酸性和膽酸鹽條件下的存活率Table2 Survival of Enterococcus durans after exposure to acidic and bile salts %

體外耐酸和抗膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH 1.0的酸性條件下對各個(gè)菌株均有不同程度的抑殺作用，在pH 3.0的條件下SWUN5857的存活率達(dá)到84%，在pH 1.0條件下的存活率也要高于其他3 株，說明耐久腸球菌SWUN5857對酸性條件耐受較好。4 株耐久腸球菌在0.3%牛膽酸鹽存在條件下培養(yǎng)3 h后，耐久腸球菌SWUN5857對0.3%膽鹽的耐受率最高（約為73%），說明其對膽鹽的耐受性較好，其次是耐久腸球菌SWUN5858，其他菌株耐膽鹽能力一般（表2）。綜上結(jié)果將SWUN5857選定為候選益生菌株進(jìn)行下一步研究。

2.6 耐久腸球菌SWUN5857的生長曲線

圖4 耐久腸球菌SWUN5857的生長曲線Fig.4 Growth curve of Enterococcus durans SWUN5857

由圖4可知，菌株SWUN5857在前2 h處于延滯期，沒有大的變化，之后進(jìn)入對數(shù)期，大約到11 h達(dá)到生長高峰，進(jìn)入穩(wěn)定期后和衰亡期后，活菌就會(huì)被自身代謝產(chǎn)物所抑制，從該曲線上可以確定該菌體的最佳收獲時(shí)間是11 h。

2.7 耐久腸球菌SWUN5857對小鼠各腸段腸黏液的體外黏附作用將耐久腸球菌SWUN5857與固定好的腸黏液共孵育結(jié)束后的黏附率檢測結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，該菌與各段腸黏液都能產(chǎn)生黏附，其中菌株對盲腸和結(jié)腸段黏液的黏附率要略高于十二指腸、空腸和回腸段，但各組數(shù)據(jù)間并無顯著差異（P＞0.05）。

表3 耐久腸球?qū)Ω髂c段腸黏液的黏附率Table3 Adhesion percentages of Enterococcus durans SWUN5857 to intestinal mucus of mice %

2.8 耐久腸球菌SWUN5857對抗生素的敏感性

表4 耐久腸球菌SWUN5857對抗生素的敏感性Table4 Antibiotic susceptibilities of Enterococcus durans SWUN5857

最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）即為小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，本實(shí)驗(yàn)生長對照組細(xì)菌生長良好，空白對照組無細(xì)菌生長，證明了結(jié)果的可靠性。根據(jù)NCCLS推薦的藥物敏感分界點(diǎn)值標(biāo)準(zhǔn)，可以將結(jié)果判定為耐藥、敏感或中度敏感，結(jié)果見表4。

2.9 耐久腸球菌SWUN5857的體外抑菌能力

圖5 耐久腸球菌SWUN5857對大腸桿菌和沙門氏菌的生長抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of Enterococcus durans SWUN5857 on the growth of Escherichia coli and Salmonella

如圖5所示，牦牛酸奶源耐久腸球菌SWUN5857對大腸桿菌的抑菌圈大小平均為（17.0±0.3） mm；對沙門氏菌的抑菌圈大小平均為（18.0±0.2） mm。結(jié)果表明，耐久腸球菌SWUN5857對大腸桿菌和沙門氏菌都具有較好的體外抑制效果。

2.10 短期飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠體質(zhì)量的影響

表5 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠體質(zhì)量的影響Table5 Effects of feeding Enterococcus durans SWUN5857 on mouse body weight g

由表5可知，灌胃結(jié)束后的各時(shí)間段，105CFU/mL組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，105CFU/mL耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠的體質(zhì)量。

2.11 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響

表6 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響Table6 Effects of feeding Enterococcus durans SWUN5857 on mouse spleen and thymus indexes

飼喂結(jié)束后，對照組與飼喂組小鼠在飼喂停止后第7、14、21天的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，僅第7天的脾臟指數(shù)存在差異（P＜0.05），而其他對比組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但飼喂組的平均器官指數(shù)均高于對照組（表6）。

2.12 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠腸黏膜SIgA的影響

表7 飼喂SWUN5857不同時(shí)間對小鼠腸黏膜SIgA的影響Table7 Effects of Enterococcus durans on SIgA of mouse intestinal mucosa SIgA ng/mL

由表7可知，飼喂組各時(shí)間段小鼠腸黏膜SIgA的含量均高于對照組。在灌胃結(jié)束后的第1天，飼喂組與對照組的SIgA含量差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果顯示，飼喂耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠腸黏膜SIgA的分泌。

2.13 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠體液免疫的影響

表8 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠血清ND HI抗體效價(jià)的影響Table8 Effects of feeding Enterococcus durans SWUN5857 on ND HI antibody titer of mouse serum

由表8可知，飼喂結(jié)束后的第7、14天，飼喂組與對照組的抗體效價(jià)變化差異極顯著（P＜0.01），提示飼喂耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠的體液免疫。

2.14 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠細(xì)胞免疫水平的影響

表9 飼喂耐久腸球菌SWUN5857對小鼠外周血淋巴細(xì)胞刺激增殖指數(shù)的影響Table9 Effects of feedingEnterococcus durans rans SWUN5857 on thee stimulation of peripheral blood lymphocyte proliferation index in mice

表9結(jié)果顯示，飼喂結(jié)束后的第7、14天，飼喂組與對照組的指數(shù)變化差異極顯著（P＜0.01），且在第14天時(shí)達(dá)到最大；第21天差異顯著（P＜0.05），表明灌胃耐久腸球菌SWUN5857能夠顯著提高小鼠的細(xì)胞免疫水平。

3 討 論

本研究分離鑒定并篩選出一株具有益生屬性的耐久腸球菌SWUN5857，該分離株的對數(shù)生長期長，繁殖快，平臺期維持時(shí)間長，因此十分適于大量發(fā)酵生產(chǎn)。該菌株耐酸和耐膽鹽能力突出，是其在消化道環(huán)境內(nèi)適應(yīng)存活的前提，這可能是通過合成酪氨酸來實(shí)現(xiàn)的[8,13]。SWUN5857與其他已報(bào)道的耐久腸球菌分離株各自聚為一支，并且不同來源的分離株間存在一定的遺傳變異，因此在生物學(xué)性能上可能會(huì)存在一些差別，這也可能與菌株的分離背景和生存環(huán)境有關(guān)[2,14-15]。

SWUN5857對常見的多種抗生素均表現(xiàn)出敏感性，并且可以有效地抑制病原微生物的生長，顯示出了其作為候選益生菌株的潛力。研究報(bào)道顯示，一些腸球菌屬的益生菌株會(huì)對某些抗生素具有抗性，這可能與其攜帶的相關(guān)抗性基因有關(guān)[16-17]，但這些抗性可能是內(nèi)源性的或者是天然性的，不一定具有轉(zhuǎn)移性。而一些菌株還能表達(dá)分泌細(xì)菌素，具有很好的抗微生物活性，因此在應(yīng)用時(shí)需要綜合考慮它們的表型及基因型特征與益生特性的關(guān)系[11,17-19]。此外，自然牧區(qū)傳統(tǒng)制作的酸奶可以較好地保留這類有益的乳酸菌，而作為食源性菌株也降低了其用作益生菌的安全風(fēng)險(xiǎn)。

益生菌株進(jìn)入消化道后，需要與腸道黏液中的蛋白受體進(jìn)行接觸附著后才能進(jìn)行定植和發(fā)揮作用，并且可以競爭性抑制病原菌與腸黏液的黏附，保護(hù)機(jī)體不受侵害[20]。耐久腸球菌SWUN5857與小鼠的各段腸道的腸黏液都可以很好地發(fā)生黏附，這與其他報(bào)道的乳酸菌黏附作用的研究結(jié)果相似[21-22]，而耐久腸球菌為兼性厭氧菌，且可以形成生物膜[17,23]，這也更利于其在后段腸道內(nèi)進(jìn)行快速定植和發(fā)揮作用。為此，研究也進(jìn)一步觀察了其在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)作用。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)飼喂周期內(nèi)動(dòng)物未出現(xiàn)任何不良表現(xiàn)，提示合理使用該菌株具有安全性。通過短期飼喂，該菌株顯示出了明顯的促進(jìn)生長和免疫器官發(fā)育的作用，這可能與菌株能有效促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群組成、抑制有害菌的生長和增強(qiáng)機(jī)體免疫力有關(guān)[7,26-28]。而本研究結(jié)果也進(jìn)一步證明了SWUN5857可以顯著提高動(dòng)物腸道的黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫的水平，雖然呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，但對于動(dòng)物的早期健康發(fā)育顯示出了積極作用。這一作用可能與菌株本身或細(xì)胞壁成份刺激宿主細(xì)胞，激活樹突狀細(xì)胞，分泌干擾素-γ的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[26]，或者通過合成分泌細(xì)菌素、抗氧化活性酶和降膽固醇相關(guān)酶來提升動(dòng)物的抗病能力有關(guān)[5,8,29-30]。因此，短期的預(yù)防性添加飼喂生物學(xué)效果顯著。此外，分離株SWUN5857在體內(nèi)適應(yīng)性強(qiáng)，因此也更易在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮有益的生物學(xué)作用，而將其作為免疫增強(qiáng)性微生態(tài)制劑的應(yīng)用潛力也值得進(jìn)一步研究。本研究的相關(guān)結(jié)果也為SWUN5857耐久腸球菌作為益生性菌株的開發(fā)應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

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Identification of Enterococcus durans Isolated from Naturally Fermented Yak Milk and Its Probiotic Potentials

HUANG Jian, TONG Jingjing, YUE Hua, TANG Cheng*
(College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China)

This study aimed to screen new probiotics from naturally fermented yak milk. We separated and identified four Enterococcus durans strains by bacterial cultivation, gene sequence alignment and biochemical analysis. These four strains shared 99.4%-99.9% genetic homology by comparison of th eir 16S rRNA sequences with those of eight other E. durans isolates previously reported and were clustered into a separate branch by phylogenetic analysis. Among these isolates, E. durans SWUN5857 exhibited the most robust resistance to acidic and bile salts and could greatly adhere to intestinal mucus in different segments of the intestinal tract in Kunming mice, especially in lower intestines. Moreover, it inhibited the growth of pathogenic Escherichia coli ((17.0 ± 0.3) mm) and Salmonella ((18.0 ± 0.2) mm), and it was also sensitive to common antibiotics in vitro. Mice gavaged with SWUN5857 for a short term showed a significant body weight gain (P ＜ 0.01) and an increase in immune organ indexes. Besides, this treatment also signif i cantly promoted the animal humoral and cellular immunity level (P ＜ 0.01) and enhanced the secretion of intestinal mucosa SIgA (P ＜ 0.01). In conclusion, E. durans SWUN5857 can successfully adapt to the gastrointestinal condition and improve animal growth performance and immunological function, being, therefore, a promising candidate probiotic.

yak milk yogurt; Enterococcus durans; identification; probiotic properties

10.7506/spkx1002-6630-201712007

TS201.3；TS252.54

A

1002-6630（2017）12-0043-07

黃堅(jiān), 童京京, 岳華, 等. 牦牛發(fā)酵酸奶中耐久腸球菌的篩選鑒定和益生特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 43-49.

10.7506/spkx1002-6630-201712007. http：//www.spkx.net.cn

HUANG Jian, TONG Jingjing, YUE Hua, et al. Identification of Enterococcus durans isolated from naturally fermented yak milk and its probiotic potentials[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 43-49. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712007. http：//www.spkx.net.cn

2016-09-06

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2015NZYQN32）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD13B06）

黃堅(jiān)（1984—），男，講師，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床微生物學(xué)。E-mail：huangjian.1122@163.com

*通信作者：湯承（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床微生物學(xué)。E-mail：tangcheng101@163.com