基于Illumina MiSeq技術(shù)分析腌干魚加工過程中微生物群落多樣性

吳燕燕，錢茜茜,2，李來好，陳勝軍，鄧建朝，李春生

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

基于Illumina MiSeq技術(shù)分析腌干魚加工過程中微生物群落多樣性

吳燕燕1，錢茜茜1,2，李來好1，陳勝軍1，鄧建朝1，李春生1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

為研究傳統(tǒng)和乳酸菌法加工腌干魚過程微生物的變化規(guī)律，為優(yōu)化腌干魚工藝提供理論依據(jù)，采用MiSeq測(cè)序技術(shù)，研究腌干魚在不同加工階段的細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明：腌干魚加工過程微生物種類豐富，主要分為三大類：擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變性菌門（Proteobacteria）；藍(lán)圓鲹初始菌相中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為腸桿菌科（Enterbacteriaceae）、腸球菌科（Enterococcactae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和希瓦氏菌科（Shewanellaceae）；海鱸初始菌相中優(yōu)勢(shì)菌主要是氣單胞菌科（Aeromonadaceae）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、腸桿菌科（Enterbacteriaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）、摩式摩根菌科（Moraganellaceae）、鏈球菌科（St reptococcaceae）等。傳統(tǒng)腌制加工過程中菌相比較單一，優(yōu)勢(shì)菌主要是弧菌科（Vibrionaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和動(dòng)性球菌科（Planococcaceae）；而接種乳酸菌發(fā)酵后，加工過程中細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，并且乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌，促進(jìn)了微桿菌科（Exiguobacteracea），葡萄球菌（Staphylococcaceae）等優(yōu)勢(shì)菌的繁殖；此外還檢測(cè)到氣單胞菌（Aeromonadaceae）和乳桿菌（Lactobacillaceae）等傳統(tǒng)藍(lán)圓鲹腌制加工過程中沒有出現(xiàn)的菌。海鱸在腌制加工過程中細(xì)菌多樣性明顯高于藍(lán)圓鲹，乳酸菌法腌制加工過程中細(xì)菌多樣性明顯增加。

腌干魚；Illumina MiSeq測(cè)序；微生物多樣性；優(yōu)勢(shì)菌

傳統(tǒng)腌干魚制品由于其易保存、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛。腌干魚在腌制加工過程中伴隨著極為復(fù)雜的理化變化和微生物變化[1]。多年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)臘魚[2]、咸魚[3-4]、plaa-som[5]等魚制品進(jìn)行菌相分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌、葡萄球菌和微球菌是優(yōu)勢(shì)菌群。腌制食品的加工一般要經(jīng)過腌制和干制兩道工序，腌制主要是食鹽滲透的過程，對(duì)微生物進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，殺死或抑制一部分腐敗菌的生長繁殖；干制則是脫去大部分水分，干制過程中有大量的乳酸菌、微球菌和葡萄球菌生長。傳統(tǒng)的腌干魚制品主要通過自然發(fā)酵生成，但是這種發(fā)酵工藝已不適合現(xiàn)代化生產(chǎn)的要求。這是由于傳統(tǒng)腌干魚肉中的微生物包括魚肉本身自帶的微生物和環(huán)境中混有的雜菌，隨著環(huán)境和加工條件的變化，容易導(dǎo)致發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，影響產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量[6]。因此，人們?cè)絹碓絻A向于應(yīng)用有益微生物來實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的有效控制，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效調(diào)控，并縮短腌制時(shí)間，改善產(chǎn)品品質(zhì)，保證產(chǎn)品的食用安全性[7-9]。

長期以來，微生物群落多樣性研究主要還是基于傳統(tǒng)的分離、純化以及通過一系列繁瑣的生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，這種方法不僅耗時(shí)耗力，而且不能對(duì)分離物進(jìn)行精確鑒定，無法獲得微生物群落多樣性的真正概貌[10]。因?yàn)橛行┪⑸镏荒茉谔囟ǖ沫h(huán)境中生長，有些甚至不可培養(yǎng)[11]。Handelsman等[12]首次提出宏基因組概念：指在特定環(huán)境樣品中基因組的總和，包含細(xì)菌基因組和真菌基因組。宏基因組學(xué)采用新一代的高通量測(cè)序技術(shù)（Illumina MiSeq）直接對(duì)樣品中微生物總DNA進(jìn)行測(cè)序，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，不僅可以檢測(cè)到低豐度的微生物，而且速度快，結(jié)果準(zhǔn)確。聶志強(qiáng)等[12]采用宏基因組技術(shù)對(duì)天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成及其多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果清晰地揭示了食醋這一傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀造過程中豐富的微生物多樣性以及與代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系。除此之外，國內(nèi)外的諸多學(xué)者也用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段清晰地揭示了微生物多樣性變化[13-16]。

本研究從腌干魚加工過程中的幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)取樣，應(yīng)用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)分析樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)以及隨著加工的進(jìn)行微生物群落的變化。探討添加乳酸菌發(fā)酵劑后魚肉中微生物群落的結(jié)構(gòu)變化以及發(fā)酵劑在腌干魚加工過程中能否成為優(yōu)勢(shì)菌，這為優(yōu)化腌干魚的生產(chǎn)工藝提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)圓鲹（Decapterus maruadsi），俗名池魚、巴浪魚，體長30～35 cm，體質(zhì)量200～220 g，冰鮮；海鱸魚（Lateolabrax japonicus），俗名日本真鱸、七星鱸，體長35～40 cm，500～600 g），鮮活，均為市購。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國Omega科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 美國Bio-Rad公司；MiSeq PE250美國Illumina公司；GeneJET膠回收試劑盒 美國Thermo Scientific公司；引物515F和806R由深圳華大基因有限公司合成；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；MM-2快速渦旋混合器 姜堰市沈高康健生化器具廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

腌干魚的制作工藝參照參考文獻(xiàn)[5]，調(diào)整腌制時(shí)間，藍(lán)圓鰺腌制48 h，海鱸腌制72 h。取傳統(tǒng)腌干魚加工過程中4 個(gè)階段產(chǎn)品的背部肌肉部分作為試材，每階段抽2 條魚，裝入無菌自封袋中于－20 ℃冰箱保存待測(cè)。其中，傳統(tǒng)法腌干藍(lán)圓鲹的4 個(gè)階段分別以L1、CLY2、CLP、CLG2表示，合稱為A組。L1：新鮮藍(lán)圓鲹；CLY2：腌制48 h后的樣品；CLP：浸泡脫鹽后的樣品；CLG2：烘干成品。傳統(tǒng)法腌干海鱸的4 個(gè)階段分別以H1、CHY、CHP、CHG表示，合稱為C組。H1：新鮮海鱸魚；CHY：腌制72 h后的樣品；CHP：浸泡脫鹽后的樣品；CHG：烘干成品。

取乳酸菌法腌干魚加工過程中5 個(gè)階段產(chǎn)品的背部肌肉部分作為試材，每階段抽2 條魚，裝入無菌自封袋中于－20 ℃冰箱保存待測(cè)。其中，乳酸菌法腌干藍(lán)圓鲹的5 個(gè)階段分別以L2、SLY、SLP、SLJ、SLG表示，合稱為B組。L2：新鮮藍(lán)圓鲹；SLY：腌制24 h后的樣品；SLP：浸泡脫鹽后的樣品；SLJ：接種發(fā)酵17 h后的樣品；SLG：烘干成品。乳酸菌法腌干海鱸5 個(gè)階段分別以H2、SHY、SHP、SHJ、SHG表示，合稱為D組。H2：新鮮海鱸魚；SHY：腌制24 h后的樣品；SHP：浸泡脫鹽后的樣品；SHJ：接種發(fā)酵17 h后的樣品；SHG：烘干成品。

1.3.2 細(xì)菌總DNA的提取

取20 g剪碎樣品，置于300 mL的錐形瓶里，加入220 mL無菌生理鹽水，振蕩混勻，取1 mL混合液于裝有9 mL滅菌LB肉湯培養(yǎng)基的試管中富集培養(yǎng)24 h。采用美國Omega科技有限公司的提取試劑盒（DP302）提取細(xì)菌基因組DNA，提取步驟參照試劑盒產(chǎn)品說明書。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序

研究表明16S rDNA高變區(qū)序列所得到的物種信息與其全長序列結(jié)果差異不大，且高變區(qū)片段更短，在進(jìn)行大量的數(shù)據(jù)分析時(shí)不僅能夠提高研究效率，而且可以降低成本[17]。故設(shè)計(jì)細(xì)菌的16S rDNA序列V4片段擴(kuò)增的通用引物，正向引物選用515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’），反向引物選用806R（5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’）。PCR反應(yīng)體系：4 μL Primer Cocktail，25 μL Master Mix，2 μL DNA和19 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，等濃度混樣，使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物，建庫（NEB Next?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina）并于Illumina MiSeq PE250（PE251+8+251）上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode將下機(jī)數(shù)據(jù)（raw data）拆分為不同樣品數(shù)據(jù)，并截去Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列。使用FLASH[18]（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），將reads拼接成Raw Tags，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags[19]，將經(jīng)上述處理后的Tags與Gold database（v20110519）進(jìn)行比對(duì)（UCHIME Algorithm）檢測(cè)嵌合體序列[20]，除去嵌合體序列得到Effective Tags。用UPARSE在97%相似度條件下進(jìn)行聚類，得到OTU的代表序列（OTUs）。得到OTU代表序列后，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫有比對(duì)進(jìn)行物種注釋[21]，置信度閾值設(shè)置為0.8，并用R（v3.1.1）軟件繪制主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。同時(shí)計(jì)算α-多樣性，包括物種觀察指數(shù)（observed species index）、趙氏指數(shù)（Chao index）、艾斯指數(shù)（ACE index）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）及辛普森指數(shù)（Simpson index），用稀釋曲線評(píng)價(jià)測(cè)序深度[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-多樣性分析

α-多樣性反映了單個(gè)樣品內(nèi)部物種的多樣性，Chao index反映樣品中群落的豐富度，即簡單指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況，Shannon index反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。

表1 腌干魚加工過程-多樣性Table1 -Diversity measurement for dried-salted fish from different processing stages

經(jīng)過拼接，過濾等[23]一系列處理，藍(lán)圓鲹在傳統(tǒng)腌制加工過程中共獲得104 474 條細(xì)菌序列，在乳酸菌輔助腌制加工過程中共獲得131 434 條細(xì)菌系列；海鱸在傳統(tǒng)腌制加工過程中共獲得細(xì)菌序列105 289 條，在乳酸菌輔助腌制加工過程中共獲得細(xì)菌序列131 745 條。從這些數(shù)據(jù)可以看出乳酸菌輔助腌制加工方法中細(xì)菌多樣性比傳統(tǒng)法豐富，海鱸腌制加工過程中的細(xì)菌多樣性略高于藍(lán)圓鲹。不同加工階段的樣品微生物多樣性指數(shù)，如表1所示，腌干魚在腌制階段微生物多樣性呈下降趨勢(shì)，由于高濃度食鹽的滲入以及發(fā)酵產(chǎn)生的低pH值殺死了部分微生物，到漂洗階段，魚肉充分暴露在空氣中使得細(xì)菌多樣性增加，干燥階段隨著水分活度的降低，微生物多樣性也相應(yīng)降低。總體上細(xì)菌物種多樣性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。圖1的樣品稀釋曲線也展示了這一趨勢(shì)。圖1曲線均已達(dá)到平坦期，即測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有微生物。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

圖2為A、B、C、D組間α-多樣性盒形圖，更直觀顯示組間α-多樣性差異。observed species index、Chao index、ACE index反映樣品中群落的豐富度；Shannon index以及Simpson index反映群落的多樣性。Simpson index越小，代表樣品中的物種越豐富，從表1可以看出，海鱸魚中的微生物多樣性明顯比藍(lán)圓鰺豐富，加入乳酸菌發(fā)酵劑之后，促進(jìn)了優(yōu)勢(shì)菌的生長繁殖，因此也豐富了物種多樣性，所以海鱸魚多樣性高于藍(lán)圓鰺，乳酸菌法高于傳統(tǒng)法。從圖2 α-多樣性盒形圖也可以看出，與其他3 組相比，D組的observed species index、Chao index、ACE index和Shannon index均較高，而Simpson index較低。因此，D組樣品具有最高的細(xì)菌多樣性，其次為C組＞B組＞A組。

圖2 2 α-多樣性指數(shù)的箱圖Fig.2 Boxplots of α-diversity indexes

2.2 OUT PCA

圖3 腌干魚加工過程中細(xì)菌OTU的主成分分析圖（A）及其科水平分類上的熱圖（B）BFig.3 Principal component analysis (PCA) profile (A) and heatmap at family level (B) of microbial populations in dried-salted fish from different processing stages

由圖3可見，4 組樣品聚類在一起，PCA獲得PC1的貢獻(xiàn)率為27.45%，PC2的貢獻(xiàn)率為17.38%；從科水平上的豐度熱圖顯示腌干魚在加工過程中的主要菌群來自黃色單胞菌科（Xanthomondaceae）、Comamonadaceae、彎曲菌科（Campylobacteraceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、Lactobacillaceae、Vibrionaceae、Streptococcaceae、Aeromonadaceae、莫拉菌科（Moraxellaceae）、動(dòng)性球菌科（Planococcaceae）、Exiguobacteraceae、未分類科（Unclassified）、Shewanellaceae、Enterococcaceae、Enterbacteriaceae、Pseudomonadaceae、Staphylococcaceae、Bacillaceae。其中，Staphylococcaceae、Enterbacteriaceae、Aeromonadaceae、Vibrionaceae為優(yōu)勢(shì)菌群。

2.3 OUT韋恩圖分析

在97%的相似度條件下，得到了每個(gè)樣品的OTU個(gè)數(shù)，利用Venn圖可以展示多樣品共有和各自特有OTU數(shù)目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況[24]。結(jié)合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的核心微生物。圖4a為腌干魚加工過程細(xì)菌OTU venn圖分析結(jié)果，可以很直觀地看出，在不同加工階段，細(xì)菌多樣性有很大差異，但各個(gè)加工階段又都含有共同的OUT數(shù)，藍(lán)圓鲹在傳統(tǒng)腌制加工各階段中共有4 個(gè)OUT，在乳酸菌輔助低鹽腌制加工各階段共有10 個(gè)OUT；海鱸在傳統(tǒng)腌制加工各階段中共有23 個(gè)OUT，在乳酸菌輔助低鹽腌制加工各階段共有15 個(gè)OUT；并且共有的OUT數(shù)均占總OUT數(shù)的一半以上，說明腌干魚在不同加工階段中的核心微生物是一樣的。圖4b為腌干魚在兩種不同方法加工過程中細(xì)菌OTU venn圖分析結(jié)果，可以很直觀的看出，同種魚在不同加工方法中核心微生物大致相同。

圖4 OTU韋恩圖分析Fig.4 Shared OTU across different samples or groups

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

圖5 基于科水平腌干魚加工過程細(xì)菌群結(jié)構(gòu)Fig.5 Family-level community structure of bacteria in dried-salted fish from different processing stages

科水平描述腌干魚加工過程微生物菌群結(jié)構(gòu)變化如圖5所示。本實(shí)驗(yàn)自定義相對(duì)豐度不小于20%的菌群為優(yōu)勢(shì)菌群。由圖5藍(lán)圓鰺處理組可知，新鮮藍(lán)圓鲹初始菌相中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Enterbacteriaceae、Enterococcactae、Pseudomonadaceae、Shewanellaceae，傳統(tǒng)腌制加工過程中菌相比較單一，優(yōu)勢(shì)菌主要是Vibrionaceae、Staphylococcaceae、Pseudomonadaceae、Planococcaceae，而乳酸菌輔助腌制加工過程中細(xì)菌多樣性明顯增加，接種乳酸菌發(fā)酵后，乳酸菌成為了優(yōu)勢(shì)菌，并且促進(jìn)了Exiguobacteraceae、Staphylococcaceae等優(yōu)勢(shì)菌的繁殖。而且還出現(xiàn)了Aeromonadaceae、Lactobacillaceae等傳統(tǒng)藍(lán)圓鲹腌制加工過程中沒有檢測(cè)到的菌。由圖5海鱸處理組明顯看出，海鱸在腌制加工過程中細(xì)菌多樣性明顯高于藍(lán)圓鲹，這與圖2 α-多樣性指數(shù)的箱圖顯示的結(jié)果一致。新鮮海鱸中初始菌相中優(yōu)勢(shì)菌主要是Aeromonadaceae、Bacillaceae、Staphylococcaceae、Comamonadaceae、Enterbacteriaceae、Enterococcaceae、Moraganellaceae、Streptococcaceae等，乳酸菌輔助腌制加工過程中細(xì)菌多樣性也略有增加。

藍(lán)圓鲹在傳統(tǒng)腌制過程中Enterbacteriaceae、Enterococcaceae發(fā)生了明顯變化，在腌制后的過程中，這兩種微生物相對(duì)豐度減為0，說明腌制過程由于高濃度食鹽的滲入可以有效降低腐敗菌的繁殖，提高食品的安全品質(zhì)。在腌制階段產(chǎn)生了弧菌，并在之后的漂洗和干燥階段抑制處于優(yōu)勢(shì)地位，Vibrionaceae與生物胺的形成息息相關(guān)。而接種乳酸菌發(fā)酵后，Enterbacteriaceae、Pseudomonadaceae數(shù)量有所減少，Vibrionaceae在整個(gè)加工過程中也沒有檢測(cè)到，說明接種的乳酸菌發(fā)酵劑可以抑制產(chǎn)生物胺菌的生長繁殖，從而降低產(chǎn)品中生物胺含量。乳酸菌和葡萄球菌一躍成為優(yōu)勢(shì)菌，研究表明，乳酸菌和葡萄球菌可以影響腌干魚制品風(fēng)味的形成。其中葡萄球菌和微球菌能夠代謝產(chǎn)生硝酸鹽還原酶和過氧化氫酶，形成并穩(wěn)定色澤[25]。同時(shí)，還可以分解蛋白質(zhì)和脂肪，使得游離氨基酸和脂肪酸以及醛、酮等小分子物質(zhì)增加，促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味形成。葡萄球菌科的微生物還參與脂肪的降解過程，對(duì)脂肪酸的釋放有一定的影響。大量的脂肪酸被釋放出來，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成甲基酮和醛等揮發(fā)性風(fēng)味成分。乳酸菌不僅含有一般微生物所產(chǎn)生的有關(guān)酶，還可以產(chǎn)生 能夠分解脂肪酸、亞硝胺，控制內(nèi)毒素等特殊酶系[26]，進(jìn)而改善產(chǎn)品風(fēng)味。

海鱸在傳統(tǒng)腌制階段E n t e r o c o c c a c e a e、Pseudomonadaceae數(shù)量明顯減少，Shewanellaceae、Streptococcaceae、Campylobacteraceae增加，漂洗階段變化最明顯的是Aeromonadaceae增加以及Shewanellaceae相對(duì)豐度減少。而干燥階段的優(yōu)勢(shì)菌則為Campylobacteraceae、Planococcaceae、Staphylococcaceae、Streptococcaceae。而接種乳酸菌發(fā)酵劑后，海鱸中微生物種類和相對(duì)豐度均明顯增加，但到干燥階段隨著環(huán)境溫度的升高及水分活度的減少，其菌相變得較單一，干燥成品中的優(yōu)勢(shì)菌僅為Campylobacteraceae、Staphylococcaceae和Streptococcaceae。

綜上所述，微生物群落結(jié)構(gòu)不僅與腌制工藝有關(guān)，還與魚的品種有著密切關(guān)系。

3 討 論

對(duì)腌干魚加工過程各階段樣品通過試劑盒提取DNA，特異性引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，是各個(gè)時(shí)期各種微生物的16S rDNA的混合物，代表了該加工階段樣品的微生物群體。

由微生物數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析結(jié)果，腌干魚加工過程反映了細(xì)菌種群的多樣性特點(diǎn)。其中，藍(lán)圓鲹在初始階段漫游球菌（Vagococcus）和耶爾森菌（Yersinia）是文庫中的優(yōu)勢(shì)類別，相對(duì)豐度分別為18.75%～40.00%和40.00%～88.23%，隨著傳統(tǒng)腌制加工的進(jìn)行，弧菌（Vibrio）成為豐度最高的屬類，所占比例為40.00%～97.24%，葡萄球菌（Staphylococcus）成為次要優(yōu)勢(shì)菌，所占比例為0%～40.00%。但隨著乳酸菌發(fā)酵劑的加入，樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，弧菌（Vibrio）不再是優(yōu)勢(shì)菌，甚至已經(jīng)消失。未分類的菌屬急劇增加，成為主要優(yōu)勢(shì)菌，片球菌（Pediococcus）和希瓦氏菌（Shewanella）成為次要優(yōu)勢(shì)菌。海鱸在初始階段菌相比藍(lán)圓鲹復(fù)雜，包含11個(gè)屬的微生物，乳球菌（Lactococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）、漫游球菌（Vagocuccus）、耶爾森菌（Yersinia）和未分類的屬是文庫中的優(yōu)勢(shì)菌，最高相對(duì)豐度均大于40.00%。隨著傳統(tǒng)腌制加工的進(jìn)行，細(xì)菌種類并沒有明顯增加，但物種變化較大。乳球菌（Lactococcus）屬和漫游球菌（Vagocuccus）屬在整個(gè)加工階段一直處于優(yōu)勢(shì)地位，到了腌制和干燥階段，乳球菌（Lactococcus）的數(shù)量達(dá)到較大值（42.31%～59.42%），這一階段微生物最活躍，各種微生物在酶的作用下迅速分解肌肉中的蛋白質(zhì)和脂肪[27]，生成小分子物質(zhì)，使腌干魚風(fēng)味品質(zhì)變好。期間pH值的降低和水分活度的降低，即使在初始菌相中存在下來的腸桿菌、腸球菌和假單胞菌等活動(dòng)也會(huì)受到抑制，只有抗酸性比較強(qiáng)的細(xì)菌才能存活下來。加入乳酸菌輔助發(fā)酵后，葡萄球菌屬和乳球菌屬的相對(duì)豐度明顯增加，它們?cè)谥蟮募庸み^程中將會(huì)對(duì)制品風(fēng)味產(chǎn)生良好影響[28]。

腌干魚在加工過程中微生物群落分析目前還沒有前人做過詳細(xì)分析，但是與生物胺相關(guān)的微生物有前人做過相關(guān)研究，假單胞菌、弧菌是產(chǎn)生物胺優(yōu)勢(shì)微生物，而腌制食品中的生物胺含量較高[29]，這為產(chǎn)胺微生物的生長 提供了充足的條件，這可能是假單胞菌和弧菌等是優(yōu)勢(shì)菌的重要原因。

藍(lán)圓鲹是海產(chǎn)魚中的青皮紅肉魚類，肌肉中含血紅蛋白較多，因此組氨酸含量也較高，這為產(chǎn)組胺微生物的生長提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)，所以，組胺生成菌弧菌（Vibrio）和葡萄球菌（Staphylococcus）為藍(lán)圓鲹加工中的優(yōu)勢(shì)菌。海鱸 是養(yǎng)殖品種中的白色魚肉，組氨酸含量明顯低于青皮紅肉魚，因此產(chǎn)組胺微生物（弧菌和葡萄球菌）并不占優(yōu)勢(shì)。

研究表明，Miseq測(cè)序比一般的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法反映的細(xì)菌種類多，能夠更好地反映腌制食品體系中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的多樣性及變化，主要是由于MiSeq測(cè)序讀長和質(zhì)量可以通過比較每組配對(duì)的閱讀框的末端片段并拼接成為單個(gè)片段的方式得到提高，這使得研究人員使用Illumina MiSeq得到和通過454焦磷酸測(cè)序得到的序列長度相似的合并序列，這樣不但可以降低測(cè)序成本，還可以提高測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量[30]。

4 結(jié) 論

通過宏基因組技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)腌干魚和乳酸 菌法腌干魚各加工階段的微生物群落多樣性分析表明，加工過程中細(xì)菌多樣性十分豐富，主要分為三大類：Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria；藍(lán)圓鲹初始菌相中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Enterbacteriaceae、Enterococcactae、Pseudomonadaceae、Shewanellaceae，新鮮海鱸中初始菌相中優(yōu)勢(shì)菌主要是Aeromonadaceae、Bacillaceae、Staphylococcaceae、Comamonadaceae、Enterbacteriaceae、Enterococcaceae、Moraganellaceae、Streptococcaceae等。傳統(tǒng)腌制加工過程中菌相比較單一，優(yōu)勢(shì)菌主要是Vibrionaceae、Staphylococcaceae、Pseudomonadaceae、Planococcaceae；而乳酸菌法腌制加工過程中 細(xì)菌多樣性在總體上呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，接種乳酸菌發(fā)酵后，乳酸菌成為了優(yōu)勢(shì)菌，并且促進(jìn)了Exiguobacteracea、Staphylococcaceae等優(yōu)勢(shì)菌的繁殖。海鱸在腌制加工過程中細(xì)菌多樣性明顯高于藍(lán)圓鲹，乳酸菌法腌制海鱸過程細(xì)菌多樣性比傳統(tǒng)法多，而乳酸菌法腌制藍(lán)圓鲹過程中出現(xiàn)了在傳統(tǒng)腌制過程沒有的Aeromonadaceae、Lactobacillaceae等菌。

腌干魚加工過程中細(xì)菌多樣性與加工方法和魚的品種有密切關(guān)系。乳酸菌法腌干魚的技術(shù)是本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的快速魚類腌制加工技術(shù)[5-6]，目的是在保持腌干魚制品保持傳統(tǒng)腌干魚特有風(fēng)味的同時(shí)，縮短加工時(shí)間，提升產(chǎn)品安全性和風(fēng)味特性，通過對(duì)其微生物多樣性分析也進(jìn)一步證明該技術(shù)在加工過程細(xì)菌多樣性更豐富，特別是有益的微生物成為優(yōu)勢(shì)菌，這為乳酸菌法腌干魚加工技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

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Microbial Community Diversity in Dried-Salted Fish during Processing Revealed by Illumina MiSeq Sequencing

WU Yanyan1, QIAN Xixi1,2, LI Laihao1, CHEN Shengjun1, DENG Jianchao1, LI Chunsheng1
(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this study, we investigated the microbial variations during the processing of traditional salted fish and lactic acidfermented fish, aiming to provide a theoretical basis for the new processing technology. Illumina MiSeq sequencing was applied to analyze the microbial community diversity in dried-salted fish during different processing stages. The results indicated that the processing system contained highly diverse bacteria, which could be mainly divided into three categories： Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria. Enterbacteriaceae, Enterococcactae, Pseudomonadacea and Shewanellaceae were dominant microorganisms in brown-striped mackerel scad (Decapterus maruadsi) during the initial stages of processing while Aeromonadaceae, Bacillaceae, Staphylococcaceae, Comamonadaceae, Enterbacteriaceae, Enterococcaceae, Moraganellaceae and Streptococcaceae were dominant microorganisms in sea bass (Lateolabrax japonicus). The microbial community was homogeneous during the traditional curing process, and the dominant microorganisms identified were Vibrionaceae, Staphylococcaceae, Pseudomonadaceae and Planococcaceae. After inoculation of lactic acid bacteria, the microbial diversity during the fermentation process showed an increasing trend, and lactic acid bacteria became dominant and promoted the growth of the dominant bacteria Exiguobacteracea and Staphylococcaceae; Aeromonadaceae and Lactobacillaceae, which did not appear during the traditional processing, were detected. Microbial community diversity in sea bass during the curing process was significantly higher than thatin brown-striped mackerel scad. Microbial community diversity was also increased markedly during the processing of lactic acidfermented fish.

dried-salted fish; Illumina MiSeq sequencing; microbial community diversity; dominant bacteria

10.7506/spkx1002-6630-201712001

2016-06-12

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371800；31571869）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（A201301C01）；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（A201501C02）

吳燕燕（1969—），女，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail：wuyygd@163.com

TS254.1

A

1002-6630（2017）12-0001-08

吳燕燕, 錢茜茜, 李來好, 等. 基于Illumina MiSeq技術(shù)分析腌干魚加工過程中微生物群落多樣性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 1-8.

10.7506/spkx1002-6630-201712001. http：//www.spkx.net.cn WU Yanyan, QIAN Xixi, LI Laihao, et al. Microbial community diversity in dried-salted fish during processing revealed by Illumina MiSeq sequencing[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 1-8. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712001. http：//www.spkx.net.cn