高效液相色譜法測定彩色馬鈴薯中維生素C含量

王輝，劉輝，劉嘉，呂都，李俊，陳朝軍，董楠，唐健波，陳中愛，劉永翔

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006）

高效液相色譜法測定彩色馬鈴薯中維生素C含量

王輝，劉輝，劉嘉，呂都，李俊，陳朝軍，董楠，唐健波，陳中愛，劉永翔*

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006）

建立高效液相色譜法快速測定彩色馬鈴薯黑美人、紅寶石中維生素C含量的方法。樣品采用2%草酸提取，利用高效液相色譜技術(shù)，以0.05 mol/L，pH2.5的磷酸-甲醇（90∶10）緩沖液為流動相，通過C18色譜柱分離，采用紫外檢測器，在245nm波長下測定維生素C的吸光值，將吸光值與標(biāo)準品進行比較，保留時間可以對其進行定性，以峰面積進行定量。結(jié)果表明，方法的線性范圍0.02 g/L～0.1 g/L，檢出限為0.002 g/L，線性回歸方程為yb=5 622 000x+69 538，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。通過回收實驗，黑美人與紅寶石馬鈴薯VC測定回收率分別為97.61%～99.81%，97.28%～99.82%，相對標(biāo)準偏差分別為0.90%、1.02%。用高效液相色譜法、紫外分光光度法、碘滴定法分別測定黑美人中VC含量分別為（21.27±0.19）、（19.92±0.13）、（23.31±0.11）mg/100 g，紅寶石中VC含量分別為（18.28±0.19）、（17.68±0.14）、（21.76±0.09）mg/100 g。與甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)測試中心檢測結(jié)果相比較（黑美人21.73 mg/100 g；紅寶石18.74 mg/ 100 g），表明高效液相色譜法獲得結(jié)果更準確可靠。本研究所建立的高效液相色譜法可快速、靈敏、準確、穩(wěn)定的對彩色馬鈴薯中的維生素C進行測定，同時適用于其它同類果蔬（草莓、刺梨、青菜等）中VC含量的測定。

高效液相色譜；黑美人土豆；紅寶石土豆；維生素C

通常所說的彩色馬鈴薯一般是指塊莖的皮或肉為紅、藍、紫、橙色等的馬鈴薯品種[1]。“黑美人”馬鈴薯是一種表皮與果肉均呈黑紫色的馬鈴薯品種，而“紅寶石”馬鈴薯是一種表皮與果肉均呈紅色的馬鈴薯品種，由于它們富含普通馬鈴薯所缺乏的花青素，同時VC、胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)含量顯著高于普通馬鈴薯，使其兼具抗癌、抗衰老、美容和防止高血壓等多種保健功能[2-3]。尤其是VC，它對人體正常生理代謝的平衡具有重要意義，同時還對缺鐵性貧血、白內(nèi)障和心血管疾病的防治起著重要作用[4]。但是，人體自身不能合成維生素C，而必須從外來食物中攝取，而維生素C廣泛存在于果蔬中[5]。因此，測定彩色馬鈴薯中維生素C的含量，對更深刻了解和宣傳彩色馬鈴薯的營養(yǎng)價值和保健功能具有重要的推動意義，也為以彩色馬鈴薯為原料開發(fā)各種營養(yǎng)豐富、健康、安全的食品奠定理論基礎(chǔ)。

根據(jù)不同的原理，維生素C含量的測定方法有很多種，一般包括電化學(xué)法、紫外分光光度法、熒光法、酶法、比色法（2，4-二硝基苯肼比色法）、滴定法（碘滴定法、2，6-二氯靛酚鈉滴定法）等。這些方法中，尤其是滴定法所需試劑較多，操作過程多而繁瑣，測定過程中需要用到一些有毒、致癌物質(zhì)，如碘化汞、2，4-二硝基苯肼、重鉻酸鉀等[6-8]。近年來，高效液相色譜法由于其高效、快速、穩(wěn)定可靠的特點，被廣泛應(yīng)用于果蔬、食品、藥物等中的維生素C含量的測定[9]，在馬鈴薯中VC的測定也有見報導(dǎo)[10]。但是，由于彩色馬鈴薯中含有大量的花青素、酚酸等有色物質(zhì)，用經(jīng)典二氯法無法測定其VC含量，而碘滴定法[11]、紫外分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]可取得較好的效果。因此，必須采用特殊方法減少或排除其干擾。本研究的目的主要是對高效液相色譜分離條件進行優(yōu)化，建立一種簡便、快捷、穩(wěn)定的彩色馬鈴薯中維生素C含量測定方法，并可應(yīng)用于其它呈色物質(zhì)維生素C的含量測定。同時，比較碘滴定法、紫外分光光度法、高效液相色譜法在測定彩色馬鈴薯中VC含量的優(yōu)缺點，為有色物質(zhì)中VC的測定提供技術(shù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-M 20A二極管陣列檢測器為、SIL-20A自動進樣器為、LC-20A高壓輸液泵為：日本島津公司；色譜柱為BDS-HYPERSIL-C18柱（5 μm，250 mm，4.6 mm）：美國Thermo公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；九陽（Joyoung）JYZ-V906原汁機：九陽股份有限公司；TP311臺式精密酸度計：北京時代新維測控設(shè)備有限公司；ELGA超純水機：北京萊特萊德公司。

1.1.2 試劑

超純水由實驗室制水機獲得；維生素C標(biāo)準對照品（優(yōu)級純，純度為99.7%）：中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；磷酸、甲醇（色譜純）：中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司；草酸（分析純）：貴州金摩爾化學(xué)有限公司；碘滴定法、紫外分光光度法所需的各種試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；黑美人、紅寶石馬鈴薯：貴州省生物技術(shù)（馬鈴薯）研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將新鮮馬鈴薯洗干凈，去皮，然后稱取5 g剁碎，置于研缽中，加入2%草酸溶液5 mL，研磨成漿，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用2%草酸洗滌研缽數(shù)次，然后用超純水定容至刻度，充分混勻后過濾，計算所得濾液體積。吸取10 mL濾液于25 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度。樣品分析前用0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2 VC標(biāo)準溶液的制備

準確稱取VC標(biāo)準品50 mg于50 mL燒杯中，用2%草酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，稀釋至刻度，得1 g/L VC標(biāo)準液。檢測前用2%草酸溶液分別配制質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 mg/L VC標(biāo)準溶液。

1.2.3 色譜檢測條件

pH=2.5，流動相A為0.05 mol/L磷酸，流動相B為甲醇，A∶B=9∶1（體積比），流速為0.8 mL/min；檢測波長為245 nm，進樣量為10 μL，柱箱溫度為32℃。

1.2.4 碘滴定法和紫外分光光度法測定VC含量

碘滴定法與紫外分光光度法分別參照陳曼云等[11]，朱兆富等[12]的方法，每種方法、每種樣品均重復(fù)6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 VC檢測波長的選擇

通過UV-2450日本島津紫外可見分光光度計掃描VC標(biāo)準液的吸收光譜，在245 nm處有最大吸收值，故本研究選擇245 nm作為檢測波長。

2.2 樣品溶劑的選擇

VC在空氣中不穩(wěn)定，受空氣、熱、光等因素影響，極易被氧化，尤其是在堿性環(huán)境中被氧化得更快，但是在酸性介質(zhì)中，它受空氣氧化的速度稍慢，較為穩(wěn)定。2%草酸有抑制抗壞血酸氧化酶的作用，過高或過低濃度，抗壞血酸氧化酶的抑制效果均要減小[14]。因此，采用2%的草酸來配制VC標(biāo)準溶液和提取樣品中的VC是為了減慢它的氧化分解速度，降低測定結(jié)果誤差。

2.3 流動相的選擇

VC在酸性環(huán)境中能保持其較好的穩(wěn)定性，另外，高濃度酸會腐蝕泵和柱子，減小其使用壽命，因此，本研究選擇濃度為0.05 mol/L的磷酸溶液作為流動相；流動相中添加少量的甲醇可以起到加快出峰時間和縮短分析時間的作用，同時可改善色譜峰型。色譜最佳pH的選擇和流動相（磷酸與甲醇）配比的選擇參考侯璐等[9]的方法，分別選擇為pH=2.5，A∶B=90∶10（體積比），流速為0.8 mL/min。

2.4 標(biāo)準曲線的繪制

將配置好的各濃度標(biāo)準溶液用0.45 μm濾膜過濾后，進樣10 μL，測定VC標(biāo)準溶液相對應(yīng)的峰面積；然后以VC標(biāo)品質(zhì)量濃度與相對應(yīng)峰面積分別作自變量和因變量，繪制標(biāo)準工作曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 維生素C標(biāo)準品色譜圖與標(biāo)準工作曲線Fig.1 Standard work curve of Vitamin C

所得曲線方程為yb=5 622 000x+69 538，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，表明曲線具有很好的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，本方法的線性范圍較寬，在0.02 g/L～0.1 g/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。以2倍基線噪聲所對應(yīng)的濃度，計算出本方法VC的檢出限為0.002g/L。從VC標(biāo)準品的色譜圖中，可以看到兩個譜峰。通過比較兩個譜峰的峰面積，譜峰a（保留時間5.369 min）在各濃度的標(biāo)準品溶液中的峰面積變化與VC質(zhì)量濃度相關(guān)系數(shù)只有0.103，不呈現(xiàn)線性關(guān)系，而譜峰b（保留時間5.708 min）呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，因此可以斷定，譜峰b是VC的測定譜峰。譜峰a可能是草酸的吸收峰。

2.5 維生素C含量的測定與精密度試驗

同一馬鈴薯品種在相同試驗條件下重復(fù)測定8次，測得黑美人馬鈴薯與紅寶石馬鈴薯中VC平均含量分別為21.27、18.28 mg/100 g，測定結(jié)果見表1，兩個馬鈴薯品種的VC色譜圖見圖2。

表1 彩色馬鈴薯維生素C含量測定結(jié)果及精密度（n=8）Table 1 The testing results and accuracy of vitamin C in color potatoes（n=8）

表1結(jié)果表明，精密度試驗的標(biāo)準偏差小于2%，表明該方法重復(fù)性較好。從色譜圖中可以看出，維生素C大約在6min出峰，從而該法具有快速、靈敏的特點。

圖2 黑美人與紅寶石馬鈴薯維生素C的色譜圖Fig.2 The chromatogram map of vitamin C from black beauty and red ruby potatoes

2.6 回收率試驗

在同一組容量瓶中，分別加入等量的馬鈴薯樣品，然后再分別加入不同量的VC標(biāo)準溶液，測定其回收率，試驗結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果Table 2 Recover rate of vitamin C

表2結(jié)果顯示，黑美人馬鈴薯VC回收率為91.36%～99.82%，紅寶石馬鈴薯回收率為89.82%～98.09%，符合定量分析中準確度的要求。

2.7 高效液相色譜法與紫外分光光度法、碘滴定法的比較

3種VC檢測法測定彩色馬鈴薯VC含量的結(jié)果比較結(jié)果見表3。

表3 3種VC檢測法測定彩色馬鈴薯VC含量的結(jié)果比較Table 3 The vitamin C content comparison among three kinds of determination methods

由表3可知，高效液相色譜法、紫外分光光度法、碘滴定法測得黑美人馬鈴薯中VC含量分別為21.27、19.92、23.31 mg/100 g，紅寶石中VC含量分別為18.28、17.68、21.76 mg/100 g。

3 討論

通過以上結(jié)果分析，表明本試驗采用的高效液相色譜法是可靠的，試驗過程中沒有用到特殊試劑，樣品提取簡單快捷，從而可減少VC的氧化損失。因此，可以避免比色法、滴定法等檢測有色樣品過程中易出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏離、檢測值偏高等問題。結(jié)果重現(xiàn)性好，準確度及回收率高，可用于彩色馬鈴薯及其制品中VC含量的測定，具有較好的實際應(yīng)用價值。高效液相色譜法已廣泛應(yīng)用于植物及藥劑中VC含量的測定，如刺梨[9]、草莓[13]、番茄[15]等。不同點在于它們所使用的流動相和提取劑有差異，但是均有一個共同的特點，即保持VC在一個酸性環(huán)境中，所使用的試劑均為酸性物質(zhì)，以維持VC的穩(wěn)定性[14]。如刺梨VC測定中，用的提取劑是1 mg/mL偏磷酸，流動相為0.05 mol/L磷酸[9]；草莓中VC測定采用的提取劑與流動相均為0.1%草酸[13]。本實驗所采用的提取劑為2%草酸，流動相為0.05 mol/L磷酸，取得較好的分離和測定效果。

由于VC對在光環(huán)境中不穩(wěn)定，且遇氧易分解，因此本試驗全程應(yīng)注意避光操作，樣品處理及檢測應(yīng)在最短時間內(nèi)完成；本試驗均使用棕色容量瓶定容[16]；流動相、樣品和標(biāo)準品提取試劑均使用2%的草酸，獲得較好的分離效果，且樣品處理過程操作簡便，試驗程序簡化；流動相均需色譜純試劑，水為超純水，注意流動相在脫氣后盡量不引起氣泡；流動相溶液pH選擇2.5，其值在色譜柱最適宜的操作范圍之內(nèi)，但由于酸度較低，為防止色譜柱酸化，延長色譜柱使用壽命，色譜柱在使用完畢需用超純水清洗30 min，然后用甲醇沖洗30 min；所有過柱子的液體均需嚴格的過濾；清洗壓力不宜過大，控制在15 MPa以內(nèi)為佳。

同葡萄汁、草莓等水果一樣，黑美人馬鈴薯與紅寶石馬鈴薯VC提取液中，含有很深的有色物質(zhì)，用傳統(tǒng)的2，6-二氯靛酚鈉滴定法對深色樣品測定時，因顏色的干擾而難以判定終點，故不適用于深色果蔬樣品的測定[17]。對于深色果蔬樣品中VC含量的測定，目前常用的方法有電位滴定法[17]、碘滴定法[11]、紫外分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]等。采用紫外分光光度法時，由于深色物質(zhì)中有些成分（主要是有機酸、多糖等）在紫外區(qū)也有吸收光譜，對測定結(jié)果的準確性產(chǎn)生較大的影響，因此，測定時須對樣品紫外區(qū)本底吸收進行校正，方式包括降低Cu2+濃度、加熱等[12]。本研究，比較分析了高效液相色譜法、紫外分光光度法、碘滴定法測定彩色馬鈴薯中VC含量的準確性差異，結(jié)果表明，用這3種方法測得黑美人馬鈴薯中VC含量分別為21.27、19.92、23.31 mg/100 g，紅寶石中VC含量分別為18.28、17.68、21.76 mg/100 g。經(jīng)甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)測試中心檢測（理論值），黑美人和紅寶石馬鈴薯中維生素C含量分別為21.73、18.74 mg/100 g，表明高效液相色譜法所測得結(jié)果與理論值較相符；紫外分光光度法所測結(jié)果與理論值相差不大；碘滴定法所測VC含量要高于理論值，分析的原因是滴定過程中顏色變化不好判定，影響其測定準確性[9]。綜上所分析，表明高效液相色譜法可快速、靈敏、準確、穩(wěn)定的對彩色馬鈴薯中的維生素C進行測定。

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Determination of Vitamin C in Colorful Potatoes by High Performance Liquid Chromatography

WANG Hui，LIU Hui，LIU Jia，Lü Du，LI Jun，CHEN Chao-jun，DONG Nan，TANG Jian-bo，CHEN Zhong-ai，LIU Yong-xiang*
（Institute of Guizhou Biotechnology，Guizhou Academy of Agriculture Science，Guiyang 550006，Guizhou，China）

A rapid method for determination of vitamin C in colorful potato species Solanum tuberosum black beauty and red ruby was established by high performance liquid chromatography（HPLC）.Vitamin C in potatoes was extracted by 2%oxalic acid，then separated through a C18chromatographic column with the phosphoric acid-methanol buffer（0.05 mol/L，pH2.5）as the mobile phase.Thereafter，the vitamin C was detected by ul traviolet-visible detector at the wavelength of 245 nm.The absorbance in samples was compared with the standard substance，which qualitative determination was according to the retention time，and quantitative determination was according to the peak area.The results showed that the linear range of the present method was 0.02 g/L-0.1 g/L，the detection limit was 0.002 g/L，and the linear equation was yb=5 622 000x+69 538，the related coefficient was 0.999 9.After the recovery experiment，the recoveries were 97.61%-99.81%，97.28%-99.82%，respectively，and the relative standard deviation were 0.90%，1.02%，respectively.The VCcontent in black beauty was（21.27±0.19），（19.92±0.13），（23.31±0.11）mg/100 g by HPLC，UV spectrophotometry，Iodometric method，respectively.And（18.28±0.19），（17.68±0.14），（21.76±0.09）mg/100 g in red ruby，respectively.Comparedwith the results from agricultural test center of Gansu academy of agricultural sciences（21.73 mg/100 g in black beauty；18.74 mg/100 g in red ruby），the results of HPLC was preciser than the other two methods.The method can well be applied in the determination of vitamin C content with the features of rapid，sensitive，exact and stable，and applicable to detection of vitamin C in fruits and vegetables，such as strawberry，roxburgh rose and green vegetables.

high performance liquidchromatography；Solanum tuberosum black beauty；Solanum tuberosum redruby；vitamin C

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.028

2016-10-10

貴州省重大科技專項計劃項目“馬鈴薯主食化加工關(guān)鍵共性技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)”（黔科合重大專項字[2014]6016號）；貴州省科技基礎(chǔ)條件平臺項目“貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室開發(fā)實驗平臺建設(shè)”（黔科平臺[2015]4007）；貴州省農(nóng)科院科技成果培育與人才培養(yǎng)項目“貴州省薯芋類加工研發(fā)建設(shè)”（黔農(nóng)科院院專項[2014]38號）

王輝（1989—），男（漢），助理研究員，碩士，主要從事食品加工方面的工作。

*通信作者：劉永翔（1978—），女，研究員，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。