QuEChERS-HPLC-MS/MS快速測定染色黃魚中3種堿性橙類染料

孫稚菁，王靈芝，任國杰，張國翠，盧熠川

（大連市產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究院，遼寧大連116630）

QuEChERS-HPLC-MS/MS快速測定染色黃魚中3種堿性橙類染料

孫稚菁，王靈芝，任國杰*，張國翠，盧熠川

（大連市產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究院，遼寧大連116630）

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立快速檢測染色黃魚中堿性橙Ⅱ，堿性橙21和堿性橙22的分析方法。將待測樣品經(jīng)QuEChERS法進(jìn)行預(yù)處理，選用乙腈溶液超聲提取，經(jīng)氯化鈉和C18粉末凈化，以10 mmol/L的醋酸銨溶液（含有0.1%甲酸）-乙腈（含有0.1%甲酸）作為流動相，經(jīng)Agilent poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱分離，采用多反應(yīng)檢測模式（MRM）檢測。用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量。在優(yōu)化條件下，目標(biāo)物的線性范圍為1 μg/L～100 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。該3種堿性橙類染料的定量下限為5 μg/kg。在3個濃度水平下，各目標(biāo)物的回收率均大于85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于5%。方法準(zhǔn)確、快速、簡便、靈敏、可靠?？捎糜谌旧S魚中此3種堿性橙類染料的快速測定。

QuEChERS；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；堿性橙；黃花魚

堿性橙Ⅱ（Basic OrangeⅡ）是一種偶氮類堿性工業(yè)染料，俗名“王金黃”、“塊黃”等，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色[1]。由于在中性或偏堿性條件下，堿性橙Ⅱ與蛋白質(zhì)吸附較牢固，比其他水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在豆類制品以及鮮海魚上染色且不易褪色，因此一些不法商販用堿性橙Ⅱ?qū)Χ垢ぁⅫS魚進(jìn)行染色，以次充好，以假冒真，欺騙消費(fèi)者。另外堿性橙21和堿性橙22也是常見的堿性橙類工業(yè)染料。由于這些工業(yè)染料具有致癌、致畸變性，會對人體造成嚴(yán)重的危害，因此在衛(wèi)生部和農(nóng)業(yè)部等公布的《151種食品和飼料中非法添加物質(zhì)名單》中禁止堿性橙染料在食品中使用。

通過文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)檢索發(fā)現(xiàn)，這3種堿性橙染料的檢測方法主要為高效液相色譜法[2-6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-14]，另外還有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)譜法[15]和薄層色譜法[16]等方法。通過文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，這些方法多數(shù)前處理比較復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力，多為關(guān)于堿性橙Ⅱ的檢測，且多側(cè)重于豆制品中堿性橙類染料的檢測，關(guān)于堿性橙21和堿性橙22的檢測方法較少。本文針對頻發(fā)的染色黃魚現(xiàn)象，通過試驗(yàn)開發(fā)了一種基于QuEChERS快速前處理方法基礎(chǔ)上的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法操作簡單、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，回收率和重現(xiàn)性良好，保證了消費(fèi)者的安全，提高了市場監(jiān)督的效率，為食品安全監(jiān)管部門提供技術(shù)參考和支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22（純度均大于98%）：德國CNW公司；醋酸銨（色譜純）：美國Alfa Aesar公司；乙腈和甲醇（色譜純）：德國Merck公司。

Agilent 6490高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（ESI源）：安捷倫；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；3-18KS離心機(jī)：Sigma公司；IKA T18均質(zhì)器：Basic公司；XW-80A漩渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

稱取堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22各10 mg（精確至0.1 mg），分別置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，冷卻后用甲醇定容至刻線，配制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取3種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇逐級稀釋配制100、80、50、25、10、1 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.3 試樣制備

稱取粉碎好的魚糜樣品5.0g，加入乙腈25 mL，均質(zhì)，超聲10min，加入NaCl 2 g，渦旋混勻，經(jīng)5 000 r/min離心處理3 min，取上清液2 mL加入C18粉末0.1 g，渦旋1 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，待測。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相分離條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）。流動相：A 10 mmol/L的醋酸銨溶液（含有0.1%甲酸）；B乙腈（含有0.1%甲酸）。梯度洗脫條件：0～3 min，40%～95%B；3 min～4 min，95%～40% B；4 min～6 min，40%B。柱溫：35℃。流速：0.2 mL/min。進(jìn)樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧電離源（ESI源）；離子源溫度：300℃；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣：氮?dú)猓?0 psi；干燥氣：氮?dú)猓魉伲?4 L/min；鞘氣溫度：350℃，流速：11 L/min；碰撞氣：氮?dú)?；毛?xì)管電壓：3 500 V；碰撞電壓：380 V；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5 定性分析與定量測定

1.5.1 定性分析

分別將試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.4儀器分析條件”進(jìn)行檢測，比較在相同條件下獲得的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分離譜圖。以目標(biāo)化合物色譜峰的保留時間與目標(biāo)化合物兩個離子的豐度比進(jìn)行定性分析。

1.5.2 定量測定

移取“1.2.2”系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”色譜條件進(jìn)行儀器分析，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈對于堿性橙類著色劑具有良好的提取效果，但在已經(jīng)提取溶液中會含有大量的水及其水帶入的大極性雜質(zhì)，氯化鈉的加入可以有效地分離出水分和大極性雜質(zhì)，由于魚類產(chǎn)品含有一定的脂類物質(zhì)，經(jīng)乙腈提取后這些脂類的存在會影響目標(biāo)物的測定，降低色譜柱的壽命，C18粉末的加入很好地能吸附這些小極性的雜質(zhì)。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)乙腈提取后，經(jīng)過氯化鈉和C18粉末的純化后，可以在保證目標(biāo)物提取效率的前提條件下獲得較為純凈的提取溶液。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)通過考察3種目標(biāo)成分在C18色譜柱上的分離效果，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在普通C18色譜柱上峰型嚴(yán)重拖尾，為了保證目標(biāo)物的正模式響應(yīng)，流動相中酸的存在又加劇了目標(biāo)物的拖尾現(xiàn)象。鑒于這3種化合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，推測造成拖尾的原因可能是目標(biāo)物與固定相上殘余硅羥基之間的相互作用所致。嘗試選擇Aiglent poroshell 120 EC-C18色譜柱用于改善3種目標(biāo)化合物的色譜分離。研究顯示，在優(yōu)化的色譜條件下，可以獲得良好的色譜分離效果，試驗(yàn)最終選擇Aiglent poroshell 120 EC-C18作為色譜柱進(jìn)行分離。

2.2.2 流動相中洗脫溶劑及改性劑的優(yōu)化

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中的流動相通常為乙腈或甲醇和水，為了保證化合物的離子響應(yīng)通常會加入甲酸、乙酸、乙酸銨等不同的改性劑，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，乙腈-水系統(tǒng)可以獲得良好的分離效果，加入甲酸的溶劑系統(tǒng)能明顯提高離子響應(yīng)，在酸性條件下醋酸銨的加入可以改善離子響應(yīng)強(qiáng)度，并能保持良好的峰型，經(jīng)過多次試驗(yàn)驗(yàn)證，以10 mmol/L的醋酸銨溶液（含有0.1%甲酸）和乙腈（含有0.1%甲酸）作為流動相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫可以獲得良好的分離圖譜。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將3種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)譜上進(jìn)行全掃描，在ESI（+）模式下得到3種目標(biāo)化合物的分子離子峰。通過優(yōu)化碰撞能等參數(shù)，得到3種化合物的子離子，每種物質(zhì)選擇2個子離子，將響應(yīng)值高的離子作為定量離子，另一個作為定性離子。3種著色劑的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

在該優(yōu)化儀器條件下，3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的多反應(yīng)檢測譜圖如圖1所示（各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為5 μg/L）。

圖1 3種著色劑的多反應(yīng)檢測譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 3 colorants

2.4 線性范圍與相關(guān)系數(shù)

移取濃度分別為100、80、50、25、10、1 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化色譜條件下進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明：各目標(biāo)物在1 μg/L～100 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。各目標(biāo)物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表2所示。

表2 3種著色劑的線性方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限與定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients（r），LODs and LOQs of 3 colorants

2.5 回收率與定量下限

向不含目標(biāo)物質(zhì)的空白樣品基質(zhì)中定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，計(jì)算信噪比（S/N）。以S/ N＞3為檢出限，以S/N＞10為定量下限，具體試驗(yàn)結(jié)果見表3。對3種目標(biāo)物分別在5、50、500 μg/kg 3個濃度水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個水平測定6個樣品，其回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

由表3可知，各目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為89.45%～99.49%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于5%。方法顯示了良好的回收率與精密度。

表3 3種著色劑的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The average recoveries and RSDs of 3 colorants

2.6 實(shí)際樣品測試

應(yīng)用本法對72個市售黃花魚樣品進(jìn)行測定。通過對測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，共有1個檢出堿性橙Ⅱ，通過對陽性樣品的分離圖譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，分析圖譜中所存在的干擾很少，該方法適用于實(shí)際樣品的分析測定。

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了染色黃魚中3種堿性橙類著色劑的快速替換方法?？瞻讟悠芳訕?biāo)試驗(yàn)及實(shí)際樣品測定結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏、可靠，可用于染色黃魚中3種堿性橙類著色劑的快速替換和測定，能夠?yàn)檎ㄒ?guī)的執(zhí)行和市場的質(zhì)量監(jiān)管提供有效的技術(shù)支持和保障。

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Determination of 3 Basic Orange in Dyed Yellow Croaker by QuEChERS-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Zhi-jing，WANG Ling-zhi，REN Guo-jie*，ZHANG Guo-cui，LU Yi-chuan
（Dalian Institute of Product Quality Supervision&Inspection，Dalian 116630，Liaoning，China）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the rapid determination of 3 basic orange in dyed yellow croaker.To pass through the QuEChERS method under test sample preprocessing，ultrasonic extraction with acetonitrile solution，purification by sodium chloride and C18powder，the extract was separated on an Agilent poroshell 120 EC-C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）using a gradient elution program with mobile phase of 10 mmol/L ammonium acetate（containing 0.1%formic acid）-acetonitrile（containing 0.1%formic acid），with multiple reactions monitoring（MRM）mode for testing.Using external standard method for the quantitative standard curve.The linear ranges of 3 analytes were in the range of 1 μg/L-100 μg/L，with correlation coefficients more than 0.999.The limits of quantiation（LOQs）were 5 μg/kg.The average recoveries at three spiked levels were greater than 85%，with RSDs less than 10%.This method is accurate，simple，sensitive and reliable，and can be used for analysis of 3 basic orange in dyed yellow croaker.

QuEChERS；high performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry；basic orange；croaker

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.031

2017-03-06

孫稚菁（1972—），女（漢），高級工程師，本科，研究方向：食品和化工產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測。

*通信作者：任國杰（1987—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品、藥品以及化妝品檢測方法的研究與開發(fā)。