噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑的研究

周亞男，王英琪，劉紅，劉偉，全志剛，王欣卉，寇芳，李志江，楊宏志

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑的研究

周亞男，王英琪，劉紅，劉偉，全志剛，王欣卉，寇芳，李志江*，楊宏志*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

利用噴霧干燥法可批量制備產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化用量的魯氏酵母，顯著縮短發(fā)酵周期，增加收益。本研究利用YDP培養(yǎng)基及20 L微生物發(fā)酵罐制備魯氏酵母菌懸液，通過(guò)研究不同生長(zhǎng)時(shí)間魯氏酵母及培養(yǎng)基殘?zhí)呛?、?xì)胞干重的變化確定最佳噴霧干燥時(shí)間。采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)保護(hù)劑及噴霧干燥條件進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明：在發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)間27 h時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大18 g/L，此時(shí)為最佳噴霧干燥時(shí)間。保護(hù)劑最佳配比為脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%。確定最佳噴霧干燥條件為進(jìn)口溫度115℃，進(jìn)料流量15%（蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速占比），保護(hù)劑與菌泥比例1∶1（g/L），按照上述條件得到發(fā)酵劑的存活率達(dá)到83%以上。

魯氏酵母；保護(hù)劑優(yōu)化；噴霧干燥工藝

魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是傳統(tǒng)豆醬中增香的微生物。作為最常見(jiàn)的嗜高滲透壓酵母菌，在豆醬的后期發(fā)酵過(guò)程中，協(xié)同球擬酵母（Torulopsis）、假絲酵母（Candida）、對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生起到重要作用[1]。豆醬的釀造過(guò)程中離不開(kāi)酵母菌的作用，自然條件下發(fā)酵的酵母菌含量有限，而且豆醬發(fā)酵周期長(zhǎng)，魯氏酵母發(fā)酵劑如果能夠大量的應(yīng)用到豆醬后熟發(fā)酵階段中，可縮短周期、增加風(fēng)味物質(zhì)、提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

目前發(fā)酵劑的生產(chǎn)主要采用真空冷凍干燥和噴霧干燥[2]。相關(guān)研究表明，真空冷凍干燥凍干的菌粉雖活力高，但產(chǎn)量較小，成本較高，不適合批量生產(chǎn)，而且產(chǎn)品呈塊狀不利于發(fā)酵使用。噴霧干燥是一種生產(chǎn)效率高，操作費(fèi)用低的常用干燥技術(shù)，其應(yīng)用廣泛，產(chǎn)業(yè)化程度高，有廣闊發(fā)展前景[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，用噴霧干燥技術(shù)制備益生菌、乳酸雙歧桿菌、醋酸菌發(fā)酵劑，最終獲得發(fā)酵劑存活率均可達(dá)到83%以上[6-8]。在噴霧干燥過(guò)程中進(jìn)口溫度過(guò)高，使發(fā)酵劑內(nèi)細(xì)胞脫水導(dǎo)致熱滅活，為使魯氏酵母生存的最大化，合理的優(yōu)化噴霧干燥工藝是提高發(fā)酵劑存活率的關(guān)鍵。因此研究以制作傳統(tǒng)豆醬應(yīng)用的魯氏酵母為發(fā)酵劑，研究保護(hù)劑優(yōu)化及噴霧干燥法制備魯氏酵母的工藝，為工業(yè)化制備魯氏酵母發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；YPD液體培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂：Xiya Reagent生物技術(shù)有限公司；海藻糖（食品級(jí)）：山東天力藥業(yè)有限公司；谷氨酸鈉（食品級(jí)）：Biosharp生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉（食品級(jí)）：伊利乳業(yè)有限公司；氯化鈉（分析純）、葡萄糖（分析純）、DNS（3，5-二硝基水楊酸試劑）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

20 L微生物發(fā)酵罐：上海洋格生物工程設(shè)備有限公司；754紫外、可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜有限公司；生物顯微鏡：重慶光學(xué)儀器廠；全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；YM-6000Y小型噴霧干燥機(jī)：上海豫明儀器有限公司；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；R2140型分析天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Centrifuge 5403 R低溫離心機(jī)：Eppendorf生命科技有限公司；FA25model均質(zhì)機(jī)：上海佛魯克流體機(jī)械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魯氏酵母發(fā)酵液的制備

活化微量魯氏酵母凍干粉，經(jīng)28℃，180 r/min，全溫振蕩器中培養(yǎng)3 d～4 d，細(xì)胞總數(shù)達(dá)108CFU/mL時(shí)作為種子備用。取5%已活化好的種子加入裝有100 mL培養(yǎng)液的三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)30 h～36 h。取三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的魯氏酵母為微生物發(fā)酵罐批量制備的菌種，發(fā)酵罐培養(yǎng)條件（經(jīng)實(shí)驗(yàn)室搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化所得）為溫度28℃、500 r/min、pH 5、DO值設(shè)定30%，接種量5%，接種后發(fā)酵罐內(nèi)液體總體積為10 L，連續(xù)培養(yǎng)30 h。每3 h取樣測(cè)定細(xì)胞干重、培養(yǎng)基殘?zhí)菨舛取⒒罹倲?shù)監(jiān)測(cè)魯氏酵母的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 菌體洗滌

將魯氏酵母從菌體發(fā)酵液中分離，采用4500r/min，低溫4℃離心20 min。用2.5%的氯化鈉溶液對(duì)分離的菌體洗滌，同時(shí)在4 500 r/min，低溫4℃離心20 min條件下，去除上清液，保留菌體。

1.3.3 酵母菌菌落總數(shù)、培養(yǎng)基殘?zhí)呛考凹?xì)胞干重測(cè)定方法

菌落總數(shù)測(cè)定：GB 4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》；培養(yǎng)基殘?zhí)呛繙y(cè)定：3，5-二硝基水楊酸比色法[9]；細(xì)胞干重測(cè)定：取5 mL菌體發(fā)酵液于離心管中（離心管提前干燥并稱重），8 000 r/min離心10 min，收集菌體將收集到的菌體用去離子水洗滌兩次離心，放入干燥箱中于80℃干燥恒重，稱重并計(jì)算細(xì)胞干重[10]。

1.3.4 酵母菌存活率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]的方法計(jì)算酵母菌存活率，如公式（1）：

1.3.5 保護(hù)劑優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.5.1 保護(hù)劑的單因素試驗(yàn)

利用噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑時(shí)，對(duì)保護(hù)劑的選擇要符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，即能入口使用、又對(duì)身體無(wú)害。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑可以減輕和防止噴霧干燥對(duì)菌體的損害，盡可能保持菌體原有特性，提高存活率[12]。分別選擇6%、8%、10%、12%、14%的脫脂奶粉作為賦形劑。1%、3%、5%、7%、9%的海藻糖作為內(nèi)源保護(hù)劑，1%、1.5%、2%、2.5%、3%的谷氨酸鈉作為抗氧化保護(hù)劑（表1）。分別添加到經(jīng)處理的發(fā)酵液中，以魯氏酵母菌的存活率為檢驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

表1 不同保護(hù)劑添加量Table 1 Different amount of protective agent added

1.3.5.2 保護(hù)劑的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)對(duì)噴霧干燥的保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化。噴霧干燥的進(jìn)料溫度115℃，進(jìn)料流量15%（蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速占比），以魯氏酵母菌的存活率為檢驗(yàn)指標(biāo)，分別選取海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)。表2為噴霧干燥保護(hù)劑優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表。

1.3.5.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，比較各試驗(yàn)組存活率，分析判斷試驗(yàn)的可重復(fù)性。

表2 噴霧干燥保護(hù)劑優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for protective agent formula optimization

1.3.6 噴霧干燥條件單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 噴霧干燥進(jìn)口溫度試驗(yàn)

采用進(jìn)料流量13%（蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速占比）、保護(hù)劑與菌泥比例為4∶1（g/L）、進(jìn)料溫度分別選擇110、115、120、125、130℃進(jìn)行試驗(yàn)，以酵母菌活率為檢驗(yàn)指標(biāo)。

1.3.6.2 噴霧干燥保護(hù)劑與菌泥比例試驗(yàn)

采用進(jìn)料流量13%（蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速占比）、進(jìn)料溫度120℃，保護(hù)劑與菌泥比例分別選擇1∶3、1∶1、4∶1、8∶1、12∶1（g/L）進(jìn)行試驗(yàn)，以酵母菌存活率為檢驗(yàn)指標(biāo)。

1.3.6.3 噴霧干燥進(jìn)料流量試驗(yàn)

采用進(jìn)料溫度120℃、保護(hù)劑與菌泥比例為4∶1（g/L），進(jìn)料流量分別選擇12%、13%、14%、15%、16%進(jìn)行試驗(yàn)，以酵母菌存活率為檢驗(yàn)指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 魯氏酵母培養(yǎng)基殘?zhí)呛?、?xì)胞干重測(cè)定

采用20 L微生物發(fā)酵罐制備魯氏酵母發(fā)酵液，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室條件優(yōu)化，確定最佳的培養(yǎng)條件。魯氏酵母的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，發(fā)酵周期30 h。

圖1 魯氏酵母發(fā)酵罐生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Zygosaccharomyces rouxii on fermented

由圖1可知，在發(fā)酵初期3 h～9 h，菌體生長(zhǎng)緩慢，在發(fā)酵18 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌體數(shù)量快速增長(zhǎng)，細(xì)胞干重在27 h時(shí)達(dá)到最大18 g/L，活菌總數(shù)可達(dá)到3.11× 108CFU/mL，此時(shí)培養(yǎng)基殘?zhí)呛繛?.991 g/L。發(fā)酵30 h時(shí)，由于培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幾乎耗盡，酵母菌活力下降，及自身降解，細(xì)胞干重下降。故后續(xù)試驗(yàn)中，為保證存活率，選擇培養(yǎng)27 h時(shí)的發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥試驗(yàn)。

2.2 保護(hù)劑優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

本研究以魯氏酵母菌的存活率為檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。3種不同保護(hù)劑對(duì)酵母存活率的影響如圖2所示。

圖2 脫脂奶粉、海藻糖、谷氨酸鈉分別對(duì)魯氏酵母菌存活率的影響Fig.2 The effects of skim milk powder，trehalose and sodium glutamate on the survival rate of Zygosaccharomyces rouxii

隨保護(hù)劑含量的增加，酵母菌存活率均呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)脫脂奶粉、海藻糖、谷氨酸鈉依次添加量為10%、5%、2%時(shí)酵母菌對(duì)應(yīng)存活率最高，依次為63%、58%、45%。脫脂奶粉中的蛋白質(zhì)能夠提供保護(hù)性外模[13]，能為干粉提供較輕的多孔無(wú)定型結(jié)構(gòu)且復(fù)水性強(qiáng)[14]，Carlise[15]等研究表明，脫脂奶粉作為包裹劑在噴霧干燥過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的存活率有較好的效果。由圖中可以看出海藻糖對(duì)應(yīng)的存活率略低于脫脂奶粉。海藻糖作為糖類(lèi)保護(hù)劑二糖代表，許多酵母細(xì)胞中存在海藻糖并持有特殊的海藻糖載體[16]，并通過(guò)水取代作用和玻璃態(tài)機(jī)制維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性并降低細(xì)胞膜磷脂分子的相轉(zhuǎn)變溫度，從而使細(xì)胞膜在高溫脫水的過(guò)程中不發(fā)生相轉(zhuǎn)變而處于流動(dòng)態(tài)[17]，是較好的內(nèi)源性保護(hù)劑。同時(shí)，谷氨酸鈉能與水密切作用使干粉保留了適當(dāng)?shù)乃?，滿足了微生物維持生命的最低需求[18]，可作為抗氧化劑保護(hù)酵母菌在高溫和貯藏過(guò)程中不被氧化[19-20]。從圖中能夠看出，單一的保護(hù)劑對(duì)酵母菌的存活率不能達(dá)到理想效果，而復(fù)合保護(hù)劑的使用，是目前研究的大方向。

2.3 保護(hù)劑優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3。

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果所示：通過(guò)直觀分析法可得，在試驗(yàn)選定的因素水平中RA＞RB＞RC，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響水平由大到小的排列順序?yàn)锳＞B＞C，最佳組合方式為A2B2C1，脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果分析

以進(jìn)料溫度115℃、進(jìn)料流量13%（蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速占比）、保護(hù)劑組合（脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%）為條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果魯氏酵母存活率為78%，高于正交試驗(yàn)中的9個(gè)試驗(yàn)組。

2.5 噴霧干燥單因素試驗(yàn)條件結(jié)果與分析

2.5.1 不同進(jìn)料溫度對(duì)魯氏酵母存活率的影響

不同的進(jìn)料溫度對(duì)存活率的影響如圖3所示。

圖3 進(jìn)料溫度對(duì)發(fā)酵劑的影響Fig.3 Influence of inlet temperature on starter

由圖3可知，進(jìn)料溫度為115℃時(shí)魯氏酵母的存活率達(dá)到最高，為83%，發(fā)酵劑呈乳白色、粉粒狀，具有一定醬香味產(chǎn)生。當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到120℃時(shí)，存活率為34%呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，此時(shí)噴霧干燥機(jī)出料口處出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象，制得的發(fā)酵劑顏色偏黃，有焦糊氣味產(chǎn)生。故選擇進(jìn)口溫度為115℃進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5.2 不同進(jìn)料流量對(duì)發(fā)酵劑存活率的影響

選擇5個(gè)不同的流量進(jìn)樣，對(duì)發(fā)酵劑中酵母菌的存活率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 進(jìn)料流量對(duì)發(fā)酵劑的影響Fig.4 Influence of injective flow on starter

由圖4可知，當(dāng)進(jìn)料流量為15%時(shí)，存活率達(dá)到最高85%。此后隨著進(jìn)料流量的增大，經(jīng)霧化后的液滴數(shù)量大量增加，不能瞬間進(jìn)行干燥，導(dǎo)致發(fā)酵劑內(nèi)的活菌數(shù)降低，故選擇進(jìn)料流量為15%。

2.5.3 保護(hù)劑與菌泥對(duì)魯氏酵母存活率的影響

通過(guò)對(duì)噴霧干燥保護(hù)劑的優(yōu)化，采用脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%復(fù)合保護(hù)劑進(jìn)行試驗(yàn)。將保護(hù)劑與離心的菌泥分別按照1∶3、1∶1、4∶1、8∶1、12∶1（g/L）比例混合，進(jìn)行噴霧干燥，測(cè)得樣品存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 保護(hù)劑與菌泥比例對(duì)發(fā)酵劑的影響Fig.5 Influence of proportion of protectants cells

由圖5可知，當(dāng)保護(hù)劑與菌泥比例1∶1（g/L）時(shí)，樣品存活率最高，達(dá)到84%。當(dāng)保護(hù)劑與菌泥1∶3（g/L）時(shí)含量過(guò)低，不能達(dá)到保護(hù)效果，導(dǎo)致酵母菌在干燥過(guò)程中死亡，影響干燥結(jié)果。當(dāng)保護(hù)劑與菌泥12∶1（g/L）時(shí)含量過(guò)高，粉狀顆粒中的菌體比例變小，存活率呈現(xiàn)平緩下降趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本文探究了利用噴霧干燥法制備魯氏酵母發(fā)酵劑的最佳條件，魯氏酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)最佳時(shí)間為27 h，此時(shí)細(xì)胞活力最強(qiáng)、活菌總數(shù)達(dá)到最大3.11×108CFU/g、細(xì)胞干重達(dá)到最大18 g/L。保護(hù)劑優(yōu)化采用三因素三水平的正交試驗(yàn)，3種添加物的保護(hù)效果依次為：脫脂奶粉＞海藻糖＞谷氨酸鈉，最佳配方為：脫脂奶粉10%、海藻糖5%、谷氨酸鈉1.5%，按照上述條件得到的發(fā)酵劑中活菌存活率為72%。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了噴霧干燥試驗(yàn)最適條件：進(jìn)口溫度115℃，進(jìn)料流量15%（蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速占比），保護(hù)劑與菌泥比例1∶1（g/L）。通過(guò)上述條件得到的發(fā)酵劑中活菌存活率為84%。

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Study on Preparation of Zygosaccharomyces rouxii Fermentation Agent by Spray Drying

ZHOU Ya-nan，WANG Ying-qi，LIU Hong，LIU Wei，QUAN Zhi-gang，WANG Xin-hui，KOU Fang，LI Zhi-jiang*，YANG Hong-zhi*
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

The use of spray drying method can be batch preparation of industrial，large-scale amount of Zygosaccharomyces rouxii，significantly shorten the fermentation cycle，increase revenue.The study was preparation of the suspension of Zygosaccharomyces rouxii on YDP and microbial fermentor.By studying the growth curve of Zygosaccharomyces rouxii yeast at different growth times and residual sugar content and cell dry weight and total number of viable bacteria.The single factor and orthogonal experiments were used to optimize the protective agent and spray drying conditions.Research indicates，culture time 27 h in microbial fermentor，cell dry weight was 18 g/L.The best proportion of protective agent were 10 percent of skim milk powder and five percent of trehalose and 1.5%of sodium glutamate.Determine the best spray drying conditions were 115℃of inlet temperature and 15%of feed flow and 1∶1（g/L）ratio of preservative to bacteria，The survival rate of the starter was 83%or more according to the above conditions.

Zygosaccharomyces rouxii；protection agent optimization；spray drying process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.025

2017-03-19

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2017-Y53）作者簡(jiǎn)介：周亞男（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：李志江（1977—），男，副教授，博士，研究方向：食品發(fā)酵與釀造；楊宏志（1963—），男，教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。