結(jié)合型蝦青素酶法水解工藝的研究

孫兆遠(yuǎn)，侯會(huì)絨，孔令偉

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江蘇淮安223003）

結(jié)合型蝦青素酶法水解工藝的研究

孫兆遠(yuǎn)1，侯會(huì)絨1，孔令偉2

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江蘇淮安223003）

利用木瓜蛋白酶將克氏原螯蝦蝦殼中的結(jié)合型蝦青素水解，獲取游離蝦青素。以蝦青素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了蛋白酶添加量、酶解溫度、溶液pH值及酶解時(shí)間等因素對(duì)水解效果的影響。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了酶解工藝的最佳條件為：木瓜蛋白酶添加量10%、酶解溫度45℃、溶液pH值5.5、酶解時(shí)間5 h，在此條件下，蝦青素的提取量為97.26μg/g；各因素對(duì)蝦青素提取量的影響依次為溶液pH值>酶解溫度>酶解時(shí)間>木瓜蛋白酶添加量。

克氏原螯蝦；結(jié)合型蝦青素；木瓜蛋白酶

蝦青素分子中的碳骨架由中央多聚烯鏈和兩側(cè)的芳香環(huán)組成，每個(gè)芳香環(huán)上各有一個(gè)羥基及一個(gè)酮基[1]，中央多聚烯鏈和不飽和α羥基酮具有比較活潑的電子效應(yīng)，能吸引自由基或向自由基提供電子[2]，因此具有很強(qiáng)的抗氧化能力，可以廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、飼料等領(lǐng)域[3]。蝦青素為非極性物質(zhì)，游離的蝦青素可利用非極性低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑將其提取，然后通過(guò)蒸發(fā)回收溶劑進(jìn)行分離，該法提取率高、選擇性好、溶劑殘留少，是較為理想的提取方法[4-5]。但蝦殼中大多數(shù)蝦青素與蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵形成結(jié)合型復(fù)合物，無(wú)法用有機(jī)溶劑萃取出來(lái)，因此所得提取率較低[6]。酶解法是利用蛋白酶將蛋白質(zhì)與蝦青素結(jié)合的共價(jià)鍵水解，將結(jié)合型蝦青素分解為游離蝦青素，然后利用有機(jī)溶劑萃取出來(lái)。該法得到的蝦青素不但包含游離蝦青素，還包含結(jié)合型蝦青素的水解產(chǎn)物，因此提取率較高。另外，酶解法還具有反應(yīng)條件溫和、化學(xué)試劑用量少、對(duì)蝦青素的破壞小、成品安全無(wú)毒、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因此發(fā)展前景較高[7-8]。目前研究最多的是利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，因?yàn)樵撁妇哂兄贿x擇性降解GlcNAc-GleN-糖苷鍵的優(yōu)勢(shì)，有利于蝦青素的提取[9]。

本文以克氏原螯蝦蝦殼為原料，木瓜蛋白酶為催化劑，蝦青素提取量為指標(biāo)，探討蛋白酶添加量、酶解溫度、溶液pH值及酶解時(shí)間等因素對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果和蝦青素提取量的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在獲得最佳水解工藝，為蝦青素的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

克氏原螯蝦：盱眙龍盛龍蝦養(yǎng)殖場(chǎng)；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；木瓜蛋白酶（酶活力2.0×106U/mg）：諾維信；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

WF180萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海光學(xué)儀器有限公司；TU-1900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TDL-40C低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DX-II恒溫磁力攪拌器：常州諾基儀器有限公司；SHZD循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SPH-211F恒溫振蕩器：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-601恒溫水浴鍋：上海新嘉電子有限公司；JA1003A電子精密天平：上海倫捷機(jī)電儀表有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

新鮮螯蝦沸水煮制2 min后自然冷卻，剝除蝦仁和內(nèi)臟，流水洗凈蝦頭、尾及殼，避光、密封于-20℃?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)前用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩備用。

2.2 酶解工藝

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量粉碎后的蝦殼樣品，按比例加入一定pH值的緩沖溶液和木瓜蛋白酶（酶活力2.0× 106U/mg），混合均勻，恒溫振蕩酶解，酶解結(jié)束后用冰水浴冷卻，離心分離取濾渣，反復(fù)水洗去除礦物質(zhì)，碾碎后加入丙酮過(guò)夜，過(guò)濾后留上清液，丙酮定容至50 mL[7，10]。

2.3 蝦青素提取量的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 1.0 mg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，丙酮定容至50 mL，混合均勻后在478 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of astaxanthin

由圖1可知蝦青素在0～50 μg/mL范圍內(nèi)線性回歸方程y=0.008 6x-0.006 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 3，結(jié)果符合朗伯比爾定律，方程可用于蝦青素提取量的測(cè)定。

2.3.2 樣品測(cè)定

吸取1.0 mL丙酮溶解液置于50 mL比色管中，按照2.3.1測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蝦殼提取液中蝦青素含量。

2.4 酶解條件的研究

2.4.1 木瓜蛋白酶添加量對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0 g，加入pH值為5.0的緩沖溶液100 mL，再分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g木瓜蛋白酶（加酶量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%），置于40℃的恒溫振蕩器中酶解4 h，酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行過(guò)濾和定容，并根據(jù)2.3在478 nm條件下進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定，以蝦青素提取量為指標(biāo)考察木瓜蛋白酶添加量對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響。

2.4.2 酶解溫度對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0 g，加入pH值為5.0的緩沖溶液100 mL和0.5 g木瓜蛋白酶，分別置于25、30、35、40、45、50、55℃的恒溫振蕩器中酶解4 h，酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行過(guò)濾和定容，并根據(jù)2.3在478 nm條件下進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定，以蝦青素提取量為指標(biāo)考察酶解溫度對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響。

2.4.3 溶液pH值對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0 g，依次加入pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的緩沖溶液100 mL和0.5 g木瓜蛋白酶，置于45℃的恒溫振蕩器中酶解4 h，酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行過(guò)濾和定容，并根據(jù)2.3在478 nm條件下進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定，以蝦青素提取量為指標(biāo)考察溶液pH值對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響。

2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

準(zhǔn)確稱取7份粉碎后的蝦殼樣品各5.0 g，加入pH值為5.0的緩沖溶液100 mL和0.5 g木瓜蛋白酶，置于45℃的恒溫振蕩器中分別酶解1、2、3、4、5、6、7 h，酶解結(jié)束后根據(jù)2.2進(jìn)行過(guò)濾和定容，并根據(jù)2.3在478 nm條件下進(jìn)行蝦青素提取量測(cè)定，以蝦青素提取量為指標(biāo)考察酶解時(shí)間對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響。

2.4.5 最佳酶解條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以木瓜蛋白酶添加量、酶解溫度、溶液pH值和酶解時(shí)間為因素，采用L9（43）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蝦青素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定酶解最佳工藝條件。因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

3 結(jié)果與分析

3.1 木瓜蛋白酶添加量對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

木瓜蛋白酶添加量對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 木瓜蛋白酶添加量對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響Fig.2 Effect of papain amount on extraction yield of free astaxanthin

由圖2可知，在木瓜蛋白添加量為2%時(shí)，蝦青素提取量非常低（44.34 μg/g），但隨木瓜蛋白酶添加量不斷增加，蝦青素提取量快速增加。這主要是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜锍渥愣覆蛔銜r(shí)，酶與底物結(jié)合后迅速分解為目標(biāo)產(chǎn)物，此時(shí)水解速度取決于酶的數(shù)量多少，酶越多，反應(yīng)速度越快。當(dāng)酶添加量為10%時(shí)，蝦青素提取量基本達(dá)到最大值；當(dāng)酶添加量大于10%以后，蝦青素提取量增加緩慢，這主要是因?yàn)楫?dāng)酶添加量增加到一定程度，所有底物都與酶相互結(jié)合，再增加多余酶，無(wú)底物結(jié)合，因此也不會(huì)產(chǎn)生水解速度的增加。由試驗(yàn)可知，酶的添加量過(guò)少酶解時(shí)間延長(zhǎng)，添加量過(guò)多則造成酶的浪費(fèi)，考慮到酶制劑的經(jīng)濟(jì)成本，選擇木瓜蛋白酶添加量在10%左右。

3.2 酶解溫度對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

酶解溫度對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在常溫條件下（25℃），蝦青素提取量很低（41.36 μg/g），這說(shuō)明低溫條件不利于蛋白酶水解糖苷鍵。隨著溫度的不斷提升，蝦青素提取量快速增加，并在溫度為45℃時(shí)達(dá)到最大值（82.74 μg/g）。這主要是因?yàn)闇囟鹊脑黾邮沟玫鞍酌负偷孜锓肿舆\(yùn)動(dòng)加速，分子碰撞概率增大。同時(shí)溫度增高會(huì)逐漸接近酶的最適溫度，酶分子和底物構(gòu)象最適合酶促反應(yīng)，因此速度快速增加[11]。但溫度大于50℃后，蝦青素提取量快速下降，特別是當(dāng)溫度為55℃時(shí)蝦青素提取量?jī)H為50.48 μg/g，這主要是因?yàn)檫^(guò)高的溫度使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆或不可逆的改變甚至變性，導(dǎo)致蝦青素提取量快速下降[9]。

圖3 酶解溫度對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolytic temperature on extraction yield of free astaxanthin

3.3 溶液pH值對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

溶液pH值對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 溶液pH值對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響Fig.4 Effect of hydrolytic pH on extraction yield of free astaxanthin

由圖4可知，隨著緩沖溶液pH值的增加，蝦青素提取量先增加后降低，當(dāng)pH值接近5.0時(shí)為蝦青素提取量最大，這主要是因?yàn)槟竟系鞍酌笧槿跛嵝悦割悾钸mpH值為5.0左右，pH值小于4.5或大于5.5時(shí)，酶蛋白分子活性中心功能基團(tuán)的帶電狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，酶活性降低。

3.4 酶解時(shí)間對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，當(dāng)酶解時(shí)間為1 h時(shí)，蝦青素提取量很低（32.51 μg/g），因?yàn)檫@部分蝦青素主要由蝦殼本身含有的游離蝦青素和結(jié)合型蝦青素水解產(chǎn)物組成，由于游離蝦青素和短時(shí)間內(nèi)的水解產(chǎn)物均較低，因此所得提取量較低[12]；隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素提取量先快速增加，并在5 h時(shí)達(dá)到最大值，這主要是因?yàn)槟竟系鞍酌笧楦咝У鞍踪|(zhì)水解酶，5 h內(nèi)足以將全部結(jié)合型蝦青素水解為游離狀態(tài)；當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，蝦青素提取量變化緩慢，這主要是因?yàn)? h后底物幾乎被全部水解，蝦青素不再產(chǎn)生；蝦青素緩慢降低的原因可能是因?yàn)橛坞x狀態(tài)的蝦青素易受光、氧、熱等因素的影響而發(fā)生氧化反應(yīng)[13]。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響Fig.5 Effect of hydrolytic time on extraction yield of free astaxanthin

3.5 最佳酶解條件的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，采用excel 2007對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 木瓜，蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of hydrolysis of bound astaxanthin compounds

表3 極差分析表Table 3 Range analysis of orthogonal test results

由表3可知，RC（72.35）＞RB（28.45）＞RD（26.23）＞RA（13.68），這說(shuō)明四因素對(duì)結(jié)果的影響次序?yàn)椋篊＞B＞D＞A，即溶液pH值對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響最大，酶解溫度次之，木瓜蛋白酶添加量的影響最小。由表中各水平對(duì)應(yīng)的K值可以看出，在A因素下的K3，B因素下的K2，C因素下的K3和D因素下的K2分別在各自因素條件下最大，因此確定本試驗(yàn)的最佳組合A3B2C3D2，即最佳酶解條件為：木瓜蛋白酶添加量10%、酶解溫度45℃、溶液pH值5.5、酶解時(shí)間5 h。

3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

因?yàn)锳3B2C3D2的提取條件不在正交試驗(yàn)表中，所以按此條件補(bǔ)做3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verification test of optimal hydrolytic conditions

由表4可知，在設(shè)定的酶解條件下，蝦青素提取量較高（97.26 μg/g）且穩(wěn)定，平均提取量超過(guò)正交試驗(yàn)最大值，具有可行性和實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

以克氏原螯蝦蝦殼為原料，蛋白酶為催化劑水解結(jié)合型蝦青素制備游離蝦青素，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了木瓜蛋白酶制備蝦青素工藝的最佳參數(shù)為：木瓜蛋白酶添加量10%、酶解溫度45℃、溶液pH值5.5、酶解時(shí)間5 h，在此條件下，蝦青素的提取量為97.26 μg/g；各因素對(duì)結(jié)合型蝦青素水解效果的影響依次為溶液pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞木瓜蛋白酶添加量。

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Optimizing Hydrolysis Techniques of Bound Astaxanthin Compounds by Papain

SUN Zhao-yuan1，HOU Hui-rong1，KONG Ling-wei2
（1.Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003，Jiangsu，China；2.Huaian Kuailu Milk Co.，Ltd.，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

The bound astaxanthin compounds in Procambarus clarkia shell was hydrolyzed to free astaxanthin with papain.The effects of four reaction parameters，including amount of papain，temperature，pH and time，on the yield of free astaxanthin were explored by the yield of astaxanthin as index.The optimal hydrolyzed conditions was determined by the single factor test and orthogonal array design as follows：addition amounts of papain 10%，temperature 45℃，pH 5.5，hydrolyzed time 5 h.Under these conditions，the yield of astaxanthin was 97.26 μg/g.In addition，pH had the largest impact on the yield of astaxanthin followed by temperature，hydrolyzed time and addition amounts of papain.

Procambarus clarkia；bound astaxanthin compounds；papain

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.009

2016-09-09

淮安市2013年度科技支撐計(jì)劃（工業(yè)）項(xiàng)目（HAG2013074）

孫兆遠(yuǎn)（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物應(yīng)用與開發(fā)研究。