基于LC—MS/MS技術研究黃芩苷在腦、血微透析探針體內(nèi)外回收率

陳騰飛+劉建勛+張穎+林力+宋文婷+姚明江

[摘要] 為進一步研究黃芩苷的入腦行為及腦細胞間液藥代動力學，對黃芩苷在腦、血微透析探針的體內(nèi)外回收率及其穩(wěn)定性進行了研究。采用LC-MS/MS測定腦、血微透析液中黃芩苷的濃度，計算探針回收率；分別采用增量法、減量法考察不同流速（0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1）對探針體外回收率的影響；采用增量法考察不同濃度（50.00，200.0，500.0，1 000 μg·L^-1）、探針使用次數(shù)（0，1，2）對體外回收率的影響；采用減量法考察在大鼠體內(nèi)探針回收率穩(wěn)定性及流速對回收率的影響，并與體外結果進行比較。在同一濃度下，黃芩苷的腦、血探針體外回收率均隨著流速的增加而降低；在同一流速下，探針回收率與黃芩苷的濃度無關；使用后并經(jīng)過恢復處理的腦、血探針，在使用2次后，探針的回收率沒有明顯的變化；增量法和減量法所測得的體外回收率基本相同；減量法測得的體內(nèi)回收率與體外結果相近，且腦、血探針體內(nèi)回收率在10 h內(nèi)的穩(wěn)定性均良好。研究結果表明減量法能夠作為研究黃芩苷體內(nèi)回收率的測定方法，微透析技術能夠用于黃芩苷在腦細胞間液藥代動力學、血液藥代動力學的同步研究。

[關鍵詞] 黃芩苷；LC-MS/MS；微透析；回收率；腦細胞間液

[Abstract] To further study the brain behavior and the pharmacokinetics of baicalin in intercellular fluid of brain，and study the recovery rate and stability of brain and blood microdialysis probe of baicalin in vitro and in vivo. The concentration of baicalin in brain and blood microdialysates was determined by LC-MS/MS and the probe recovery for baicalin was calculated. The effects of different flow rates （0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1） on recovery in vitro were determined by incremental method and decrement method. The effects of different drug concentrations （50.00，200.0，500.0，1 000 μg·L^-1） and using times （0，1，2） on recovery in vitro were determined by incremental method. The probe recovery stability and effect of flow rate on recovery in vivo were determined by decrement method，and its results were compared with those in in vitro trial. The in vitro recovery of brain and blood probe of baicalin was decreased with the increase of flow rate under the same concentration；and at the same flow rate，different concentrations of baicalin had little influence on the recovery. The probe which had been used for 2 times showed no obvious change in probe recovery by syringe with 2% heparin sodium and ultrapure water successively. In vitro recovery rates obtained by incremental method and decrement method were approximately equal under the same condition，and the in vivo recovery determined by decrement method was similar with the in vitro results and they were showed a good stability within 10 h. The results showed that decrement method can be used for pharmacokinetic study of baicalin，and can be used to study probe recovery in vivo at the same time.

[Key words] baicalin；LC-MS/MS；microdialysis；probe recovery；intercellular fluid of brain

微透析技術（microdialysis，MD）是一種以透析原理為基礎的膜取樣技術，可以對細胞間隙（extracellular space）中內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進行活體直接取樣[1-3]。與傳統(tǒng)的取樣技術相比，MD技術具有活體（in vivo）、實時（in time）、在線（on line）、對組織損傷小、高效等優(yōu)點[4-5]。它能實現(xiàn)連續(xù)取樣、動態(tài)測定體內(nèi)內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的變化，對于研究腦內(nèi)藥物代謝動力學過程具有重要意義，且樣品因不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，可不經(jīng)預處理直接用于測定[6-9]。

黃芩苷（baicalin，BAI）是由唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的1種黃酮類化合物，是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分，具有抗炎、減輕組織缺血再灌注損傷、清除氧自由基和抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞凋亡等藥理作用[10-13]。近年來隨著黃芩苷的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在治療缺血性腦中風方面發(fā)揮著重要作用[14-16]。為了進一步研究黃芩苷能否透過血腦屏障進入腦組織及其腦細胞間液藥代動力學，本文對黃芩苷的腦、血微透析體內(nèi)外回收率開展了研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201318）；玻璃離子體水門?。ㄉ虾ａt(yī)療器械股份有限公司）；復方氯化鈉注射液（林格氏液，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有限公司，臨用前用生理鹽水配成質(zhì)量分數(shù)為2%的溶液）；甲醇、乙腈（色譜純，Merk公司）；甲酸（色譜純，J.T.BAKER公司）；娃哈哈飲用純凈水（596 mL，杭州娃哈哈集團有限公司，用于流動相配制）；超純水（用于微透析實驗）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

API4000 Q-TRAP型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，含Turbo VTM離子源倉、離子噴霧和大氣壓電離離子源及Analysis 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Applied Biosystem公司）；Symbiosistm Pico在線固相萃取SPE-LC聯(lián)用系統(tǒng)（荷蘭Spark Holland公司）；CMA 12/4 mm腦微透析探針及套管、CMA 20/10 mm血液微透析探針、CMA 402微透析泵（瑞典CMA公司）；68001型大鼠立體定位儀（美國Stoelting公司）；AG-245分析天平（美國Mettler Toledo公司）；MS1 Minishaker渦流混合器（德國IKA公司）；Integral 3型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，250～270 g，購自斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，合格證號SCXK（京）2011-0004。

2 方法與結果

2.1 測定條件

色譜條件：色譜柱為Waters Symmetry C₁₈（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相為水-甲醇-乙腈（9∶0.5∶0.5，0.01%甲酸，A），甲醇-乙腈（1∶1，0.01%甲酸，1%水，B），梯度洗脫：0～0.2 min，63%A；0.2～1 min，63%～30%A；1～4.8 min，30%A；4.8～6.8 min，30%～63%A；流速0.23 mL·min^-1；柱溫25 ℃；進樣10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化（ESI）；正離子模式檢測；多反應監(jiān)測（MRM）；離子噴射電壓5 500 V；源內(nèi)溫度550 ℃；氣簾氣體：15 psi（1 psi=6.895 kPa）；源內(nèi)氣體1∶40 psi；源內(nèi)氣體2∶50 psi；用于定量的黃芩苷的離子通道為m/z 447.2/271.3。

2.2 溶液的配制

標準溶液配制：稱取黃芩苷對照品約2.0 mg，置1.5 mL離心管中，精密加入1.0 mL甲醇，渦旋混合，得相應濃度的對照品甲醇溶液，再用甲醇稀釋為1.00 g·L^-1的對照品儲備液。精密量取1.00 g·L^-1的黃芩苷對照品儲備液1 mL，置100 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為10.0 mg·L^-1的溶液，再用甲醇將此溶液依次稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為5 000，4 000，1 000，250.0，120.0，40.0 μg·L^-1的對照品儲備液，臨用前分別以復方氯化鈉注射液將上述6個濃度對照品儲備液稀釋10倍，得黃芩苷質(zhì)量濃度為500，400，100，25.0，12.0，4.0 μg·L^-1的標準溶液。

供試品溶液配制：稱取黃芩苷對照品5.0 mg，置50 mL量瓶中，加入林格氏液溶解后定容至刻度，得100.0 mg·L^-1的黃芩苷溶液，再用林格氏液將其稀釋成質(zhì)量濃度為1 000，500.0，200.0，100.0，50.0 μg·L^-1的微透析實驗用黃芩苷溶液，臨用前新鮮配制。

2.3 樣品處理

取各濃度的黃芩苷標準溶液以及腦、血微透析樣品各25 μL，分別加入等體積的40%甲醇溶液，渦旋混勻，即得。

2.4 線性范圍及定量下限

6個濃度的標準溶液按2.3項處理后，按照質(zhì)量濃度從低到高依次進行測定，以峰面積（Y）作為縱坐標，相應的黃芩苷質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，按（1/X2）加權線性回歸，得回歸方程Y=2 970X-992，r=0.999 0，表明黃芩苷在4～500 μg·L^-1線性關系良好，定量下限為4 μg·L^-1（S/N>10）。

2.5 專屬性試驗

大鼠麻醉后分別植入腦、血微透析探針，分別以1.5 μL·min^-1的流速灌流林格氏液，平衡60 min后，收集空白透析液并進行測定。之后灌流液改為100 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液，平衡60 min后，收集腦、血微透析液并進行測定，色譜圖見圖1。結果表明黃芩苷的峰形良好，保留時間為5.1 min，腦、血空白透析液中未見影響黃芩苷測定的干擾物。

2.6 精密度和準確度

參照2.2項方法，依次制備低、中、高（12，100，400 μg·L^-1）3個質(zhì)量濃度的黃芩苷標準溶液，按照2.3項進行處理，2.1項進行測定，1 d內(nèi)平行操作5次考察日內(nèi)精密度和準確度，連續(xù)3 d考察日間精密度和準確度，精密度和準確度分別用RSD和RE表示，見表1。

2.7 穩(wěn)定性

取質(zhì)量濃度依次為12，100，400 μg·L^-1的黃芩苷標準溶液，每個濃度5個樣品，按照2.3項進行處理，2.1項進行測定，12 h后再次測定，考察12 h穩(wěn)定性。另取低、中、高3個濃度的黃芩苷標準溶液，每個濃度5個樣品，在-80 ℃條件下放置3個月后，按照2.3項進行處理，2.1項進行測定，考察3個月穩(wěn)定性。結果顯示，12 h（4 ℃）和3個月（-80 ℃）條件下，低、中、高濃度的峰面積RSD分別為7.0%，1.7%，9.9%和4.4%，3.5%，1.6%，表明微透析液中的黃芩苷在12 h（4 ℃）和3個月（-80 ℃）內(nèi)相對穩(wěn)定。

2.8 稀釋可靠性

按照2.2項下制備4.0 mg·L^-1的對照品儲備液，以林格氏液稀釋10倍，按照2.3項進行處理，2.1項進行測定，用質(zhì)量濃度計算RSD，結果顯示在稀釋10倍后，黃芩苷的RSD為0.70%，證明稀釋10倍后測定的結果可靠。

2.9 基質(zhì)效應

分別用空白微透析液、超純水稀釋黃芩苷對照品儲備液，使黃芩苷的質(zhì)量濃度分別為12，100，400 μg·L^-1，按照2.3項處理，2.1項測定，分別記錄峰面積為A1，A₂，計算基質(zhì)效應，見表2。結果說明，微透析液中的黃芩苷基本無基質(zhì)效應。

3 腦、血液微透析探針回收率試驗

微透析探針回收率的研究需要測定體外和體內(nèi)回收率，其中體外回收率有2種常用的測定方法：增量法（正透析法）和減量法（反透析法），增量法能夠反映透析針的真實回收率，減量法則用于評價體內(nèi)回收率和真實回收率的一致性[17]。

3.1 體外回收率試驗

3.1.1 灌流速度對探針體外回收率的影響 分別采用增量法和減量法測定并計算體外回收率。增量法：將探針置于200 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液中（恒溫37 ℃），分別以0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1的流速灌注林格氏液，每個流速在平衡60 min后，收集5份樣品（每份30 μL），樣品處理按照2.3項，測定按照2.1項。計算微透析液濃度C_dialysate和原藥液中藥物濃度C₀，并計算增量法探針回收率（RR）：RR=C_dialysate/C₀×100%，結果見圖2。

減量法：將探針置于林格氏液中（恒溫37 ℃），分別以0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1的流速灌注200 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液，每個流速在平衡60 min后，收集5份樣品（每份30 μL），樣品處理按照2.3項，測定按照2.1項。計算微透析液濃度C_dialysate和原藥液中藥物濃度C₀，并計算減量法探針回收率（RL）：RL=（C₀-C_dialysate）/C₀×100%，結果見圖2。

結果顯示，在0.50～3.0 μL·min^-1，隨著灌流速度的增大，腦、血液微透析探針的回收率均隨著流速的增大而下降；相同流速時，2種探針的增量法、減量法測得的回收率均無明顯的差異。微透析探針的回收率與透析針半透膜的表面積成正比，而血液微透析探針的半透膜長度為腦微透析探針的2.5倍，因此其回收率也要高于腦微透析探針。

3.1.2 濃度對探針體外回收率的影響 在同一恒定的灌流速度下，測定并計算不同黃芩苷質(zhì)量濃度回收率，考察濃度對探針體外回收率的影響。依次將探針置于50，200，500，1 000 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液中（恒溫37 ℃），以恒定的流速（1.5 μL·min^-1）灌注林格氏液，每個濃度在平衡60 min后，收集5份樣品（每份30 μL），樣品處理按照2.3項，其中1 000 μg·L^-1質(zhì)量濃度的樣品以林格氏液稀釋10后再進行樣品處理，其余濃度直接進行樣品處理，測定按照2.1項。計算增量法探針回收率RR，結果見圖3。

結果顯示，當灌流速度不變時，在4種不同藥物濃度的溶液中測得的腦、血液微透析探針回收率相似。以回收率對濃度做圖，得到與x軸基本平行的線，表明在50～1 000 μg·L^-1，腦、血液微透析探針的回收率與濃度無關。

3.1.3 微透析探針使用次數(shù)對體外回收率的影響 選擇灌流速度為1.5 μL·min^-1，200 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液，按照3.1.1項增量法分別對新探針、使用1次和2次并經(jīng)過恢復處理的探針進行體外回收率試驗，每個探針在平衡60 min后，收集5份樣品（每份30 μL），測定峰面積并計算RR，結果見圖4。

結果顯示，在使用1次和2次，并經(jīng)過恢復處理后，腦、血液探針對黃芩苷的回收率與新探針的相比，沒有明顯的降低，說明探針的恢復處理對其繼續(xù)使用并保持較高的回收率有重要影響。

3.2 體內(nèi)回收率試驗

3.2.1 腦、血液微透析探針的植入 腦微透析探針的植入：大鼠腹腔注射4%的水合氯醛（10 mL·kg^-1）麻醉，備皮，暴露頭部囟門附近面積1～2 cm²的皮膚，切開皮膚，鈍性分離皮下組織并擦凈，暴露骨面。用立體定位儀固定大鼠頭部，標出前囟點，記錄前囟點各方向的坐標。在紋狀體對應的點（AP+0.050 cm，ML-0.30 cm，DV-0.40 cm）用牙科鉆打孔，另鉆2孔擰入螺絲釘；在鉆孔點植入微透析套管，用牙科水泥將套管連同2個螺釘一并固定。待牙科水泥牢固后，松開立體定位儀，灑入少量注射用青霉素鈉粉末，手術區(qū)域前后縫皮。術后觀察24 h，正常飼水食。實驗時先將探針置于超純水中浸泡約30 min后，以林格氏液或者一定濃度的對照品溶液灌流，排出氣泡；取出已植入的探針套管的假針，小心插入準備好的微透析探針，以一定的灌流速度，開始微透析。

血液微透析探針植入：探針使用前，首先將其置于超純水中浸泡20 min。之后置于2%肝素鈉溶液中，并以2.0 μL·min^-1的流速灌流2%肝素鈉約30 min。大鼠腹腔注射4%水合氯醛（10 mL·kg^-1），待麻醉后，在大鼠腹部中線靠左約0.5 cm、鎖骨附近，備皮，縱向剪口約1.5 cm，找出并鈍性分離頸靜脈，結扎遠心端，并在遠心端剪一小口，將血液探針朝心臟方向插入約2.4 cm，并與兩旁的肌肉組織縫合以固定探針，縫皮；繼續(xù)以2.0 μL·min^-1的流速灌流2%肝素鈉溶液約30 min后，灌流液更換為林格氏液或者一定濃度的對照品溶液，以一定的灌流速度，開始微透析。

3.2.2 體內(nèi)回收率穩(wěn)定性考察 體內(nèi)藥代動力學實驗一般需要持續(xù)較長的時間，這就需要同一根探針幾個小時甚至幾十個小時連續(xù)取樣，取樣過程中回收率如果變化不定，就無法得到真實可靠的實驗結果[2]。因此，本實驗對腦、血液微透析探針體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性進行了考察。

腦、血液微透析探針的植入按照3.2.1項方法進行，均以1.5 μL·min^-1的流速灌流200 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液，平衡60 min之后，開始收集，每60 min為1份樣品，共收集600 min，樣品處理按照2.3項，測定按照2.1項進行，計算回收率，結果見圖5。

結果表明，當灌流速度為1.5 μL·min^-1時，腦、血微透析探針對黃芩苷的體內(nèi)回收率在600 min內(nèi)保持相對穩(wěn)定，腦探針對黃芩苷的體內(nèi)平均回收率為21.70%，RSD為1.7%；血液探針對黃芩苷的體內(nèi)平均回收率為46.70%，RSD為1.7%，均有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。

3.2.3 灌流速度對探針體內(nèi)回收率的影響 按照3.2.1項植入腦、血微透析探針，分別以0.50，1.0，1.5，2.0，3.0 μL·min^-1的流速灌流200 μg·L^-1的微透析試驗用黃芩苷溶液，每種流速在平衡60 min后，收集5份樣品，樣品處理按照2.3項，測定按照2.1項進行，計算回收率，結果見圖6。

結果表明，在0.50～3.0 μL·min^-1，隨著灌流速度的增加，腦、血微透析探針對黃芩苷的體內(nèi)回收率均逐漸降低。

4 討論

微透析作為一種新型生物采樣技術，能夠在不干擾機體正常生命過程的情況下進行在體、實時、在線取樣，根據(jù)不同的組織和靶器官，選擇不同類型的透析針，可以實現(xiàn)給藥后多個部位樣品的同時采集，而且基于只允許小分子透過的原理，收集的樣品不包含大分子的蛋白和脂質(zhì)類物質(zhì)，可以直接進行樣品分析[18-19]。微透析探針的回收率是微透析技術用于研究藥物體內(nèi)動力學，尤其是腦細胞間液藥代動力學的一個關鍵問題，而影響回收率的因素有灌流速度、溫度、透析膜的性質(zhì)等，因此探針回收率的研究是其用于進一步研究的首要工作。

灌流速度的快慢直接影響到半透膜兩側物質(zhì)交換的效率，灌流速度越快，膜兩側物質(zhì)（內(nèi)源性小分子和藥物成分）的平衡時間越短，導致回收率較低，相反，灌流速度越慢則回收率越高，但是收集的樣品量也會相應減少，給檢測帶來不便。本實驗采用增量法和減量法考察了不同流速對黃芩苷探針體外回收率的影響，綜合考慮回收率和樣品量，最終選擇的灌流速度為1.5 μL·min^-1，30 min收集1份樣品；結果還表明回收率與灌流速度成反比，且在灌流速度相同的情況下，增量法和減量法測得的探針回收率基本保持一致，說明減量法測得的探針回收率能夠代替增量法進行體內(nèi)校正。

由于體內(nèi)藥物濃度的未知性，通過微透析收集樣品檢測到的濃度并不能真實反映靶器官內(nèi)的實際濃度，因此需要通過減量法測定探針的體內(nèi)回收率，比較與體外回收率的相似性，從而推斷體內(nèi)藥物的真實濃度。本實驗采用減量法對黃芩苷探針體內(nèi)回收率進行了考察，同時考察了不同流速對體內(nèi)回收率的影響，結果同樣表明回收率與灌流速度成反比；不同流速下所測得的體內(nèi)回收率與體外回收率基本一致。

進行動力學實驗一般需要考察不同時間點體內(nèi)藥物成分及藥效指標的濃度，實驗持續(xù)時間較長，因此為了得到更準確、科學的實驗數(shù)據(jù)，微透析探針的體內(nèi)穩(wěn)定性研究就很有必要。本實驗對黃芩苷腦、血探針回收率的10 h穩(wěn)定性進行了考察，發(fā)現(xiàn)探針在體內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

探針使用并經(jīng)過再恢復處理后，是否還能夠保持較高的透過率，決定著探針能否重復使用。本研究先采用高流速短時間的2%肝素鈉溶液沖洗，再低流速長時間的用超純水沖洗使用后的探針，經(jīng)上述恢復處理后，再以增量法（1.5 μL·min^-1）進行回收率實驗，結果顯示使用不超過3次的探針經(jīng)過上述方法處理后，與新探針相比，仍然能夠保持較高的透過率。

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[責任編輯 曹陽陽]