絲膠對(duì)STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞活性和胰島素分泌的影響*

王小杰，劉美曉，謝云鵬，孫一嬋，陳志宏△

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

絲膠對(duì)STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞活性和胰島素分泌的影響*

王小杰1，劉美曉1，謝云鵬2，孫一嬋1，陳志宏1△

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

目的:探討絲膠對(duì)STZ致?lián)p傷的大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞活性和胰島素分泌的影響。方法：以鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷，細(xì)胞分為正常組、STZ組和絲膠組(300μg/L)。普通光學(xué)倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的一般狀態(tài)；MTT法測(cè)定細(xì)胞活性；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中胰島素的含量。結(jié)果：與正常組相比，STZ組細(xì)胞活性明顯下降，培養(yǎng)上清中胰島素的含量明顯降低（P＜0.05）。經(jīng)300μg/L絲膠處理后，INS-1細(xì)胞活性、培養(yǎng)上清中胰島素的含量均明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：絲膠蛋白可提高STZ致?lián)p傷大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞的活性，以及促進(jìn)胰島素的分泌。

絲膠；鏈脲佐菌素（STZ）；INS-1細(xì)胞；細(xì)胞活性；胰島素分泌

目前，糖尿病已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病[1]。在全球糖尿病患者中，90%以上屬于2型糖尿病。2型糖尿病主要以血糖升高、胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能受損等為主要特征[2]。如何降低血糖，保護(hù)胰島，促進(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素是治療2型糖尿病的關(guān)鍵。絲膠是從蠶繭中提取的天然蛋白質(zhì)，本課題組前期研究采用鏈脲佐菌素（STZ）致2型糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)絲膠可有效降低血糖[3]。但絲膠降血糖的機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。為進(jìn)一步探討絲膠降血糖的作用機(jī)制，本研究以STZ誘導(dǎo)大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞損傷，觀察了絲膠對(duì)INS-1細(xì)胞活性和胰島素分泌的影響，為進(jìn)一步探討絲膠治療糖尿病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞株，上海賽百慷細(xì)胞庫；STZ，美國(guó)Sigma公司；MTT，美國(guó)GIBCO公司；ELISA胰島素檢測(cè)試劑盒，北京艾然生物科技有限公司；絲膠（sericin），由彩色蠶繭（承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供）中提取，冷凍干燥成粉末備用，使用時(shí)用培養(yǎng)基溶解。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞在37℃、5% CO2條件下， 置于含NaHCO31.5g/L，D-葡萄糖13.8mmol/L，10%胎牛血清、50μmol/Lβ -巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常組、STZ組和絲膠組，其中正常組細(xì)胞不作任何處理，STZ組以10mmol/L STZ作用INS-1細(xì)胞24h，絲膠組在以10mmol/L STZ處理INS-1細(xì)胞的同時(shí)以終濃度為300μg/L的絲膠作用24h。普通光學(xué)倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的一般狀態(tài)。

1.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞接種于96孔板，5×103個(gè)/孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別設(shè)空白組（只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞）、正常組和藥物組（STZ組和絲膠組）。每孔加入MT（T5mg/ml），作用4h后每孔加入150μl DMSO充分溶解甲瓚，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)492nm處測(cè)定各孔的吸光度（OD492）值，取6孔的平均值，OD值的改變表示細(xì)胞活性的改變。

1.4 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中胰島素含量 收集各組細(xì)胞上清離心后，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中胰島素含量，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492nm處測(cè)檢測(cè)吸光度（OD492）值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞的一般狀態(tài)（見附圖） 與正常組細(xì)胞相比，STZ組INS-1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了不規(guī)則形變，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多；絲膠組INS-1細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，胞質(zhì)透明，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)較少，更為接近正常組的細(xì)胞狀態(tài)。

附圖 各組細(xì)胞的一般形態(tài)

2.2 各組INS-1細(xì)胞的活性 與正常組相比，STZ組INS-1細(xì)胞活性明顯下降（P＜0.05）；與STZ組相比，絲膠組INS-1細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05，附表）。說明絲膠可明顯提高STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞的活性。

附表 各組INS-1細(xì)胞活性和細(xì)胞上清胰島素含量（n=6，±s）

附表 各組INS-1細(xì)胞活性和細(xì)胞上清胰島素含量（n=6，±s）

與正常組相比：*P＜0.05；與STZ組相比：#P＜0.05

組別 細(xì)胞活性（OD492） 上清胰島素含量（μIU/ml）正常組 0.753±0.025 5.943±0.025 STZ組 0.457±0.035* 5.267±0.031*絲膠組 0.673±0.012# 5.793±0.015#

2.3 各組INS-1細(xì)胞上清胰島素的含量 與正常組相比，STZ組INS-1細(xì)胞上清中胰島素的含量明顯下降（P＜0.05）；與STZ組相比，絲膠組細(xì)胞上清中胰島素的含量顯著升高（P＜0.05，附表）。說明絲膠可明顯改善STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞的胰島素分泌功能。

3 討論

近年來，糖尿病尤其是2型糖尿病的發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅人類的健康。當(dāng)前治療糖尿病的方法總體上仍以藥物治療為主。各類藥物雖能較好地控制血糖，但大多藥物均有不同程度的副作用，有相當(dāng)一部分人短時(shí)間內(nèi)即可出現(xiàn)肝腎損害[4]。因此，近年來國(guó)內(nèi)外研究者將目光轉(zhuǎn)向了具有降糖作用的天然物質(zhì)。絲膠是從天然彩色蠶繭中提取的由18種氨基酸組成的水溶性蛋白，具有生物相容性，可生物降解，對(duì)人體無毒性，可避免化學(xué)合成藥物帶給人體的毒副作用[5]。本課題組前期研究表明，絲膠可有效降低STZ致2型糖尿病大鼠的血糖、調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂、保護(hù)胰島細(xì)胞、海馬、性腺及腎臟，且絲膠預(yù)處理亦有類似的作用[3，6-9]。

為進(jìn)一步探討絲膠是否通過保護(hù)胰島細(xì)胞發(fā)揮降血糖作用，本研究特選取了大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞，該細(xì)胞是在SV40冰凍轉(zhuǎn)染的胰島細(xì)胞基礎(chǔ)上建立的，有較好的穩(wěn)定性，可在糖、胰高血糖素刺激下分泌胰島素，并被糖皮質(zhì)激素所抑制，故INS-1細(xì)胞是體外研究胰島細(xì)胞功能的理想模型[10]。本研究以STZ誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷，觀察了絲膠蛋白對(duì)胰島INS-1細(xì)胞活性和胰島素分泌功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)300μg/L絲膠處理細(xì)胞后，STZ誘導(dǎo)損傷的INS-1細(xì)胞活性、上清液中胰島素的含量均明顯升高。說明絲膠可能通過增強(qiáng)胰島細(xì)胞活力、促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素發(fā)揮降血糖作用。

[1]Catherine K, Katherine M, Robert H. Gestational diabetes and the incidence of type 2 diabetes: a systematic review[J]. Diabetes Care, 2002, 25(10): 1862-1868.

[2]Chen L, Magliano DJ, Zimmet PZ. The worldwide epidemiology of type 2 diabetes mellitus--present and future perspectives[J]. Nat Rev Endocrinol, 2011, 8(4): 228-236.

[3]付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31(1)：103-105.

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[10]任文輝，張保麗，李中平，等.芍藥苷對(duì)STZ損傷的INS-1細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31(2)：230-232.

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)

EFFECTS OF SERICIN ON CELL VIABILITY AND INSULIN SECRETION OF STZ INJURED INS-1 CELLS

WANG Xiao-jie, LIU Mei-xiao, XIE Yun-peng, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of sericin on cell viability and insulin secretion of streptozotocin (STZ) injured rats’ insulinoma INS-1 cells. Methods: The INS-1 cells were randomly divided into normal group, STZ group and sericin group. The cells in STZ group were cultured with STZ(10mmol/L) for 24h; the cells in sericin group were cultured with STZ(10mmol/L) and sericin (300μg/L) at the same time for 24h. The general state of INS-1 cells was observed by optical inverted microscope, MMT to detect the cell viability of INS-1 cells and ELISA to detect the insulin content in supernate. Results: Compared with normal group, the cell viability and insulin content in supernate of INS-1 cells decreased obviously (P＜0.05); After treating with sericin (300μg/L) , the cell viability and insulin content in supernate of INS-1 cells increased obviously (P＜0.05). Conclusions: Sericin can promote insulin secretion by enhancing the cell viability of STZ injured rats’insulinoma INS-1 cells.

Sericin; Streptozotocin (STZ); INS-1 cells; Cell viability; Insulin secretion

R587.1

A

1004-6879（2017）03-0190-03

2016-08-20）

* 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81441133），河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013406096），河北省教育廳青年基金項(xiàng)目（QN20131089）

△ 通訊作者