基于化學(xué)指紋圖譜和抗血小板聚集效價(jià)的丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)

劉振杰+史志龍+王伽伯+張海珠+李春雨+牛明+何琴+甄漢深+肖小河

摘 要 通過化學(xué)分析和生物活性評(píng)價(jià)考察丹參藥材的品質(zhì)差異，探討丹參抗血小板聚集生物活性的主要貢獻(xiàn)成分。采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)建立丹參藥材HPLC指紋圖譜，以抗血小板聚集相對(duì)效價(jià)作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地不同批次丹參藥材的品質(zhì)差異，構(gòu)建基于化學(xué)表征及生物效價(jià)測(cè)定的評(píng)價(jià)模式。結(jié)果表明，不同批次丹參藥材的HPLC指紋圖譜相似度很高（相似度0.930～0.998），而其抗血小板聚集相對(duì)效價(jià)相差10倍，提示化學(xué)指紋圖譜難以反映丹參的活性和質(zhì)量差異。通過化學(xué)指紋圖譜與抗血小板聚集生物效價(jià)進(jìn)行譜效相關(guān)分析，篩選出與生物活性相關(guān)系數(shù)大于0.5的6個(gè)色譜峰：二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及2個(gè)未知化合物。對(duì)上述4種已知化合物單體進(jìn)行活性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮的抗血小板聚集活性最強(qiáng)，而其它3種丹參酮類化合物幾乎沒有體外抗血小板聚集活性。進(jìn)一步比較丹參中高含量成分丹酚酸B與低含量成分隱丹參酮的活性貢獻(xiàn)，結(jié)果表明，兩者的活性貢獻(xiàn)基本相當(dāng)，說明隱丹參酮是丹參中低含量高活性成分，對(duì)評(píng)價(jià)丹參質(zhì)量具有重要貢獻(xiàn)度。

關(guān)鍵詞 丹參； 抗血小板聚集； 指紋圖譜； 生物效價(jià)； 譜效相關(guān)； 質(zhì)量評(píng)價(jià)

1 引 言

隨著中藥質(zhì)量控制技術(shù)飛速發(fā)展，以化學(xué)標(biāo)志物為核心的藥品標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)體系已達(dá)到發(fā)達(dá)國(guó)家水平，但尚未建立科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、低成本并符合中醫(yī)藥整體觀及中藥特點(diǎn)的中藥產(chǎn)品質(zhì)量保障體系。因此，需要盡快構(gòu)建具有中國(guó)特色的中藥技術(shù)規(guī)則，建立一個(gè)以臨床療效為導(dǎo)向，基于多環(huán)節(jié)、多指標(biāo)、定量化、綜合性的中藥材評(píng)價(jià)控制方法體系，對(duì)中藥材品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)與控制，以期保證中藥安全性、有效性和質(zhì)量穩(wěn)定性[1]。中藥指紋圖譜能夠體現(xiàn)多組分中藥的化學(xué)表征，可以控制中藥的整體質(zhì)量[2，3]。然而其所體現(xiàn)的化學(xué)成分與藥效的相關(guān)程度尚不明確。因此，單獨(dú)利用指紋圖譜評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的優(yōu)劣還存在一定的局限性[4，5]。而將指紋圖譜與藥效進(jìn)行相關(guān)性研究（譜效相關(guān)），不僅可以使指紋圖譜與其藥效相關(guān)聯(lián)，而且還能找到與活性密切相關(guān)的指紋圖譜峰，從而構(gòu)建對(duì)中藥質(zhì)量控制更有針對(duì)性的藥效指紋圖譜[6～9]。

最近，美國(guó)FDA發(fā)布《植物藥發(fā)展的工業(yè)指南（2015版）》，指出生物評(píng)價(jià)是中草藥和植物藥發(fā)展的一個(gè)重要方法[10]。生物評(píng)價(jià)（Biological assay， Bioassay），是指在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，評(píng)價(jià)供試藥物作用于生物體系（整體動(dòng)物、離體組織、器官、微生物和細(xì)胞以及相關(guān)生物因子等）所表達(dá)出的特定生物效應(yīng)的方法，可用于定性或定量評(píng)價(jià)供試藥物的質(zhì)量[11]， 具有關(guān)聯(lián)功效的優(yōu)勢(shì)。將生物評(píng)價(jià)方法應(yīng)用于譜效相關(guān)中，可以使譜效關(guān)系更準(zhǔn)確可靠[12]。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[13]。丹參及相關(guān)制劑廣泛應(yīng)用于臨床，加強(qiáng)其質(zhì)量管理水平具有重要意義[14]。目前，丹參的指紋圖譜已用于丹參及相關(guān)制劑的品質(zhì)評(píng)價(jià)[15～17]； 丹參及其主要成分，特別是隱丹參酮的抗血小板聚集活性也有報(bào)道[18，19]。然而，隱丹參酮、丹酚酸B等成分及丹參藥材基于抗血小板聚集活性的相對(duì)效價(jià)未見報(bào)道，單體成分對(duì)丹參藥材品質(zhì)優(yōu)劣的貢獻(xiàn)度仍然未知，這些指標(biāo)性成分與功能主治、藥效的關(guān)聯(lián)程度也不明確。因此，本研究在丹參化學(xué)指紋圖譜和抗血小板聚集效價(jià)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過譜效相關(guān)分析，探討丹參抗血小板聚集生物活性的主要貢獻(xiàn)成分； 通過計(jì)算活性貢獻(xiàn)度的方法，揭示脂溶性成分與水溶性成分對(duì)丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)的貢獻(xiàn)度，將更全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量，以保證臨床用藥安全性和有效性。構(gòu)建的基于化學(xué)指紋圖譜和生物評(píng)價(jià)的綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)方法， 可為丹參品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考，也為中藥炮制、藥材優(yōu)良品種選育、臨床處方選擇及制劑工藝優(yōu)化提供了新的評(píng)價(jià)模式。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 丹參樣品采集

本研究共采集10批次樣品，產(chǎn)地包括：甘肅（S1）、河南1（S2）、河南2（S3）、河北1（S4）、山東（S5）、山西（S6）、河北2（S7）、陜西（S8）、河北3（S9）、四川（S10）。樣品經(jīng)肖小河研究員鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖。

2.2 儀器與試劑

AggRAM血小板聚集儀（美國(guó)Helena公司）； 1200高效液相色譜儀（美國(guó) Agilent 公司）； Zorbax eclipse plus C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm， 美國(guó)Agilent公司）； 花生四烯酸（美國(guó)Helena Lab公司）； 阿司匹林（中國(guó)食品藥品檢定研究院）； 丹酚酸B、丹參素鈉、丹參酮ⅡA、丹參酮I、二氫丹參酮 I、隱丹參酮（成都普瑞法生物科技有限公司），以上對(duì)照品純度均大于98%。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），SPF級(jí)，體重240～260 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（軍）20120004。

2.4 化學(xué)指紋圖譜測(cè)定及分析

準(zhǔn)確稱取丹參藥材粉末3.0 g，加入80%甲醇超聲提取，提取液經(jīng)微孔濾膜過濾，供HPLC分析。HPLC條件：進(jìn)樣量5 μL，流速0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。流動(dòng)相為0.1% H3PO4 （A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，10%～28% B； 20～25 min，28%～48% B； 25～40 min，48%～60% B； 40～45 min，60%～10% B[15]。用《中國(guó)藥典》中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版計(jì)算相似度。應(yīng)用MetaboAnalyst 3.0軟件進(jìn)行分析。

2.5 藥材生物效價(jià)測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液制備 準(zhǔn)確稱取阿司匹林10.0 mg，加0.5% DMSO溶液500 mL，超聲溶解，制成0.02 mg/mL溶液， 并按劑間距1∶0.8稀釋成各個(gè)濃度的對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備 準(zhǔn)確稱取丹參藥材粉末3.0g，加入80%甲醇提取，提取液濃縮得浸膏，稱取適量浸膏，加0.5% DMSO溶液，超聲溶解，制成丹參供試品母液，并按劑間距1∶0.8稀釋得到不同濃度的供試品溶液。

2.5.3 血漿制備 將大鼠腹腔注射0.12 mol/L戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，以0.13 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，腹主動(dòng)脈取血。100×g離心15 min，吸取上清液作為富血小板血漿（PRP），剩余部分以2000×g離心10 min，取上清液即為貧血小板血漿（PPP）。

2.5.4 血小板聚集率測(cè)定 取PRP175 μL加入測(cè)試杯，然后取50 μL PPP加入測(cè)試杯，37℃溫育，加入25 μL花生四烯酸，記錄血小板聚集曲線及空白血漿的最大聚集率。另取175 μL PRP加入測(cè)試杯，再加入供試品溶液50 μL，同法測(cè)定供試品的最大聚集率。

2.5.5 相對(duì)校價(jià)計(jì)算 抑制率（I，%）=（空白血漿的最大聚集率-供試品的最大聚集率）/空白血漿的最大聚集率。計(jì)算不同濃度的供試品與對(duì)照品（阿司匹林）的抑制率，參照《中國(guó)藥典》[20]和《藥品生物檢定》[21]“質(zhì)反應(yīng)平行線法”進(jìn)行相對(duì)效價(jià)計(jì)算。

2.6 譜效相關(guān)

用MetaboAnalyst 3.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行Kendall分析[22]及SPSS軟件進(jìn)行Spearman分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)指紋圖測(cè)定

10批次丹參藥材指紋圖譜見圖1A，相似度結(jié)果見表1。結(jié)果表明，10批次丹參藥材相似度在0.930～0.998之間，相似度非常高。然而，相似度是均等比較所有成分的綜合相似程度，如丹酚酸B就是丹參中高含量成分，其對(duì)指紋圖譜相似度影響最大，因此，通過指紋圖譜不易發(fā)現(xiàn)各批次丹參藥材之間的差異。本研究共選取17個(gè)共有峰，以峰面積進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見圖1B，不同批次丹參藥材中除丹參酮類成分外化學(xué)成分變異不大。聚類結(jié)果（圖1B）中，批次4藥材單獨(dú)聚為一類，其丹參酮類化學(xué)成分為主要差異成分。而不同批次的藥材質(zhì)量是否存在差異，尤其是針對(duì)活血功效時(shí)丹參的品質(zhì)是否有差異，目前尚無(wú)明確定論，究其根本原因，是品質(zhì)評(píng)價(jià)方法的缺失造成的。

3.2 藥材生物效價(jià)測(cè)定

由相對(duì)效價(jià)計(jì)算結(jié)果（圖2）可知，本方法可以很好地區(qū)分不同批次丹參藥材的質(zhì)量差異，10批次藥材中，丹參抗血小板聚集的最高效價(jià)與最低效價(jià)相差10倍，提示化學(xué)指紋圖譜難以反映丹參的活性和質(zhì)量差異。

對(duì)10批次丹參藥材的17個(gè)色譜峰面積與抗血小板聚集效價(jià)進(jìn)行Kendall相關(guān)分析及spearman相關(guān)分析，結(jié)果見圖3。其中12～17號(hào)峰與抗血小板聚集效價(jià)具有較高相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)大于0.5； 而具有顯著性相關(guān)的是12、13、15號(hào)峰，特別是13號(hào)峰，具有最大的相關(guān)系數(shù)。

3.3 單體化合物活性驗(yàn)證

根據(jù)相關(guān)分析結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)活性相關(guān)系數(shù)較高的色譜峰的結(jié)構(gòu)[23]。經(jīng)過比對(duì)，12、13、14和16號(hào)色譜峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，確定為二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，而15和17號(hào)峰為未知化合物，見圖4A和4B。另外，計(jì)算丹參指紋圖譜峰的對(duì)稱因子、理論塔板數(shù)、分離度、選擇度，結(jié)果見表2，HPLC相關(guān)參數(shù)達(dá)到分離要求，確定色譜峰的分離效果良好，從而排除色譜峰中的其它雜質(zhì)成分干擾。

對(duì)已鑒定的化合物進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果見圖4C。隱丹參酮的抗血小板聚集抑制率為100%，而其它3個(gè)單體化合物在此濃度下沒有抑制作用。本研究中二氫丹參酮Ⅰ（12號(hào)峰）、隱丹參酮（13號(hào)峰）、丹參酮Ⅰ（14號(hào)峰）、丹參酮ⅡA（16號(hào)峰）都與抗血小板聚集的效價(jià)相關(guān)度較高，但驗(yàn)證結(jié)果證明只有隱丹參酮（13號(hào)峰）有很強(qiáng)的抗血小板聚集作用（圖4C）； 因此，譜效相關(guān)的方法仍有一定缺陷，盡管應(yīng)用本方法能夠得出相關(guān)系數(shù)較高的成分，但不能排除多個(gè)成分之間伴隨相關(guān)的情況。為了排除伴隨相關(guān)/自相關(guān)的存在，應(yīng)將可辨識(shí)得到的單體化合物進(jìn)行活性效價(jià)測(cè)定的驗(yàn)證，也就是逐個(gè)地對(duì)化合物進(jìn)行活性測(cè)定，以確定這些成分與效價(jià)之間是真實(shí)相關(guān)，還是伴隨相關(guān)。本研究對(duì)4種與藥效密切相關(guān)的成分進(jìn)行了活性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)只有1種成分與藥效密切相關(guān)，為真實(shí)相關(guān)，其它3種成分是伴隨相關(guān)。

另外，測(cè)定并計(jì)算了丹參藥材中指標(biāo)性成分的丹酚酸B和隱丹參酮的抗血小板聚集相對(duì)效價(jià)，測(cè)定方法同2.5節(jié)，結(jié)果見表2（相對(duì)效價(jià)）。結(jié)果表明，單體化合物相對(duì)效價(jià)之間存在一定的差異，隱丹參酮的相對(duì)效價(jià)為1628 U/mg，比丹酚酸B（37 U/mg）的相對(duì)效價(jià)高40倍，為阿司匹林的1.6倍。隱丹參酮為丹參中抗血小板聚集的藥效物質(zhì)，隱丹參酮抗血小板高活性功能的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步開發(fā)抗血小板聚集的新藥的前體化合物提供可能[24]。隱丹參酮具有高活性的例子還發(fā)生在抑制血管新生，調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能上， 例如，隱丹參酮可以抑制體外血管生成，但丹參酮ⅡA卻沒有抑制作用[25，26]。

活性貢獻(xiàn)度即為指紋圖譜中活性成分的峰面積與此成分單體化合物的相對(duì)效價(jià)的乘積，由此可以出計(jì)算活性貢獻(xiàn)度，并比較丹參中高含量成分丹酚酸B與低含量成分隱丹參酮的活性貢獻(xiàn)，丹酚酸B和隱丹參酮的活性貢獻(xiàn)度分別為97779和90472，結(jié)果表明，兩者的活性貢獻(xiàn)基本相當(dāng)。因此，可以通過計(jì)算效應(yīng)成分指數(shù)的辦法[27，28]對(duì)中藥藥效成分進(jìn)行活性校正， 以更好地綜合評(píng)控中藥質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究通過測(cè)定不同批次丹參藥材的指紋圖譜，并結(jié)合其抗血小板聚集效價(jià)進(jìn)行相關(guān)分析，構(gòu)建了基于化學(xué)指紋圖譜和生物評(píng)價(jià)的綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)方法。此模式可以將中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與藥材的生物活性或臨床功效結(jié)合，不僅為多成分、多靶點(diǎn)的中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)方法提供了參考依據(jù)，還可為中藥炮制、優(yōu)良品種選育、制劑工藝優(yōu)化及臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

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