基于同步輻射X射線熒光光譜和X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)譜研究鉛鋅礦區(qū)浮萍中砷的耐受機(jī)制

儲(chǔ)彬彬+羅立強(qiáng)+馬艷紅

摘 要 水生植物浮萍能夠富集高濃度的砷，是植物過濾修復(fù)技術(shù)的代表，其耐受機(jī)理備受關(guān)注。本研究利用同步輻射X射線熒光光譜（Synchrotron radiation Xray fluorescence， SRXRF）和X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)譜（Xray absorption near edge structure， XANES）技術(shù)，開展了鉛鋅礦區(qū)天然富砷浮萍樣品中砷元素的微區(qū)分布和形態(tài)特征研究。微區(qū)SRXRF分析了兩個(gè)單片浮萍樣品FP1和FP2，單點(diǎn)掃描時(shí)間分別為5 s和2 s，光斑尺寸分別為70 μm×80 μm和100 μm×100 μm；對(duì)FP2樣品選擇了6個(gè)位置進(jìn)行了微區(qū)XANES單點(diǎn)形態(tài)分析，掃描的能量范圍為11.81～11.96 keV；整體XANES形態(tài)分析是針對(duì)壓片的浮萍樣品，掃描的能量范圍為11.67～12.27 keV。結(jié)果表明，浮萍樣品整體和微區(qū)XANES數(shù)據(jù)均表明砷形態(tài)為As；SRXRF微區(qū)分析發(fā)現(xiàn)浮萍中砷元素具有顯著的葉脈分布特征，在一定濃度范圍內(nèi)，砷并不擴(kuò)散到進(jìn)行光合作用的葉肉中，有利于減輕砷對(duì)葉片的毒害作用，可能是浮萍耐受砷的一個(gè)保護(hù)機(jī)制。

關(guān)鍵詞 浮萍； 砷； 微區(qū)分布； 形態(tài)

1 引 言

全球約有1.5億人的飲用水受到砷污染[1]， 我國(guó)也有多處水資源受砷污染的報(bào)道， 臺(tái)灣嘉義南臺(tái)[2]、新疆奎屯[3]、內(nèi)蒙河套平原[4]、山西山陰縣[5]等地先后出現(xiàn)了地方性飲水型砷中毒。植物過濾作為一種環(huán)境友好、低成本的植物修復(fù)技術(shù)，在過去20年逐漸發(fā)展起來。水生植物浮萍能富集高濃度的砷，是植物過濾修復(fù)技術(shù)的代表。如浮萍（Lemna minor）在64 μmol/L As和As溶液暴露6天，分別富集砷17408和8674 μg/g，富集系數(shù)可達(dá)3626和1807[6]。

因而，浮萍耐受As的機(jī)理也備受關(guān)注。Zhang等[7]通過一種特定的γ谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑（LButhionine sulphoximine）對(duì)浮萍影響的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入該抑制劑不僅會(huì)減少As還原成As，還會(huì)抑制植物螯合肽（PCs）的合成，降低了浮萍攝取和耐受As的能力，從而認(rèn)為PCs在浮萍（Wolffia globosa）對(duì)砷的耐受性和解毒方面起著重要作用；Leo等[8]通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)浮萍（Lemna gibba）比魁葉萍（Salvinia minima）對(duì)As的耐性指數(shù)（Tolerance index）高20%，主要是由于浮萍面對(duì)As脅迫時(shí)，會(huì)增加硫酸鹽的吸收和代謝，從而促進(jìn)谷胱甘肽和非蛋白巰基的合成，參與細(xì)胞解毒。Leo等[9]認(rèn)為花青素、非蛋白巰基和抗氧化物清除酶在浮萍（Lemna gibba）耐受As的毒性中起著一定作用。這些研究主要探討的是浮萍中某種化合物在As耐受和解毒中的作用，但從元素微區(qū)分布特征和微區(qū)形態(tài)的角度，討論浮萍對(duì)As的耐受性的研究還未見報(bào)道。另外，這些研究都是針對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的浮萍，天然情況下浮萍的這些特征是否有變化，也有待研究。

本研究針對(duì)鉛鋅礦區(qū)天然的富As浮萍（Lemna minor），通過SRXRF和XANES技術(shù)，研究浮萍中As的微區(qū)分布特征和微區(qū)形態(tài)，探討其與As耐受性的關(guān)系。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

利用XSeries電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS，美國(guó)Thermo Fisher公司）進(jìn)行浮萍及所在水體中砷總量的測(cè)定。前處理試劑包括HNO3和H2O2（MOS級(jí)，北京化學(xué)試劑研究所的）； 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（室溫電阻率約18 MΩ·cm）。

用于形態(tài)分析的化合物標(biāo)準(zhǔn)為：三苯基砷（Triphenylarsine，（C6H5）3As，Alfa Aesar公司）； 洛克沙腫（Roxarsone，C6H6AsNO6，Adamasbeta公司）； 二甲基砷酸（Dimethylarsinic acid，（CH3）2AsO2H，Dr.Ehrenstorfer公司）； Na2HAsO4·7H2O（Chem Service公司）。上述化合物均購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，純度約為98%。

2.2 樣品的采集和處理

采集了南京鉛鋅礦區(qū)附近菜園水溝中的浮萍（Lemna minor）及水樣。浮萍樣品用網(wǎng)撈出后，剔除雜物，用水清洗多次后，用去離子水沖洗3次，后續(xù)不同的分析采用不同的處理流程。（1）總砷測(cè)定的浮萍樣品 洗凈的浮萍用紗布包裹后，自然晾干，研磨粉碎后，稱取0.5000g浮萍干樣，進(jìn)行ICPMS含量分析，其消解流程參照文獻(xiàn)[10]。（2）微區(qū)SRXRF元素分析和微區(qū)XANES形態(tài)分析的浮萍樣品 用密封盒采集含水的新鮮浮萍帶至上海同步輻射實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)，取單片浮萍樣品用去離子水沖洗后吸干水分，將浮萍的根和葉分離，放入3M膠帶，立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（3）整體XANES形態(tài)分析的浮萍樣品 洗凈的浮萍樣品用濾紙吸干水分后，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后樣品研磨至顆粒直徑小于74 μm，利用壓片機(jī)制成直徑為5 mm 的樣片， 20℃保存， 待測(cè)。

水樣分兩部分處理：一部分是用0.22 μm濾膜過濾后加入HNO3；一部分加入HNO3后再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。 二者HNO3的最終濃度均為2%。處理后的水樣用ICPMS測(cè)定。

2.3 同步輻射SRXRF和XANES形態(tài)分析

單片浮萍的微區(qū)SRXRF元素分析和微區(qū)XANES形態(tài)分析在上海同步輻射裝置BL15U1光束線上的硬X射線微聚焦線站進(jìn)行。SRXRF分析了兩個(gè)單片浮萍樣品，分別為FP1浮萍的葉和根以及FP2浮萍的葉，單點(diǎn)掃描時(shí)間分別為5 s和2 s，光斑尺寸分別為70 μm×80 μm和100 μm×100 μm。微區(qū)XANES分析了浮萍FP2，光斑尺寸約為200 μm×200 μm，掃描的能量范圍為11.81～11.96 keV。

壓片浮萍的整體XANES砷形態(tài)分析在上海同步輻射裝置BLl4Wl光束線上的X射線吸收站譜進(jìn)行。采用Si（111）雙晶單色器，用固體探測(cè)器熒光模式測(cè)定樣品，并在后電離室加濾波片鍺（Ge）。由于自然界沒有純砷的標(biāo)樣，故利用靠近砷吸收邊能量（11867 eV）的金片（11919 eV）進(jìn)行能量校正。校準(zhǔn)后開始樣品的測(cè)定。采集樣品的能量范圍為11.67～12.27 keV。另外，砷的化合物標(biāo)樣，含砷量較高，將其均勻涂在3M膠帶中，透射模式下測(cè)定。

利用PyMCA軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)解譜；利用Igor Pro軟件進(jìn)行面掃描數(shù)據(jù)的處理；利用Athena和Origin軟件進(jìn)行樣品和標(biāo)樣的形態(tài)分析和對(duì)比。

3 結(jié)果與討論

3.1 浮萍及水體中砷的含量

利用ICPMS分析了鉛鋅礦區(qū)浮萍及其所在水體中As的含量。浮萍樣品中As的含量為（46.5±0.15）μg/g， 超過了該菜園中蔬菜As的含量（0.097～43.0 μg/g）[11]，遠(yuǎn)高于食品中As的限量值0.05～1.5 μg/g[12]。然而，該浮萍所在水體中As的含量91.0 μg/L，并未超過地表水Ⅴ類水體中As的限值100 μg/L[13]。該地浮萍對(duì)水As的富集系數(shù)約為511倍，富集作用較顯著。

此外，通過對(duì)比不同水樣處理方式可知，加酸后過濾的水樣中As的含量為（91.0±0.16） μg/L，是過濾后加酸的水樣中As的含量（（37.2±0.42） μg/L）的2.4倍，差異并不顯著。然而該水體中Pb含量在上述兩種處理方法后的水樣中含量分別為450和0.469 μg/L，相差近1000倍[10]。這說明As和Pb在水中賦存位置不同，Pb主要存于水懸浮物中，而As主要存于水溶液中。

3.2 浮萍中元素的SRXRF微區(qū)分布特征

SRXRF微區(qū)分析是通過圈定元素感興趣區(qū)，計(jì)算感興趣區(qū)內(nèi)電子計(jì)數(shù)之和進(jìn)行元素在不同點(diǎn)的面掃描分析。因而感興趣區(qū)的選擇是SRXRF微區(qū)分析中的重要部分。在XRF中，第n個(gè)元素的kβ譜線與第n+1元素的kα譜線存在重疊干擾，因此需要針對(duì)樣品中的元素特征，選擇無重疊干擾的譜線作為元素的感興趣區(qū)。從單片浮萍葉的60s SRXRF光譜圖（圖1）可見，浮萍中主要含Mn， Fe， Zn和As，并含有少量的Cu和Pb。圖1中紅色劃線部分是圈定的各元素感興趣區(qū)?？紤]到Mnkβ對(duì)Fekα， Cukβ對(duì)Znkα的譜線重疊干擾，故選擇Fe和Zn的kβ譜線作為感興趣區(qū)。由于Mn含量高，且樣品中無其它元素譜線重疊干擾Mnkα，故選擇Mnkα譜線作為感興趣區(qū)；同理，譜線中來見Ni的譜峰，故不存在Nikβ譜峰干擾Cu kα的現(xiàn)象，故選擇Cukα為Cu的感興趣區(qū)。譜圖中，As和Pb的譜峰均出現(xiàn)，但是Askα（10543 eV）和Pb Lα （10551eV）譜線重疊嚴(yán)重，故分別選擇Askβ和PbLβ為As和Pb的感興趣區(qū)。浮萍中各元素的感興趣區(qū)如下：Mn 5600～6150 eV，F(xiàn)e 6900～7200 eV， Cu 7800～8240 eV， Zn 9370～9800 eV， As 11600～11850 eV， Pb 12450～12750 eV。 此外，圈定了Compton峰的感興趣區(qū)（15400～15700 eV）用于后續(xù)的背景和基體校正。

浮萍樣品的SRXRF元素微區(qū)分布如圖2所示。每點(diǎn)的元素感興趣區(qū)計(jì)數(shù)除以Compton感興趣區(qū)的計(jì)數(shù)，以此強(qiáng)度比制圖（圖2）。采用Compton強(qiáng)度比有利于降低因電離室計(jì)數(shù)、死時(shí)間的波動(dòng)等外界因素的影響，也可在一定程度上減小樣品厚度、平整度及共存元素等的影響。

浮萍根部的微區(qū)分布顯示了元素在根部的不均勻分布。從圖2的FP1的根部掃描圖可見，Pb， Zn和Cu高點(diǎn)在根冠部位，Mn在根尖部位，F(xiàn)e在根部中間部位，而As在根部分布相對(duì)比較均勻。

浮萍葉片部分的元素微區(qū)分布指示了浮萍耐受砷的一種保護(hù)機(jī)制。該地浮萍中砷元素含量較高，砷元素的微區(qū)分布特征具有明顯的規(guī)律性。從圖2可見，砷元素主要沿浮萍的側(cè)脈（Lateral vein）和中間葉脈（Middle of vein）分布，并在根和葉相交的節(jié)點(diǎn)（Node）處含量達(dá)到最高，而營(yíng)養(yǎng)元素Fe， Mn， Cu， Zn等并無此分布特征，這些營(yíng)養(yǎng)元素幾乎充滿了整個(gè)葉片。這說明浮萍中砷與營(yíng)養(yǎng)元素的存儲(chǔ)有所不同，砷通過浮萍根部傳輸并保存在葉脈中，在一定濃度范圍內(nèi)，砷并不擴(kuò)散到葉片其它部位（如進(jìn)行光合作用的葉肉中）。葉脈主要由維管束組成，為葉的支持結(jié)構(gòu)，不含葉綠素，不進(jìn)行光合作用。砷在葉脈維管束中聚集的特點(diǎn)在砷超富集植物蜈蚣草的研究中也有報(bào)道[14]。砷的這種分布特性有利于減輕砷對(duì)葉片的毒害作用，可能是浮萍耐受砷毒害產(chǎn)生的保護(hù)機(jī)制。而有害元素鉛在此次實(shí)驗(yàn)中含量較低，為了避免砷的干擾，鉛感興趣區(qū)選定的是熒光產(chǎn)額相對(duì)較低的Lβ譜線，故鉛的計(jì)數(shù)很低，在此次實(shí)驗(yàn)中Pb的分布特征并不明顯，需要針對(duì)高鉛含量的浮萍樣品做進(jìn)一步分析。

元素相關(guān)性分析有助于推測(cè)元素間的吸收和存儲(chǔ)關(guān)系。針對(duì)圖2中FP2樣品，圈定了兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行了元素相關(guān)性分析，見圖2 FP2As 中兩個(gè)紅色方形區(qū)域。大區(qū)域涵蓋了主要的葉片部分，含樣品點(diǎn)532個(gè)；小區(qū)域主要針對(duì)根和葉相交的節(jié)點(diǎn)處，含樣品點(diǎn)49個(gè)。相關(guān)性分析結(jié)果見表1。從整個(gè)葉片區(qū)域來看，分析點(diǎn)較多，As與Mn， Fe， Cu， Zn， Pb等元素均在0.01水平上顯著正相關(guān)；從小的As富集區(qū)域來看，As與Mn和Fe具有顯著正相關(guān)，As與Cu， Zn， Pb均無相關(guān)性。這些相關(guān)性表明，對(duì)于同一浮萍樣本，元素之間的吸收可能存在相似性，但在局部位置元素的存儲(chǔ)存在差異性。這在其它植物中也有相似發(fā)現(xiàn)，如，砷超富集植物大葉井口邊草（Pteris nervosa）葉柄、中脈和羽葉中，As與K， Ca， Mn， Fe， Cu和Zn等元素相關(guān)性在0.01水平上均顯示強(qiáng)正相關(guān)，而在根部As只與Fe有相關(guān)性[15]；蜈蚣草的成熟葉片中，As與Mn是顯著負(fù)相關(guān)（r=0.795），而年輕葉片中，Mn不受As影響[16]；稻粒中，As與Fe無相關(guān)性，但稻葉中，As與Fe相關(guān)性顯著[17]。

3.3 浮萍中As的吸收譜形態(tài)分析

浮萍的單點(diǎn)微區(qū)XANES和整體XANES分析結(jié)果分別如圖3和圖4所示，砷在新鮮的浮萍樣品以As形式存在；浮萍不同部位的單點(diǎn)微區(qū)XANES分析結(jié)果顯示，各點(diǎn)之間As形態(tài)無明顯差異。這與Zhang等[18]通過HPLCICPMS研究的無根浮萍（Wolffia globosa）90%為As的結(jié)果相似。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道植物中砷以As形式存在[19，20]，但部分植物中不同部位中As的形態(tài)卻有差異。如蜈蚣草（Pteris vittata）孢子在As培養(yǎng)液中生長(zhǎng)后進(jìn)行X射線吸收譜分析，發(fā)現(xiàn)根部主要是As（90%±4%），葉片主要是As（95%±1%），而葉片主脈則含有24% As和76% As [21]。本實(shí)驗(yàn)中天然浮萍樣品整體和微區(qū)XANES均顯示砷形態(tài)為As。雖然As的毒性大于As，但As比As更容易排除細(xì)胞外，因此有學(xué)者認(rèn)為， 將As還原成As是生物解毒的機(jī)制之一[22]。

另外，研究發(fā)現(xiàn)浮萍砷形態(tài)受實(shí)驗(yàn)條件的影響。從圖4可見，新鮮的浮萍樣品為As，而非新鮮的浮萍樣品（X射線照射約115 min，之后冷凍保存2個(gè)多月）As形態(tài)已經(jīng)變?yōu)锳s。 As的浮萍樣品雖然一直冷凍保存，但曾做過Pb的XANES形態(tài)測(cè)試，接收了X射線照射。砷的形態(tài)易受多種因素影響，如Webb等[23]研究的蜈蚣草葉片鮮樣砷為As，而烘干的樣品砷卻變成了As； Meirer等[20]研究發(fā)現(xiàn)As的營(yíng)養(yǎng)液在48 h后也會(huì)有部分（<30%）被氧化成As。本實(shí)驗(yàn)中浮萍樣品砷形態(tài)變?yōu)锳s， 可能是由于X射線照射引起。

4 結(jié) 論

鉛鋅礦區(qū)菜園水溝中浮萍對(duì)As具有明顯富集作用。SRXRF微區(qū)分析發(fā)現(xiàn)， 浮萍中砷元素具有顯著的葉脈分布特征，即砷元素沿著浮萍的側(cè)脈和中間葉脈分布，并在根和葉相交的節(jié)點(diǎn)處含量達(dá)到最高。砷的這種分布特性有利于減輕砷對(duì)葉片的毒害作用，這可能是浮萍耐受砷的保護(hù)機(jī)制。另外，浮萍中砷的XANES分析表明其為As，但是樣品經(jīng)X照射并放置一段時(shí)間后，As被氧化為As。微區(qū)XANES分析表明，浮萍的不同部位中，砷的形態(tài)與浮萍整體的XANES形態(tài)分析結(jié)果相同，為As化合物，且各點(diǎn)之間As形態(tài)無明顯差異。

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