人巨細(xì)胞病毒UL135蛋白的原核表達及其多克隆抗體的制備和鑒定

胡盈盈，郭剛強，葉思思，孫祥威，毛晨晨，薛向陽，呂杰強

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015）

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人巨細(xì)胞病毒UL135蛋白的原核表達及其多克隆抗體的制備和鑒定

胡盈盈1，郭剛強2，葉思思2，孫祥威3，毛晨晨3，薛向陽2，呂杰強1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015）

目的：制備人巨細(xì)胞病毒（HCMV）UL135原核表達蛋白及其多克隆抗體。方法：生物信息學(xué)分析HCMV UL135蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后對胞外序列進行全基因合成，將序列克隆至原核表達載體構(gòu)建pET21a（+）/HCMV UL135重組質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達后，Ni-NTA親和層析法純化UL135重組蛋白，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，ELISA、Western blot法檢測抗體靈敏度和特異性。結(jié)果：HCMV的UL135基因在原核表達系統(tǒng)中成功表達，經(jīng)Ni-NTA親和純化后獲得高純度的目的蛋白；免疫新西蘭兔誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的多克隆IgG抗體，且效價為1∶12 800；經(jīng)ELISA以及Western blot證實制備的兔抗多克隆抗體可特異性識別UL135蛋白。結(jié)論：成功實現(xiàn)了HCMV UL135的重組表達并制備了UL135兔多克隆抗體，為進一步研究UL135蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

人巨細(xì)胞病毒；UL135蛋白；多克隆抗體

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種雙螺旋DNA病毒，屬于皰疹病毒科β亞科，是皰疹病毒家族中的重要成員之一，整個230 kb的基因組能編碼約180種蛋白[1-2]。HCMV存在免疫逃避特性，能逃避自然殺傷細(xì)胞的殺傷；在免疫功能正常的個體，HCMV潛伏感染，但在機體免疫功能受損或者免疫缺陷的情況下，HCMV可被激活而表現(xiàn)出多種臨床癥狀[3-4]。近期研究發(fā)現(xiàn)HCMV持續(xù)且潛伏的感染與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-8]，腫瘤組織中HCMV mRNA、DNA或抗原檢測陽性表明HCMV的感染是腫瘤發(fā)生的一個病因。有研究表明，HCMV基因組的UL/b’區(qū)所表達的蛋白與病毒結(jié)構(gòu)尤其是組織嗜性、毒力以及病毒逃避機體免疫監(jiān)視密切相關(guān)[9]。UL/b’區(qū)的UL135基因所表達的蛋白可以改變細(xì)胞骨架，從而減少細(xì)胞免疫突觸的形成，逃避機體免疫攻擊，對病毒潛伏、復(fù)制及致病均有重要作用[9]。因此，UL135差異表達可能是決定HCMV的致病性及引起何種器官受損的內(nèi)在因素。然而目前市面上不存在針對UL135蛋白的特異性抗體，這對UL135蛋白的檢測及其功能的進一步研究造成了重大障礙。因此，本研究利用基因克隆及原核表達的方法，制備了兔抗多克隆抗體，為HCMV的生物學(xué)功能研究，甚至為HCMV感染的臨床診斷提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與酶類：pET21a（+）表達載體和E.coli BL21（DE3）均購自美國Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶、鎳螯合親和層析柱（Ni-NTA Agarose）購自德國Qiagen公司；鼠抗His-tag單克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量marker購自日本Takara公司；限制性核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI、標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker購自美國Thermo公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；其余所用化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物：健康新西蘭兔，雌性，體質(zhì)量為（2.5±0.2）kg，4～5周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK（浙）2009-0129。1.2 方法

1.2.1 PET21a（+）/UL135重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：根據(jù)在線蛋白工具（EXPASY、Phobius prediction、TMHMM）預(yù)測UL135蛋白跨膜區(qū)，提示跨膜區(qū)范圍為1～26氨基酸，去除氨基酸序列對應(yīng)的前段78個堿基。交由上海生工生物工程股份有限公司進行原核蛋白密碼子優(yōu)化后再進行UL135全基因合成，克隆入pET21a（+）載體中，以構(gòu)建pET21a（+）/UL135重組質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌中，在無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)6～8 h。氨芐青霉素平板篩選陽性克隆并用PCR進行驗證，挑選PCR正確的菌液送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。PCR驗證過程：設(shè)計引物：上游引物：GTACATCGGTGAAGACGGT；下游引物：AGAGCAGTGAGACGGAGAA。以陽性菌液為DNA模板，用自行設(shè)計的UL135胞外區(qū)引物進行PCR擴增，以擴增去除26個跨膜區(qū)氨基酸所對應(yīng)的堿基后的特異UL135序列，擴增片段大小為124 bp。20 μL反應(yīng)體系為：DNA模板1.0 μL，2×Taq DNA聚合酶10 μL，前后引物各0.8 μL，無酶水7.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。反應(yīng)完成后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

1.2.2 pET21a（+）/UL135重組蛋白誘導(dǎo)表達：將上述測序正確的陽性克隆進行誘導(dǎo)表達，按1∶100的比例接種至含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃，250 r/min震蕩培養(yǎng)，12 h后再按1∶50的比例接種至250 mL的LB/氨芐青霉素中，37 ℃，250 r/min震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至吸光度A600=0.6時，分裝10 mL二活后的菌液至無菌的50 mL離心管中，加入IPTG至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)6 h后12 000 r/min離心5 min，收集細(xì)菌。用8 mol/L尿素溶解細(xì)菌后分別進行SDS-PAGE以及Western blot分析鑒定，檢測蛋白是否表達。

1.2.3 Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白：將UL135蛋白進行大量的誘導(dǎo)表達后，收集細(xì)菌，尿素重懸后冰浴中進行超聲破菌、離心后，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色；同時將另一塊SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，鼠抗His標(biāo)簽抗體為一抗（1∶1 000），HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗（1∶5 000）進行Western blot實驗，確定UL135蛋白的表達情況。結(jié)果顯示UL135蛋白在超聲后的上清和沉淀中均存在，但超聲后僅含有少量沉淀，提示超聲完全，UL135蛋白主要存在于上清中，因此我們使用Ni-NTA Agarose進行親和層析純化，分別用過柱平衡液配制的10、50、100、200、500 mmol/L濃度咪唑洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE電泳以明確最適的洗脫濃度。收集含有UL135蛋白的100mmol/L和200 mmol/L洗脫液進行梯度透析（6 mol/L尿素→4 mol/L尿素→2 mol/L尿素→1×PBS），再置于10 kD的濃縮管中進行蛋白濃縮，收集濃縮后的蛋白液以作免疫用抗原。為進一步檢測其抗原特異性，采用HCMV陽性TORCH孕婦血清為一抗進行Western blot檢測。

1.2.4 UL135蛋白多克隆抗體的制備：將8只（2.5± 0.2）kg的新西蘭大白兔隨機分為UL135免疫組6只和PBS對照組2只。首次免疫兔時，將200 μg純化的重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化后，腹部皮下多點注射；此后第2、第4、第6周免疫抗原與等體積弗氏不完全佐劑乳化再加強免疫。同時，在1、3、5、7周取兔耳緣靜脈血，以ELISA法進行效價檢測，并于第8周兔全身麻醉后進行心臟取血，收集的靜脈血于37 ℃靜置1 h后，1 500×g離心15 min，4 ℃，取上清并進行分裝，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 UL135多克隆抗體檢測：①效價的檢測∶以純化的重組UL135蛋白包被ELISA板，4 ℃包被16 h，PBST洗滌3次后，在37 ℃下脫脂牛奶封閉2 h；以不同倍比稀釋后的免疫兔血清為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗；用酶標(biāo)儀檢測A450值。所有血清標(biāo)本均重復(fù)3孔檢測，并設(shè)PBS對照組作為陰性對照。血清倍比稀釋度分別設(shè)置為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800。②特異性的檢測：取純化的UL135蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，以制備的兔抗UL135血清為一抗（1∶5 000稀釋）進行Western blot分析。

2 結(jié)果

圖1 pET21a（+）/HCMV UL135重組質(zhì)粒圖及雙酶切、PCR鑒定結(jié)果

圖2 UL135蛋白超聲后的富集情況圖

2.1 pET21a（+）/UL135重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET21a（+）/UL135經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切后，電泳鑒定酶切片段，可見879 bp的重組目的片段。且對克隆成功的重組質(zhì)粒進行測序，經(jīng)BLAST比對，顯示質(zhì)粒構(gòu)建正確。以重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增，在124 bp處可見一條清晰的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。且測序結(jié)果證實，PCR擴增產(chǎn)物與全基因合成的UL135序列完全匹配，見圖1。

2.2 UL135重組蛋白的純化 收集的細(xì)菌經(jīng)超聲離心后，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE以及Western blot分析（以His標(biāo)簽為一抗），均提示UL135蛋白成功表達，見圖2。取IPTG誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒菌液，以His標(biāo)簽為一抗進行Western blot分析，結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量為31.8 kDa處可見特異性結(jié)合條帶，且終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后蛋白表達量較多；而未誘導(dǎo)的對照組菌液則不出現(xiàn)此條帶，見圖3A。用不同濃度的咪唑洗脫，SDS-PAGE電泳顯示UL135蛋白主要存在于100 mmol/L咪唑洗脫液中，純化后濃度達500～600 ng/μL，見圖4。

2.3 純化蛋白的鑒定 以HCMV（+）的TORCH孕婦血清為一抗，用Western blot法分析純化后UL135蛋白的特異性，可見純化后重組蛋白單一的特異性結(jié)合條帶，見圖3B。

2.4 多克隆抗體的檢測結(jié)果

2.4.1 效價的檢測：收集第7周免疫兔血清抗體標(biāo)本進行效價檢測，并按梯度設(shè)置血清倍比稀釋度。反應(yīng)結(jié)果置于BioElx800酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光值，所有血清標(biāo)本均設(shè)3個復(fù)孔，取平均值，并以PBS對照組作為陰性對照，間接ELISA法檢測結(jié)果顯示兔抗UL135蛋白的效價可高達1∶12 800，見圖5A。

2.4.2 特異性的檢測：以免疫后第8周抗UL135的血清為一抗進行Western blot分析，結(jié)果顯示與預(yù)期的分子質(zhì)量大小相符，且與標(biāo)簽蛋白His抗體作為一抗的Western blot檢測結(jié)果一致，證實兔抗UL135多克隆抗體具有良好的特異性，見圖5B。

圖3 pET21a（+）/HCMV UL135重組蛋白的Western blot分析圖

圖4 UL135蛋白純化圖

圖5 多克隆抗體的效價以及特異性檢測

3 討論

HCMV感染多表現(xiàn)為無癥狀或潛伏感染，此時人體可不表現(xiàn)臨床癥狀而導(dǎo)致難以明確診斷；但當(dāng)機體免疫功能低下時，HCMV可被激活而導(dǎo)致HCMV相關(guān)肺炎、肝炎、全身播散性感染甚至是死亡等[10]。根據(jù)相關(guān)報道，中國育齡期婦女TORCH感染率在3%～8%，孕期感染可致流產(chǎn)、死胎或者出生缺陷[11]；即使幸存，HCMV的先天感染及嬰兒期感染可引起患兒神經(jīng)或者消化系統(tǒng)疾病或畸形[12]。為了提高人口素質(zhì)，TORCH宮內(nèi)感染相關(guān)HCMV的檢測是優(yōu)生的一個重大課題。PCR技術(shù)是檢測HCMV感染最為靈敏、快速的實用方法[13]，但是目前PCR檢測技術(shù)的主要問題是一般實驗室很難做到嚴(yán)格的質(zhì)量控制而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，因此，我們需探索更為可靠的HCMV檢測手段。

HCMV感染的致病機制尚不清楚，但UL/b’區(qū)基因多態(tài)性的研究揭示此基因結(jié)構(gòu)是HCMV致病性的遺傳基礎(chǔ)，在高毒性HCMV株中起主要的致病作用，并且?guī)椭鶫CMV逃避自然殺傷細(xì)胞攻擊[14-15]。因此，可以推斷UL/b’區(qū)19個基因在病毒的復(fù)制、潛伏以及對機體的致病性方面起重要作用，而且能影響宿主的多種免疫調(diào)節(jié)機制[16-18]。其中，UL135是UL/b’區(qū)中除UL141和UL142外主要起免疫逃避作用的基因，而且是唯一一個能幫助逃避自然殺傷細(xì)胞以及T細(xì)胞攻擊的基因，此外，pUL135還能增加HCMV的毒性[9]。因此針對UL135的生物學(xué)功能及其作用機制進行深入探索具有重要意義。然而目前市面上尚未見針對UL135蛋白的特異性抗體，阻礙了UL135的深入研究，因此本研究致力于制備兔多克隆抗體來填補這項空白。

本研究首先利用EXPASY等軟件對UL135二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示跨膜區(qū)范圍為1～26氨基酸，以Human herpesvirus 5 strain Merlin作為序列設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)株，除去UL135蛋白跨膜區(qū)26個氨基酸對應(yīng)的前78個堿基。對UL135基因序列密碼子優(yōu)化后進行全基因組合成，并且以此為模板，利用pET21a（+）原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21（DE3）中成功制備了UL135蛋白。而且pET21a（+）含有較強的T7啟動子、終止子和抗氨芐青霉素基因，是蛋白表達、鑒定、純化的有效工具。在設(shè)計上利用NdeI和XhoI限制酶對目的片段以及質(zhì)粒進行雙酶切，此酶切位點不存在于UL135目的基因中，且NdeI和XhoI有相同的酶切溫度，避免進行二次酶切而損耗目的基因以及載體。機體感染HCMV可產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫，從而激活機體產(chǎn)生血清抗HCMV IgG抗體。本課題組陳文靜等[19]將制備的UL138蛋白與臨床上使用的羅氏HCMV CLIA法進行比較，證實UL138蛋白可成為HCMV感染血清學(xué)檢測的一種新的候選抗原。UL135蛋白在大部分位點均高度保守，本研究制備的UL135蛋白純度可達90%以上，且UL135蛋白具有良好的特異性和較強的免疫反應(yīng)性，因此，我們猜想UL135蛋白是否也可作為妊娠期TORCH患者HCMV感染的候選抗原，以檢測母體中或者羊水中HCMV抗體的變化來判斷有無宮內(nèi)感染。但是我們?nèi)孕鑼L135原核表達蛋白進行優(yōu)化，并增加待檢血清數(shù)量，或引入確診HCMV陰性樣本量，并引進其他病毒感染的TORCH孕婦血清為一抗判斷有無交叉反應(yīng)，以進一步評估UL135蛋白用于HCMV血清學(xué)檢測的敏感性和特異性。

本研究完成pET21a（+）/HCMV UL135原核表達載體的構(gòu)建并成功表達、純化UL135蛋白及制備高效價兔抗多克隆抗體。該抗體成本低、來源方便，并可特異性識別天然的UL135蛋白，可用于HCMV的檢測及針對UL135蛋白的免疫學(xué)實驗。

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（本文編輯：吳彬）

Prokaryotic expression of UL135 protein of human cytomegalovirus and its preparation and identi fi cation

of polyclonal antibody

HU Yingying1, GUO Gangqiang2, YE Sisi2, SUN Xiangwei3, MAO Chenchen3, XUE

Xiangyang2, LYU Jieqiang1. 1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Microbiology and Immunology, Institute of Molecular Virology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Department of General Surgery, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To construct a prokaryotic expression vector expressing UL135 protein of human cytomegalovirus (HCMV) and prepare a UL135 speci fi c polyclonal antibody. Methods: Bioinformatics methods were used to analyze the transmembrane domain of UL135 protein, and then the cytoplasmic domain synthesized by fully-synthetic gene was cloned into vector pET21a (+) after the prokaryotic codon optimization. The pET21a (+)/UL135 recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and then induced by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). To prepare speci fi c polyclonal antibody, New Zealand rabbits were immunized by the UL135 recombinant protein which was puri fi ed by Ni-NTA af fi nity chromatography primarily. The sensitivity and the speci fi city of the antibody were determined by ELISA and Western blot assays. Results: HCMV UL135 protein was successfully expressed in prokaryotic system and highly puri fi ed target protein was obtained through Ni-NTA af fi nity chromatography. New Zealand rabbits could generate speci fi c polyclonal IgG antibody after immunized. ELASE and Western blot analysis determined that the preparative polyclonal IgG antibody could speci fi cally identify the UL135 protein. Conclusion: HCMV UL135 protein is successfully expressed in prokaryotic expression system, and anti-UL135 rabbit polyclonal antibody is successfully prepared for the further research.

human cytomegalovirus; UL135 protein; polyclonal antibody

R373.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.005

2016-10-25

國家自然科學(xué)基金資助項目（81472308）。

胡盈盈（1992-），女，浙江永嘉人，碩士生。

呂杰強，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jieqianglu@ 126.com。