腦梗死患者凝血因子Ⅻ Exon1-46C/T基因多態(tài)性

徐琦煜，金艷慧，劉媚娜，劉歡樂，王明山

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

腦梗死患者凝血因子Ⅻ Exon1-46C/T基因多態(tài)性

徐琦煜，金艷慧，劉媚娜，劉歡樂，王明山

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

目的：探討凝血因子X II（FX II）基因Exon1-46C/T多態(tài)性與腦梗死的相關性及對機體纖溶功能的影響。方法：采用直接測序法測定腦梗死組（60例）與正常對照組（60例）的FX II基因46C/T多態(tài)性，同時采用自動血凝儀測定FX II活性（FX II∶C）、纖溶酶原活性（PLG∶A）、纖維蛋白原（FIB）及D-二聚體（D-D）含量等指標。結果：腦梗死組比正常對照組中46TT明顯升高，且2組間多態(tài)性分布比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。通過基因型單因素分析，腦梗死患者中T等位基因危險性是C等位基因的1.865倍，TT基因型危險性為結合（CC+CT）基因型的3.021倍。與正常對照組比較，腦梗死組46TT基因型FX II∶C明顯下降，D-D含量升高，PLG∶A下降（P＜0.05），但腦梗死患者FX II多態(tài)性各型之間的D-D指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：FX II基因46TT多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生有關聯(lián)，其可導致FX II活性明顯下降，致使機體的纖溶功能受影響。

腦梗死；凝血因子X II；多態(tài)性；纖溶功能

腦血管病是當前嚴重危害人類生命與健康的常見病，是中老年人致死、致殘的主要原因之一，其中腦梗死約占2/3。腦梗死是一種多基因病[1]，其發(fā)病在一定程度上受各種相關基因間及基因與環(huán)境間相互作用的影響[2]。目前已發(fā)現(xiàn)與腦梗死相關的基因多態(tài)性有20余種，由凝血相關因子基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）引起的功能變化與腦梗死有密切關系[3]。其中凝血因子X II（FX II）不僅是內(nèi)源性凝血途徑的啟動因子，同時也參與纖溶途徑的激活[4]。在FX II基因啟動子區(qū)第46位核苷酸存在一個常見的多態(tài)性C→T（FX II46C→T），可引起FX II活性的降低或缺失而不能有效激活纖溶系統(tǒng)[5]。本研究通過檢測腦梗死患者FX II基因多態(tài)性及凝血、纖溶功能指標變化，初步探討FX II基因46C/T多態(tài)性對腦梗死發(fā)病的影響及其機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年8月至2015年12月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診的腦梗死患者60例（腦梗死組），其中男45例，女15例，年齡31～92歲，平均（62.9±13.3）歲，診斷符合全國第四屆腦血管學術會議（1995）通過的腦梗死診斷標準，均經(jīng)頭顱CT或MRI檢查確診為腦梗死，患者發(fā)病24 h內(nèi)，均為首次發(fā)病，入院前及采集血液標本前均未使用任何抗凝、溶栓等有關藥物，且無合并深靜脈血栓等，并排除肝臟疾病。正常對照組60例，其中男40例，女20例，年齡26～78歲，平均（59.2±12.6）歲，均為同期健康體檢者，無心腦血管及肝臟疾病，無高血壓、糖尿病及血栓性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及DNA抽提：采集腦梗死組及正常對照組足量靜脈血于含0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管中，顛倒混勻后3 000 r/min離心10 min，得乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）。下層血細胞用于基因抽提?；蚪MDNA提取試劑盒購自上海荻碩貝肯生物科技有限公司。

1.2.2 血漿凝血纖溶指標的檢測：采用凝固法檢測FX II活性（FX II∶C）和纖維蛋白原（FIB）含量、發(fā)色底物法檢測纖溶酶原活性（PLG∶A）、免疫比濁法檢測D-二聚體（D-D）含量，各指標檢測均在法國Stago-STA自動血凝儀上進行（配套試劑由法國Stago公司提供），所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.3 FX II基因第46位多態(tài)性直接測序：用上述DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，根據(jù)FX II基因序列（GenBank AF538691），應用primer5軟件設計覆蓋FX II基因啟動區(qū)第46位堿基的1+2外顯子區(qū)域及其側翼序列的引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游：5’-AGGGCAGCTTGACCAATC-3’，下游：5’-GAGGAGCCAGGCCACTTA-3’。PCR試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，PCR擴增如下：95 ℃預變性5 min，后95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物原液送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用方差分析。各組間基因多態(tài)性頻數(shù)分布分析及比較采用χ2檢驗，并計算OR值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組FX II基因多態(tài)性分布及相對危險度分析 腦梗死組中男45例，女15例，其中男性46T/T、C/T、C/C分別為23例、18例、3例；女性分別為11例、2例、2例，其基因型性別分布無顯著性差異。腦梗死組與正常對照組FX II基因Exon1-46TT、CT、CC型分布頻率，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.448，P＜0.05），且腦梗死組的46TT多態(tài)性高于正常對照組，基因頻率分布符合Hardy-weinberg平衡定律（χ2= 0.291，P＞0.05）。通過基因型單因素分析，腦梗死組與正常對照組C、T等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.929，P＜0.05，OR=1.865），即T等位基因危險性是C等位基因的1.865倍。因CC基因型例數(shù)較少，TT基因型與結合（CC+CT）基因型比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.620，P＜0.05，OR=3.021），TT基因型危險性為結合（CC+CT）基因型的3.021倍，見表1。

表1 腦梗死組與正常對照組FXII基因46C/T多態(tài)性頻數(shù)分布及分析[ n（%）]

2.2 腦梗死組患者FXII多態(tài)性對纖溶功能的影響

腦梗死組46TT型FX II∶C明顯低于46CT型、46CC型及正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），46CT型FX II∶C低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且46TT型與46CT型、46CC型間FX II∶C比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。腦梗死組46TT型的PLG∶A含量低于正常對照組及46CC型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且46TT型的D-D含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在46CT型和46CC型的腦梗死組中D-D含量也高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但腦梗死組的FX II基因多態(tài)性各型之間D-D差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。腦梗死組FXII基因多態(tài)性各型組及正常對照組之間的FIB差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

腦梗死是指因腦部血液供應障礙、缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化。腦梗死作為一種突發(fā)性腦部疾病可發(fā)生于任何年齡段。FX II是機體內(nèi)源性凝血途徑的啟動因子，同時也是纖溶系統(tǒng)的激活物。在FX II基因Exon1-46位存在C→T置換，形成46C/T基因多態(tài)性位點，因而在人群中可存在3種基因型：46CC、46CT、46TT。這個多態(tài)性位點出現(xiàn)在5’端非翻譯區(qū)、ATG起始密碼子的上游4個堿基處，當C被T替換后，產(chǎn)生了一個新的ATG起始密碼子，因此，F(xiàn)X II基因Exon46C→T置換導致了翻譯效率的下降。即便在FX II46T基因中產(chǎn)生新的起始密碼子，原始的起始密碼子依然可以識別進行翻譯，只不過產(chǎn)生FX II的量與FX II46C基因相比可能要降低[6]，因此，此基因多態(tài)性使FX II血漿水平下降，而FX II血漿水平是血栓形成的關聯(lián)性表型及危險因素[7]。

表2 腦梗死患者FX II基因多態(tài)性對纖溶功能的影響及比較（）

表2 腦梗死患者FX II基因多態(tài)性對纖溶功能的影響及比較（）

與正常對照組比：aP＜0.05；與46CT型比：bP＜0.05；與46CC型比：cP＜0.05

組別 例數(shù) FX II∶C（%） FIB（g/L） D-D（mg/L） PLG∶A（%）正常對照組 60 99.2±22.5 3.00±0.50 0.20±0.11 116.2±13.1腦梗死組46TT 35 56.4±15.9abc3.22±0.71 1.15±1.13a94.3±18.4ac46CT 20 71.3±15.3a3.19±0.51 1.01±0.44a100.5±12.6 46CC 5 81.3±18.9 3.60±1.10 0.88±0.65a110.6±14.2

國內(nèi)外對腦梗死患者與FX II基因多態(tài)性研究有較多報道，但是結論各不相同，仍存在著爭議。其中張玲等[8]認為46CC可能是腦血栓形成的危險因素，而本研究結果顯示，TT型在腦梗死患者中比例更高，而且46TT型的FX II∶C明顯低于46CT、46CC型及正常對照組，因此腦梗死患者的FX II∶C更低，增加了血栓形成的危險。同樣基因型單因素分析顯示，T等位基因危險性是C等位基因的1.865倍，即OR=1.865，差異有統(tǒng)計學意義。也有研究[9]認為，因46CC基因型例數(shù)較少，可以將46TT基因型與結合46（CC+CT）基因型比較，本研究發(fā)現(xiàn)前者危險性為后者的3.021倍，差異有統(tǒng)計學意義。因此本研究認為46TT或T等位基因升高是腦梗死的易感因素。SANTAMARIA等[10]也同樣在西班牙人群中確定了FX II基因T/T基因型與缺血性腦卒中發(fā)病有相關性。而KLEINSCHNITZ等[11]報道FX II缺乏或抑制FX II活性可使實驗小鼠的腦缺血損傷得到改善，F(xiàn)X II對于生理狀態(tài)下的凝血過程并未發(fā)揮作用，只是選擇性地作用于病理狀態(tài)下的血栓形成。

在纖溶系統(tǒng)中，F(xiàn)X II與組織性纖溶酶原激活劑和尿激酶型纖溶酶原激活劑具有同源性的絲氨酸結構，可以直接或間接激活纖溶酶原，生成纖溶酶，以此激活纖溶系統(tǒng)[12]。血管內(nèi)皮受損和血小板在體內(nèi)被活化是動脈血栓形成的主要原因，此時也會產(chǎn)生少許的纖維蛋白黏附在血管壁上，如機體纖溶功能正常，就會及時清除這些纖維蛋白，使其不至于導致血栓形成。本研究腦梗死組46TT型FX II∶C明顯降低，致使機體的纖溶功能不能正常發(fā)揮，因此更易導致血栓形成。腦梗死組46TT型的PLG∶A含量低于正常對照組及46CC型，進一步顯示了FX II∶C與纖溶功能有關聯(lián)，其機理有待進一步探討。FIB為凝血的基礎物質(zhì)，其水平增高提示體內(nèi)凝血功能增強，易導致靜脈血栓形成，本研究腦梗死患者FX II基因多態(tài)性各基因型及正常對照組之間的FIB差異無統(tǒng)計學意義，說明在本研究中FIB不是動脈血栓形成的主要因素。病理狀態(tài)下，機體發(fā)生凝血時，凝血酶作用于纖維蛋白，轉變?yōu)榻宦?lián)纖維蛋白，同時纖溶系統(tǒng)被激活，降解纖維蛋白形成各種碎片，γ鏈能把2個含D片段的碎片連接起來形成D-D。D-D水平的上升反映了體內(nèi)存在著凝血和纖溶活性增強的重要分子標志物，因此它既可反映體內(nèi)存在著血栓或血栓繼續(xù)形成的狀況，又可反映體內(nèi)繼發(fā)性纖溶活性增強。通常腦梗死屬于動脈血栓形成或栓塞，而動脈血栓主要是白色血栓，因此D-D水平變化的敏感性不如靜脈血栓形成性疾病。本研究結果顯示，在腦梗死組中46TT、46CT、46CC 3種基因型中D-D的含量均高于正常對照組，但3組之間差異無統(tǒng)計學意義，表明在腦梗死患者中均存在繼發(fā)性纖溶活性的增強，而反映不出與FX II基因多態(tài)性有關聯(lián)。

綜上所述，F(xiàn)X II基因46TT多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生有關聯(lián)，其可導致FX II活性明顯下降，致使機體的纖溶功能受影響。

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（本文編輯：吳彬）

Research of factor XII gene Exon1-46C/T polymorphism in cerebral infarction patients

XU Qiyu, JIN

Yanhui, LIU Meina, LIU Huanle, WANG Mingshan.
Laboratory Medicine Center, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the correlation and fi brinolysis in fl uence of factor XII gene (FXII) polymorphism on the patients with cerebral infarction. Methods: Direct sequencing was used to analyze the 46 polymorphism at promoter regions in factor XII gene among cerebral infarction patients and healthy controls. Meanwhile, the activity of plasma factor XII (FXII:C), fi brinogen (FIB), D-dimer (D-D) and the activity of plasminogen (PLG:A) were measured. Results: The rate of 46TT of factor XII gene (FXII) polymorphism in patients with cerebral infarction was higher than that in healthy controls, and the differences on the distribution were statistically signi fi cant (P＜0.05). By analysis of genotype single factor, the risk of T genotype was higher 1.865 times than that of C genetype and the risk of TT genotype was higher 3.021 times than that of (CC+CT) unite genotype in the cerebral infarction patients. Compared with the healthy controls, the FXII:C and PLG:A were obviously lower and D-D were higher in 46TT group (P＜0.05), and there were no differences of D-D in these groups. Conclusion: The FXII gene 46TT polymorphism is obviously increased in patients with cerebral infarction, and it can lead to evidently decreased the activity of FXII, then affects the body’s fi brinolysis.

cerebral infarction; factor XII; polymorphism; fi brinolysis

R743.33

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.013

2016-05-17

溫州市科技計劃項目（Y20150306）。

徐琦煜（1984-），女，浙江溫州人，主管技師。