微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

呂可君

（永康市第一人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321300）

微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

呂可君

（永康市第一人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321300）

目的：觀察乳腺癌組織中微淋巴管和微血管的分布情況及其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法：選取60例乳腺癌患者作為病例組，按年齡匹配選取60例乳腺增生性疾病患者作為對(duì)照組。采用D2-40、CD34分別標(biāo)記2組患者組織標(biāo)本的微淋巴管和微血管后進(jìn)行密度計(jì)數(shù)，對(duì)微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：病例組微淋巴管密度平均值為5.32±3.81，微血管密度平均值為65.34±24.18。病例組D2-40蛋白表達(dá)水平和CD34蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），與腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），乳腺癌組織中微淋巴管密度與微血管密度成正相關(guān)（r=0.684，P＜0.05），微淋巴管高密度組和低密度組之間、微血管高密度組和低密度組之間患者的生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性，與乳腺癌復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

微血管；微淋巴管；乳腺腫瘤；臨床病理特征

乳腺癌是最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，近年發(fā)病呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者健康和生命。隨著乳腺癌基礎(chǔ)與臨床研究的不斷深入，乳腺癌治療取得很大進(jìn)步，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是造成乳腺癌患者死亡的主要原因，也是當(dāng)今乳腺癌的研究熱點(diǎn)。血管和淋巴管生成在癌組織的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起了極其重要的作用，但癌細(xì)胞如何通過(guò)微淋巴管和微血管轉(zhuǎn)移還存在爭(zhēng)議[1-2]。癌細(xì)胞是通過(guò)已經(jīng)存在的血管和淋巴管還是新生成的血管和淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移，癌病灶內(nèi)還是癌病灶周圍的血管和淋巴管對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生影響目前尚未明確[3-4]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)癌組織中微淋巴管密度（D2-40標(biāo)記）和微血管密度（CD34標(biāo)記），探討乳腺癌組織中微淋巴管和微血管分布情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2012年12月在本院住院治療的乳腺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為乳腺癌，所有患者均接受手術(shù)治療，術(shù)前未進(jìn)行抗癌治療，預(yù)計(jì)生存期大于6個(gè)月；②患者簽署知情同意書，自愿參加，依從性較好，能接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前接受過(guò)手術(shù)治療、抗癌治療等；②拒絕隨訪者。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共60例，年齡31～60歲，中位年齡48.6歲，平均年齡（49.2±14.2）歲。臨床分期：I期8例， II期32例，III期14例，IV期6例。按年齡匹配在本院選60例行手術(shù)治療的乳腺增生性疾病患者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 微血管密度和微淋巴管密度檢測(cè)：采用D2-40、CD34分別標(biāo)記2組患者組織標(biāo)本的微淋巴管和微血管，免疫組織化學(xué)Elivision TM plus二步法[5]檢測(cè)病例組乳腺癌組織和對(duì)照組增生組織中的D2-40蛋白、CD34蛋白和微血管計(jì)數(shù)、微淋巴管計(jì)數(shù)。Elivision TM plus二步法檢測(cè)試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。DAB顯色試劑購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。2組患者手術(shù)標(biāo)本均使用4%甲醛進(jìn)行固定并脫水，使用石蠟包埋方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行切片。具體操作按照試劑盒附帶的實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行。使用已知的CD34蛋白陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判斷：①微血管密度：采用Weidner方法計(jì)數(shù)CD34蛋白標(biāo)記，即先在40倍鏡下選擇高血管密度區(qū)（熱點(diǎn)區(qū)）計(jì)數(shù)，然后在200倍視野下計(jì)數(shù)被染成棕黃色的血管數(shù)目。②微淋巴管密度：采用Weidner法計(jì)數(shù)D2-40蛋白標(biāo)記，先在低倍鏡下尋找新生脈管最密集的區(qū)域，然后在高倍鏡下對(duì)微淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，在腫瘤組織內(nèi)以5個(gè)高倍鏡視野脈管的平均數(shù)表示微淋巴管密度。

1.2.3 隨訪：由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的隨訪員通過(guò)電話、定期回院復(fù)查等途徑進(jìn)行隨訪，以患者手術(shù)日為隨訪起點(diǎn)，每位患者隨訪3年，隨訪截止時(shí)間為2015年12月31日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，微淋巴管密度與微血管密度的關(guān)系采用pearson相關(guān)性分析。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度及CD34標(biāo)記的微血管密度 D2-40標(biāo)記的淋巴管呈一致性的管腔結(jié)構(gòu)，染色呈棕黃色，表現(xiàn)為一層薄壁，管腔內(nèi)很少有淋巴細(xì)胞，無(wú)紅細(xì)胞（見(jiàn)圖1A）。D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度平均值為5.32±3.81，中位數(shù)為4.1，以中位數(shù)為分界值，將微淋巴管密度≥4.1定義為高密度組，＜4.1為低密度組，其中高密度組34例，低密度組26例。CD34標(biāo)記的微血管可見(jiàn)染色清晰的血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色至深褐色彌散性分布，管腔大小不一（見(jiàn)圖1B）。CD34標(biāo)記的微血管密度平均值為65.34±24.18，中位數(shù)為58.74，以中位數(shù)為分界值，將微血管密度≥58.74定義為高密度組，＜58.74的為低密度組，其中高密度組32例，低密度組28例。對(duì)照組D2-40標(biāo)記的淋巴管很少，未見(jiàn)棕黃色染色；CD34標(biāo)記的微血管也較少，基本沒(méi)有棕黃色或褐色染色。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2 2組D2-40和CD34蛋白表達(dá)水平的比較 病例組患者乳腺癌組織中D2-40蛋白表達(dá)水平和CD34蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組增生組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征的關(guān)系 微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），與患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 微淋巴管密度與微血管密度的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析顯示，乳腺癌組織中微淋巴管密度與微血管密度成正相關(guān)（r=0.684，P=0.011）。

2.5 微淋巴管密度和微血管密度與預(yù)后的關(guān)系 微淋巴管高密度組和低密度組之間、微血管高密度組和低密度組之間乳腺癌患者的生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表1 2組D2-40和CD34蛋白表達(dá)水平比較（）

表1 2組D2-40和CD34蛋白表達(dá)水平比較（）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

組別 例數(shù) D2-40 CD34對(duì)照組 60 2.11±0.82 16.84± 4.83病例組 60 5.32±3.81a65.34±24.18a

表2 微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征關(guān)系（）

表2 微淋巴管密度和微血管密度與臨床病理特征關(guān)系（）

項(xiàng)目 例數(shù) 微淋巴管密度 t/F P 微血管密度 t/F P年齡（歲） 0.293 0.769 0.229 0.819＜35 16 5.12±3.64 63.17±24.86≥35 44 5.43±3.58 64.82±24.21腫瘤直徑（cm） 2.312 0.014 3.125 0.004≤2 21 4.48±2.86 61.82±26.44＞2 39 6.68±2.92 65.97±27.28臨床分期 3.867 0.008 2.889 0.012 I 8 3.74±2.63 62.36±21.87 II 14 5.83±2.26 63.98±24.63 IV 6 6.49±2.66 62.17±22.41淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 4.027 ＜0.001 2.036 0.042有25 5.86±2.12 68.79±26.33無(wú)35 3.62±2.13 55.12±24.63 32 5.22±2.18 63.84±23.47 III

表3 微淋巴管密度和微血管密度與預(yù)后的關(guān)系（）

表3 微淋巴管密度和微血管密度與預(yù)后的關(guān)系（）

項(xiàng)目 例數(shù) 生存時(shí)間（月） t P微淋巴管密度 0.337 0.736低密度 26 36.2±2.4高密度 34 36.4±2.1微血管密度 0.920 0.358低密度 28 36.2±2.7高密度 32 36.8±2.3

3 討論

目前乳腺癌治療采用以手術(shù)切除為主的綜合治療，隨著早期篩查的開(kāi)展和診斷技術(shù)的提高，其治療效果得到明顯提升，患者生存期得以延長(zhǎng)，但腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。經(jīng)淋巴管和血管轉(zhuǎn)移是乳腺癌轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)的途徑，乳腺癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不僅影響乳腺癌的臨床分期、治療方案的選擇，而且對(duì)治療效果及預(yù)后有極其重要的預(yù)測(cè)作用[6]。因此，對(duì)淋巴管、血管轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素如微淋巴管及微血管生成的研究已經(jīng)成為近年研究的熱點(diǎn)。新生微淋巴管和微血管在乳腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，通過(guò)檢測(cè)微淋巴管密度和微血管密度可以直接了解腫瘤組織中的微淋巴管和微血管新生的活躍程度[7-8]。D2-40是一種淋巴管內(nèi)皮特異性較高的淋巴管標(biāo)記物，并且較HE染色方法能更敏感和特異地檢測(cè)出腫瘤的微淋巴管浸潤(rùn)[9]。CD34是表達(dá)于正常內(nèi)皮細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，是常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，其特異性及敏感性均高于CD31、V III因子的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，能特異性顯示腫瘤的新生微血管，現(xiàn)已成為研究微血管的成熟標(biāo)志物[10]。本研究通過(guò)D2-40、CD34標(biāo)記乳腺癌患者腫瘤組織中的微淋巴管和微血管，該方法具有成熟、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，病例組患者乳腺癌組織D2-40蛋白表達(dá)水平和CD34蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明乳腺癌組織中微淋巴管密度、微血管密度高于乳腺增生組織，提示微淋巴管和微血管在乳腺癌組織發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]相一致。主要原因分析：乳腺癌組織分泌一些刺激血管及淋巴管生長(zhǎng)的因子，刺激乳腺癌組織的微血管和微淋巴管生成，以滿足乳腺癌組織的營(yíng)養(yǎng)供給，促進(jìn)乳腺癌組織的生長(zhǎng)。魏曉龍等[13]研究報(bào)道，乳腺癌患者微血管密度與乳腺癌的大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，而與乳腺癌患者年齡、組織學(xué)分級(jí)等無(wú)關(guān)。沈葉等[14]研究報(bào)道，乳腺癌患者微血管密度與乳腺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、侵襲力等有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌患者年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致，進(jìn)一步證實(shí)了微淋巴管密度和微血管密度與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。主要原因分析：腫瘤能迅速生長(zhǎng)取決于腫瘤組織血管、淋巴管的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，腫瘤直徑大，癌組織需要的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)多，刺激了微淋巴管密度和微血管密度增高，以滿足營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸。不同的臨床分期說(shuō)明了腫瘤的惡性程度，惡性程度越高說(shuō)明腫瘤組織生長(zhǎng)越活躍，需要營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)越多，在各種因子刺激下微淋巴管和微血管形成更多。癌細(xì)胞主要通過(guò)淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移，癌組織發(fā)生轉(zhuǎn)移，說(shuō)明癌組織生長(zhǎng)迅速，需要更多的淋巴管和血管參與。微淋巴管密度和微血管密度與預(yù)后生存期無(wú)關(guān)，可能是乳腺癌患者生存期隨著診療技術(shù)水平的提高已有顯著提高，在較短的隨訪時(shí)間內(nèi)，高低密度組患者生存可能無(wú)顯著差異[15-16]，應(yīng)繼續(xù)延長(zhǎng)隨訪時(shí)間。

綜上所述，微淋巴管密度和微血管密度與與乳腺癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性。研究乳腺癌組織血管及淋巴管生成，有助于了解乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為以乳腺癌血管或淋巴管作為靶點(diǎn)的抗乳腺癌治療提供理論基礎(chǔ)，通過(guò)抑制和阻斷血管及淋巴管生成途徑，控制乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

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（本文編輯：趙翠翠）

Relationship between microvascular density, micro lymphatic vessel density and clinicopathological char-acteristics of breast cancer

LYU Kejun. Department of Pathology, the First People’s Hospital of Yongkang,

Jinhua, 321300

Objective: To detect the expressions of microvascular density (MVD) and micro lymphatic vessel density (LVD) in breast cancer tissues, investgate the relationship between MVD, LVD and clinical pathological features of breast cancer. Methods: A total of 60 cases of breast cancer patients were selected as the patients group, and 60 cases of proliferative diseases of mammary gland patients were selected as the control group. By adopting D2-40 marker of lymphatic endothelial cells and CD34 marker of vascular endothelial cells, breast cancer MVD and LVD were counted separately under a microscope. The relationship between expressions of MVD, LVD and clinical pathological features also were analyzed the relationship between expressions of MVD, LVD of breast cancer patients. Results: In the patients group, the average value of LVD was (5.32±3.81), and the average MVD was (65.34±24.18). The protein expression level of D2-40 and CD34 in the patients group was signi fi cantly higher than that of the control group (P＜0.05), there is no correction of patients’ age with LVD and MVD (P＞0.05), there was correction of tumor size, clinical stage, lymph node metastasis with LVD and MVD (P＜0.05), and MVD and LVD were positively correlated (r=0.684, P＜0.05). There was no signi fi cant difference in survival time between higher LVD group and lower LVD group, higher MVD group and lower MVD group (P＞0.05). Conclusion: LVD and MVD are closely related with tumor diameter, clinical stage and lymph node metastasis in breast cancer patients, and no signi fi cant correlation with prognosis, which was closely related to breast cancer recurrence and distant metastasis.

microvessel; micro lymphatic vessel; breast neoplasms; clinical pathological characteristics

R737.9

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.014

2016-07-20

呂可君（1977-），女，浙江永康人，主治醫(yī)師。