胞外組蛋白對腎小管細胞的損傷作用及其機制

朱奇凡，王德選，陳新新，莊捷秋，蔡暉

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

胞外組蛋白對腎小管細胞的損傷作用及其機制

朱奇凡，王德選，陳新新，莊捷秋，蔡暉

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：探討細胞外組蛋白對腎小管細胞的損傷作用及其相關機制。方法：觀察不同濃度（0、50、100、200 μg/mL）組蛋白對腎小管細胞（Cos-7細胞）活性的影響；在100 μg/mL濃度的組蛋白作用0、12、24、48 h時分別收集Cos-7細胞，用Western blot法檢測T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白-1（TIM1）、天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）和受體蛋白Toll樣受體2（TLR-2）表達的變化。結(jié)果：隨著組蛋白藥物濃度的增加，Cos-7細胞活性呈下降趨勢；100 μg/mL組蛋白作用于細胞，隨著作用時間的延長，細胞TIM1、caspase3、TLR-2的表達量均顯著升高。結(jié)論：胞外組蛋白對腎小管細胞存在損傷作用，其機制可能是通過TLR-2信號通路誘導腎小管細胞凋亡。

細胞外組蛋白；凋亡；TLR-2信號通路；腎小管

組蛋白是構(gòu)成細胞核染色質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)基礎并參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。應激狀態(tài)下，組蛋白可主動或被動地釋放到細胞外成為胞外組蛋白，通過下游途徑發(fā)揮其細胞毒性，對全身各器官系統(tǒng)造成損傷[1]。ALLAM等[2]對缺血再灌注誘導的小鼠急性腎損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞受損死亡時可釋放細胞外組蛋白，后者對腎血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞有直接毒性作用。臨床上許多病理狀態(tài)，例如膿毒血癥、自身免疫性疾病、外傷等，可表現(xiàn)急性腎損傷或永久性腎功能異常，同時血液中細胞外組蛋白濃度可明顯升高[3]，提示組蛋白可能參與腎損傷有關的病理過程。故本研究進一步在細胞學水平探討胞外組蛋白對腎臟的損傷作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 非洲綠猴腎小管細胞（Cos-7）購自中國科學院上海細胞庫。組蛋白（human histone 3）購自美國Sigma公司，CCK-8分析試劑盒購自日本同仁化學研究所，單克隆兔抗T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白-1（T-cell immunoglobulin and mucindomain-containing molecules-1，TIM1）抗體和單克隆兔抗受體蛋白Toll樣受體2（Toll-like receptor-2，TLR-2）抗體購自美國Abcam公司，單克隆兔抗天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3（cysteineaspartate-specific protease 3，caspase3）抗體購自美國Cell Signal Technology公司，單克隆小鼠抗Tubulin抗體購自美國Beyotime公司，HRP標記山羊抗小鼠二抗和HRP標記山羊抗兔二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 不同濃度組蛋白對Cos-7細胞活性的影響

1.2.1 細胞培養(yǎng)：Cos-7細胞接種于培養(yǎng)皿中，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。每2 d更換培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法測定細胞活性：對數(shù)生長期Cos-7細胞，以4×104個細胞/每孔的密度重新接種于96孔板，培養(yǎng)12 h細胞貼壁生長后，分別換成含0（等量0.9%氯化鈉溶液）、50、100、200 μg/mL濃度組蛋白的DMEM培養(yǎng)液，在組蛋白作用后0、12、24和48 h（每個時間點設5個復孔），每孔加入等量CCK-8溶液，不含細胞的孔作為空白對照。在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h（避光）。使用酶標儀測定每孔的吸光度值（OD值），測定波長為450 nm。細胞活力（%）= [A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]× 100。A（加藥）：加有CCK-8溶液、細胞和藥物溶液的孔的吸光度。A（空白）：加有CCK-8溶液和培養(yǎng)基而沒有細胞的孔的吸光度。A（0加藥）：沒有藥物溶液，但加有細胞、CCK-8溶液的孔的吸光度。

1.3 組蛋白干預下Cos-7細胞形態(tài)學變化 取1× 104Cos-7細胞懸液分別接種于2盤6 cm培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)12 h使細胞貼壁生長，再換成含組蛋白濃度為0（對照組）、100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液孵育細胞。干預12、24、48 h，在光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.4 Western blot測定細胞外組蛋白對Cos-7細胞凋亡蛋白及相關信號通路蛋白的影響 取1×104Cos-7細胞懸液分別接種于5盤6 cm培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)12 h，接著用含100 μg/mL組蛋白的DMEM培養(yǎng)液孵育細胞，分別在0、12、24、48 h時收集細胞。預冷PBS溶液洗滌細胞3次，轉(zhuǎn)入EP管，加入RIPA細胞裂解液。置于冰上裂解30 min。12 000 r/min 4 ℃離心20 min，吸取上清液至另一離心管。取20 μL用作蛋白定量檢測，其余蛋白作變性處理。方法如下：用80 ℃水浴預熱1份5×Loading Buffer后，與4份蛋白樣品充分混勻，將混合物于37 ℃水浴30 min，以變性蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳時，每孔加入40 μg蛋白樣品。濃縮膠電壓設定為80 mV，分離膠電壓升至120 mV。冰浴下100 V恒壓半干式轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），根據(jù)蛋白分子量不同，轉(zhuǎn)膜時間50 min到90 min不等。依次孵育一抗（單克隆兔抗TIM1抗體1∶1 000；單克隆兔抗TLR-2抗體1∶1 000；單克隆兔抗caspase3抗體1∶1 000；單克隆小鼠抗Tubulin抗體3∶8 000，4 ℃搖床孵育過夜）、二抗（HRP標記山羊抗小鼠二抗1∶7 000；HRP標記山羊抗兔二抗1∶7 000，水平搖床上室溫孵育90 min），ECL顯色。根據(jù)蛋白不同選擇相應的曝光時間，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)對目的條帶的分子量和凈光密度值進行分析。以上所有實驗重復4次。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0。定量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；多重比較，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗；兩因素的分析采用析因分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測不同濃度組蛋白對Cos-7細胞活性的影響 結(jié)果顯示，對照組（0 μg/mL組）等量0.9%氯化鈉溶液干預0～48 h，細胞活性變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；其他各組Cos-7細胞活性隨著組蛋白藥物濃度的增加而下降，同時隨著組蛋白作用時間的延長，細胞活性也呈下降趨勢。其中組蛋白100 μg/mL或200 μg/mL作用12、24、48 h后與同組0 h比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），在48 h時達到最低值（P＜0.01），見表1。

2.2 組蛋白干預下Cos-7細胞形態(tài)學變化 根據(jù)2.1實驗結(jié)果，本研究后續(xù)實驗采用100 μg/mL組蛋白對Cos-7細胞進行干預處理。結(jié)果顯示，對照組Cos-7細胞生長良好，48 h后細胞貼壁緊密，接觸生長后呈多邊形。100 μg/mL組蛋白干預組在12 h即發(fā)生明顯形態(tài)改變，分泌物增多，24 h后細胞形態(tài)變化更為明顯，細胞內(nèi)空泡較多，細胞體積縮小，不易貼壁，48 h細胞凋亡增多，部分細胞聚集成團，無法貼壁，漂浮于培養(yǎng)液中（見圖1）。

2.3 組蛋白不同作用時間對Cos-7細胞TIM1、caspase3、TLR-2表達量的影響 結(jié)果顯示，100 μg/mL組蛋白干預Cos-7細胞后，與組蛋白作用0 h組相比，12 h組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），48 h組的TIM1蛋白表達水平達到最高值（P＜0.05）；與組蛋白作用0 h組相比，隨組蛋白的作用時間延長，活化的caspase3蛋白表達水平緩慢升高，24 h前差異無統(tǒng)計學意義，48 h組活化的caspase3蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；相比于0 h組，24 h組TLR-2蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），48 h組TLR-2蛋白水平達到高峰（P＜0.05），見表2。

表1 不同濃度組蛋白對Cos-7細胞活性的影響（n=3，，%）

表1 不同濃度組蛋白對Cos-7細胞活性的影響（n=3，，%）

與同濃度0 h組比：aP＜0.01；與同時間點0 μg/mL組比：bP＜0.01；交互作用cP＜0.01

組別 0 h 12 h 24 h 48 h F P 0 μg/mL 94.32±2.35 94.52±1.65 91.49±2.02 92.49±1.81 2.764 0.069 50 μg/mL 94.99±2.36 86.06±4.59ab83.68±4.11ab52.32±6.51ab101.457 ＜0.001 100 μg/mL 91.30±1.10 81.32±2.79ab58.83±6.68ab44.00±5.29ab160.520 ＜0.001 200 μg/mL 87.27±4.02b66.75±8.38ab43.78±7.95ab19.02±3.24ab126.658 ＜0.001 F 9.014 31.234 97.961 306.484 F=159.746，P＜0.001cP 0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 細胞外組蛋白對Cos-7細胞形態(tài)的影響（×200）

表2 組蛋白不同作用時間對各指標蛋白表達量的影響（n=4，）

表2 組蛋白不同作用時間對各指標蛋白表達量的影響（n=4，）

與0 h組比：aP＜0.05

組別 TIM1/Tubulin cleaved-caspase3/ t-caspase3 TLR-2/Tubulin 0 h 0.15±0.03 1.80±0.94 0.38±0.02 12 h 0.15±0.05 2.35±0.93 0.42±0.04 24 h 0.19±0.05 2.43±1.09 0.52±0.07a48 h 0.26±0.07a3.68±0.92a0.67±0.05aF 3.913 8.201 28.195 P 0.037 0.049 ＜0.001

3 討論

作為真核生物染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)蛋白的組蛋白一旦釋出即成為胞外組蛋白，也是重要的內(nèi)源性損傷相關分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）分子，具有細胞毒性和免疫刺激作用，從而損傷周圍正常組織[4]?，F(xiàn)有研究證實，胞外組蛋白對肺[5-6]、腎[7]、肝[8-10]均有損傷作用，此外還可能與炎癥[11-12]、腫瘤[13-14]的發(fā)生相關。目前，胞外組蛋白對呼吸、心血管系統(tǒng)等領域的損傷作用研究較多，但對于腎臟的研究較少。

體外和體內(nèi)實驗均證實，當大鼠腎近端小管上皮損傷后，TIM1[又被命名為腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM1）]的胞外域可以從細胞上脫落下來[15]，可溶性的KIM1可以在急性腎小管壞死的患者尿液中檢測到，從而成為近端腎小管損傷的一個敏感而特異的生物指標[16]。本研究顯示隨著組蛋白作用時間的延長，細胞TIM1蛋白表達水平逐漸增加。提示組蛋白可引起腎小管細胞功能受損。

caspase3是細胞凋亡調(diào)控的重要因子，通常以無活性的酶原形式存在，一旦在凋亡信號刺激下被激活，可對多種蛋白底物進行降解，而它的活化則被認為是凋亡進入不可逆階段的標志[17]。組蛋白干預后，我們發(fā)現(xiàn)腎小管細胞caspase3表達量遞增，證實組蛋白啟動了腎小管細胞的凋亡程序。提示在缺血再灌注、膿毒血癥等病理狀態(tài)下，如果胞外組蛋白細胞毒性因素持續(xù)存在，超越機體修復能力，可能影響腎小管的濃縮稀釋功能。

TLR是一類I型跨膜蛋白，胞外有富含亮氨酸的重復序列，其家族在介導細胞內(nèi)信號傳導，識別微生物的病原體相關分子模式，以及先天性免疫過程中都起到了非常重要的作用，其中以TLR-2識別病原體及產(chǎn)物最多，因此被認為是具中心作用的受體[18]。目前，大量的DAMP分子被證實是不同的TLR配體，包括線粒體DNA（TLR-9）、透明質(zhì)酸片段（TLR-2和TLR-4），以及熱休克蛋白（TLR-2和TLR-4）等[19]。而胞外組蛋白是重要的DAMP分子，ALLAM等也提出胞外組蛋白可以與TLR-2和TLR-4相作用，介導髓樣分化蛋白抗原88、核轉(zhuǎn)錄因子-KB和絲裂素活化蛋白激酶信號通路的激活，進而分泌大量的炎性細胞因子[2]。我們的研究結(jié)果表明腎臟固有細胞在組蛋白的作用下出現(xiàn)類似的結(jié)果，即TLR-2蛋白升高，提示TLR-2信號通路參與了組蛋白誘發(fā)的腎小管細胞無菌性炎癥及凋亡。

另外本研究細胞活性檢測和形態(tài)學的觀察證實，胞外組蛋白作用于腎臟細胞后會引起細胞形態(tài)改變，不易貼壁甚至死亡，且隨著胞外組蛋白作用濃度的增加或作用時間的延長，細胞活性均呈下降趨勢，進一步說明胞外組蛋白對腎臟細胞存在損傷作用。此外，結(jié)合腎小管細胞隨著組蛋白作用時間的延長，TIM1、caspase3以及TLR-2蛋白表達量均同步增加，我們推測胞外組蛋白可以通過TLR-2途徑，誘發(fā)caspase3級聯(lián)反應促進腎小管細胞凋亡。但TLR-2介導的下游通路較多，需要進一步探究其中哪條通路在組蛋白引起的腎臟損傷作用中起到主要調(diào)控作用。將來還需要建立動物模型以及收集患者血液標本，進一步驗證胞外組蛋白對腎臟的損傷作用，從而找到防治措施。

綜上所述，本研究在細胞學水平證實了胞外組蛋白對腎臟固有細胞存在損傷作用，TLR-2介導的caspase3凋亡信號通路在其中起到重要作用。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Damage effect of extracellular histones on renal tubular cells and the relating mechanism

ZHU Qifan,

WANG Dexuan, CHEN Xinxin, ZHUANG Jieqiu, CAI Hui. Department of Pediatrics Nephrology, the Second Af fi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the damage effect of extracellular histones on the renal tubular cells (Cos-7 cell) and the relating mechanism. Methods: Cos-7 cells stimulated by different concentration (0, 50, 100, 200 μg/mL) of histones were observed. After treatment with histones (100 μg/mL), Cos-7 cells were collected to detect the expression of T-cell immunoglobulin and mucindomain-containing molecules-1 (TIM1), cysteine aspartate-speci fi c protease 3 (caspase3) and Toll-like receptor-2 (TLR-2) by Western blot at different time points (0, 12, 24, and 48 h). Results: The activity of the Cos-7 cells decreased with the increase of histones concentration. Under the same histones concentration, the expression of TIM1, cleaved-caspase3/t-caspase3 and TLR-2 increased with the stimulation time of the histones. Conclusion: Extracelluar histones induce the kidney injury, and the mechanism may be the induction of renal tubular cell apoptosis through TLR-2 signaling pathway.

extracellular histones; apoptosis; TLR-2 signaling pathway; kidney tubules

R725.7

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.003

2016-12-05

國家自然科學基金青年基金資助項目（81200513）；浙江省自然科學基金資助項目（LY17H050006）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2017KY107）。

朱奇凡（1991-），女，浙江溫州人，碩士生。

蔡暉，教授，主任醫(yī)師，Email：hcai3@emory.edu。