MAGE-A3多克隆抗體的制備及在胃癌細胞檢測中的應(yīng)用

蔡一奇，程開，陳旭東，陳孝冬，岑丹維，張嬋瓊，宋易玲，毛姍姍，葉曉鮮，張麗芳，朱冠保

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 分子病毒與免疫研究所 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325035）

MAGE-A3多克隆抗體的制備及在胃癌細胞檢測中的應(yīng)用

蔡一奇1，程開1，陳旭東1，陳孝冬1，岑丹維2，張嬋瓊2，宋易玲2，毛姍姍2，葉曉鮮2，張麗芳2，朱冠保1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 分子病毒與免疫研究所 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325035）

目的：通過原核表達系統(tǒng)制備人黑色素瘤抗原A3（MAGE-A3）蛋白，制備其多克隆抗體，經(jīng)鑒定后用于胃癌細胞檢測。方法：將MAGE-A3全長核酸序列經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后全基因序列合成，克隆至原核表達載體pET21a（+），構(gòu)建pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達MAGE-A3蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析鑒定；純化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制備多克隆血清抗體，用ELISA、Western blot、免疫熒光技術(shù)分析該多克隆抗體的特異性，并用免疫組織化學技術(shù)鑒定MAGE-A3兔多克隆抗體在人胃癌細胞免疫檢測應(yīng)用中的可行性。結(jié)果：成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21a（+）/MAGE-A3，并經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達MAGE-A3蛋白。SDS-PAGE顯示目的蛋白分子質(zhì)量大小約為48 kDa，與預(yù)期蛋白大小一致，并以His單抗進行Western blot鑒定，出現(xiàn)了特異性的單一條帶。MAGEA3蛋白免疫日本大耳白兔，可誘導兔產(chǎn)生特異性抗體，免疫后第8周達到高峰，經(jīng)Western blot檢測顯示多克隆血清可特異性識別靶蛋白，出現(xiàn)陽性單一條帶；經(jīng)免疫熒光檢測顯示，在MAGE-A3陽性細胞A-375（黑色素瘤細胞株）和SGC-7901細胞（胃癌細胞株）的胞漿內(nèi)出現(xiàn)熒光團塊。表明兔多克隆抗體可特異性識別天然的MAGE-A3蛋白。結(jié)合免疫熒光結(jié)果后經(jīng)ELISA檢測，可認為該多克隆IgG抗體效價可達1∶40 000；免疫組織化學檢測顯示在A-375和SGC-7901腫瘤組織的胞漿內(nèi)出現(xiàn)團塊狀棕黃色顆粒樣沉淀，而在BGC-823腫瘤組織中呈陰性，表明制備的MAGE-A3兔多克隆抗體能夠特異性地識別腫瘤組織中MAGE-A3蛋白。結(jié)論：通過原核表達系統(tǒng)制備了MAGE-A3蛋白，并免疫兔制備了MAGE-A3蛋白特異性兔多克隆抗體，同時可以特異性地識別人胃癌細胞中的MAGE-A3蛋白，可作為免疫診斷用抗原。

人黑色素瘤抗原A3；原核表達系統(tǒng)；多克隆抗體；胃腫瘤

人黑色素瘤抗原A3（melanoma antigen-A3，MAGE-A3）基因不僅表達于以黑色素瘤為主的惡性腫瘤組織中，在各種組織類型的腫瘤中均可呈高表達，如肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)-直腸癌、肝細胞癌等，但在正常組織中（除睪丸和胎盤外）不表達。由于睪丸和胎盤組織不表達MHC分子，因此避免了這些組織中因MAGE-A3抗原肽的提呈而導致的特異性免疫應(yīng)答[1]，故MAGE-A3是腫瘤特異性免疫治療和診斷的理想靶抗原之一[2]。本研究利用原核表達系統(tǒng)制備了MAGE-A3蛋白，通過免疫兔制備了高效價的MAGE-A3特異性多克隆IgG抗體，并將免疫組織化學技術(shù)應(yīng)用于人胃癌細胞株中MAGE-A3蛋白的檢測，為MAGE-A3相關(guān)的生物學和免疫學等功能研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 DNA回收試劑盒、DL2000 DNA marker購自北京天根生物試劑公司，1 kb DNA marker購自蘇州杰瑞生物有限公司；蛋白相對分子質(zhì)量（M）marker、高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI均購自上海Fermentas公司；氨芐青霉素購自濟南齊魯藥廠；異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自美國默克公司；小鼠抗His mAb購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；鎳螯合親和層析膠（Ni-NTA Agarose）購自德國Qiagen公司；FITC標記的山羊抗兔IgG購自上海聯(lián)科生物技術(shù)公司；MAGE-A3特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；Trizol液購于美國Promega公司。Hoecset購自北京索萊寶公司；DMEM（Dulbeeeo’s modified Eagle medium）培養(yǎng)基、DMEM、RPMII640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；脫脂奶粉購自美國BD公司。pET21a（+）克隆載體和E.coli BL21（DE3）均購自美國Invitrogen公司；胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823及人黑素瘤細胞株A-375購自中國科學院上海細胞庫。組織固定液（4%多聚甲醛）、無水乙醇、95%乙醇、二甲苯、蘇木素、伊紅、鹽酸、氨水、中性樹膠、生物切片石蠟（溶點：58 ℃）購自溫州市金山化學試劑儀器公司。健康日本大耳白兔（雄性，體質(zhì)量1.8～2.4 kg），由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SYXK（浙）2014-0006。

1.2 方法

1.2.1 MAGE-A3全長基因的設(shè)計及pET21a（+）/ MAGE-A3重組質(zhì)粒構(gòu)建：從PubMed中獲取MAGE-A3全長基因序列（GenBank登錄號：NG_013244.1），經(jīng)過原核密碼子優(yōu)化后在其上下游引入限制性內(nèi)切酶NedI，XhoI酶切位點，委托上海生工生物工程有限公司合成，克隆至pET21a（+）質(zhì)粒，構(gòu)建pET21a/ MAGE-A3重組質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定，進一步將pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細菌中，利用T7通用引物（上游引物：5’-TAA TACGACTCACTATA-3’；下游引物：5’-CTAGCATAACCC CTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG-3’）進行PCR檢測驗證。

1.2.2 pET21a（+）/MAGE-A3重組蛋白的原核表達、鑒定及其純化：將測序正確的MAGE-A3重組質(zhì)粒pET21a（+）/MAGE-A3轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細菌后，接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，30 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)至吸光度A600=0.6時，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，30 ℃誘導6 h后12 000 r/min離心5 min收集細菌，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌、離心、超聲破菌，12 000 r/min離心10 min收集上清，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分析，以His-tag鼠單抗為一抗，用HRP標記的羊抗鼠IgG（H+L）為二抗，進行Western blot分析和鑒定；進一步收集經(jīng)IPTG誘導表達的菌液，加入8 mol/L尿素，冰浴中超聲破菌、離心后取上清，用Ni-NTA Agarose親和層析柱純化、洗脫，收集蛋白備用。純化蛋白按說明書進行操作。

1.2.3 MAGE-A3蛋白特異性兔多克隆抗體的制備、鑒定及其效價分析：用純化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔（MAGE-A3蛋白免疫組），同時設(shè)計PBS對照組。用1、3、5周免疫程序進行，首次免疫抗原與完全弗氏佐劑等量混合，2、3、4次免疫抗原與不完全弗氏佐劑等量混合，充分乳化，每次每只家兔背部皮內(nèi)多點注射500 μg MAGE-A3蛋白抗原。同時，于0、2、4和6周于兔耳緣靜脈取血，收集的血液于37 ℃下靜置45 min，4 000 r/min，4 ℃離心30 min，分離血清并分裝，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。ELISA檢測：用包被液（0.05 mol/L碳酸緩沖液pH 9.6）稀釋純化的MAGE-A3，50 μg/mL，加入酶標板孔中，設(shè)3個平行孔，封板于4 ℃過夜；3%脫脂奶粉按1∶200稀釋各組各時間段血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗；驗證免疫血清中MAGE-A3蛋白特異IgG抗體效價持續(xù)上升后，于第8周從兔心臟取血，收集血清方法同前。用間接ELISA法進行免疫后第8周血清效價檢測，即將純化后的MAGE-A3蛋白作為抗原，按50 μg/mL的濃度包被90孔板，置于4 ℃下過夜，經(jīng)洗滌、封閉后分別加經(jīng)倍比稀釋的第8周免疫兔血清，倍比稀釋度分別為1∶40、1∶160、1∶640、l∶2 560、1∶10 240、l∶40 960、1∶163 840，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG（H+L）。反應(yīng)結(jié)果置BioElx800酶標儀于450 nm處讀取吸光度（A）值，所有血清標本均重復(fù)3孔檢測，同時以PBS作為空白對照。

1.2.4 Western blot分析兔多克隆抗體識別MAGEA3蛋白的特異性：將MAGE-A3蛋白經(jīng)120 g/L SDSPAGE后轉(zhuǎn)膜，以兔多克隆血清（以1∶10 000稀釋）作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG（H+L）作為二抗，用Western blot檢測兔血清中MAGE-A3全長蛋白特異IgG抗體對MAGE-A3蛋白的特異性識別和結(jié)合能力。

1.2.5 MAGE-A3兔多克隆抗體在人胃癌細胞株中表達的檢測：①胃癌細胞株MAGE-A3基因表達的檢測：為檢測實驗選擇的細胞株是否表達MAGE-A3蛋白，本研究選用黑色素瘤A-375細胞株、胃癌SGC-7901細胞株和BGC-823細胞株作為檢測對象，并利用RTPCR對3株細胞的MAGE-A3基因的表達進行檢測。引物設(shè)計和合成：上游引物序列為：5’-ATGAGCTCATGC CTCTTGAGCAGAGGAG-3’，下游引物序列為：5’-GAGAGAG GGGGAAGAGTGA-3’[3]?？俁NA提取：收集培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞，使用Trizol法提取RNA。提取的總RNA使用紫外分光光度計測量獲得A260和A280。A260/A280在1.6～2.0間為RNA質(zhì)量合格，并根據(jù)A260計算獲得RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增目的基因：取2 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過PCR擴增獲得目的基因MAGEA3。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 45 s變性，58 ℃ 45 s退火，72 ℃ 1 min延伸，總共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。②胃癌細胞株MAGE-A3免疫熒光分析：將3株細胞以每孔5×105接種在六孔板中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)4 h后至單層；棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌，取出玻片；經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min；0.3% Triton-X100，處理15 min，用預(yù)冷的PBS洗滌；加DMEM+10% FBS培養(yǎng)基，37 ℃封閉1 h；用預(yù)冷的PBS洗滌后，加一抗MAGE-A3兔血清，比例為1∶1 000，37 ℃，1 h；洗滌后加二抗HRP標記的羊抗兔IgG（H+L），比例為1∶1 000，加Hoechst，每孔20 μL；PBS洗滌；避光，載玻片上滴熒光粹滅劑，細胞面朝下放在載玻片共聚焦顯微鏡下觀察，并于400倍下拍照。

1.2.6 荷瘤裸鼠胃癌組織標本免疫組織化學檢測：分別取本實驗室制備人黑色素瘤A-375細胞及人胃癌SGC-7901和BGC-823細胞荷瘤裸鼠腫瘤組織的石蠟標本，常規(guī)切片，HE染色；經(jīng)鏡檢觀察結(jié)果，再進行免疫組織化學染色，步驟如下：切片常規(guī)脫蠟、水化，高壓修復(fù)抗原，封閉后用PBS沖洗3次，以MAGE-A3特異性兔多克隆抗體（1∶1 000稀釋）為一抗，4 ℃孵育過夜。以HRP標記的羊抗兔IgG（H+R）抗體（1∶1 000稀釋）為二抗，37 ℃孵育2 h，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染和脫水后進行封片。同時以PBS兔血清代替一抗作為陰性對照，鏡檢并拍照記錄。用ImagePro Plus6.0分析免疫組織化學圖片。

2 結(jié)果

2.1 pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定MAGE-A3全長942堿基，經(jīng)原核密碼子堿基優(yōu)化后全序列合成；并經(jīng)NedI、XhoI酶切位點克隆至pET21a（+）載體，構(gòu)建pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確。進一步經(jīng)PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)1 169 bp的目的條帶，與理論值大小一致，表明pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

2.2 pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒的原核表達及鑒定 MAGE-A3重組質(zhì)粒在E.coli BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導表達，超聲裂解后取上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳，在相對分子質(zhì)量約48 kDa的位置出現(xiàn)一明顯蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。同時將純化的MAGEA3蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在分子量48 kDa的位置處也出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小相符單一的蛋白條帶。以His-tag鼠單抗為一抗，用HRP標記的羊抗鼠IgG（H+L）為二抗的Western blot檢測結(jié)果，在48 kDa處出現(xiàn)陽性反應(yīng)帶，見圖2。

2.3 MAGE-A3蛋白特異性兔多克隆抗體的制備、鑒定及其效價分析

2.3.1 MAGE-A3蛋白免疫組兔多克隆抗體的效價分析：將純化后的MAGE-A3蛋白作為包被抗原，用間接ELISA檢測兔0、2、4、6及8周血清MAGE-A3特異性IgG抗體的效價，MAGE-A3蛋白免疫組兔血清于免疫后第2周開始，IgG抗體滴度逐漸升高，至第6～第8周達高峰。間接ELISA檢測結(jié)果顯示，第8周MAGE-A3蛋白免疫組兔多克隆抗體IgG的效價可達1∶40 000。見圖3。

2.3.2 Western blot檢測分析MAGE-A3蛋白兔多克隆抗體特異性：以免疫后第8周兔血清抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG（H+L）為二抗，用Western blot分析檢測其與原核表達的MAGE-A3蛋白的結(jié)合特異性，在約48 kDa處出現(xiàn)陽性反應(yīng)帶，見圖4。

圖1 重組質(zhì)粒pET21a（+）/MAGE-A3構(gòu)建和鑒定圖

2.4 MAGE-A3兔多克隆抗體在人胃癌細胞株中的表達情況

圖2 MAGE-A3蛋白的SDS-PAGE及Western blot圖

圖3 MAGE-A3全長蛋白免疫后兔血清抗體的反應(yīng)（A）和效價（B）

2.4.1 胃癌細胞株MAGE-A3基因的表達情況：A-375和SGC-7901細胞株中制備的cDNA，經(jīng)RT-PCR擴增并SDS-PAGE，在約945 bp處出現(xiàn)了一條明顯的條帶，大小與預(yù)期理論值相一致。但BGC-823細胞株未見相應(yīng)的擴增條帶，表明A-375細胞株和胃癌SGC-7901細胞株為MAGE-A3陽性細胞株，而胃癌BGC-823細胞株為MAGE-A3陰性細胞株，見圖5。

2.4.2 胃癌細胞株免疫熒光分析：在A-375和SGC-7901細胞漿內(nèi)可見多個強綠色的點狀或團塊狀熒光斑點，而BGC-823細胞株未見明顯的MAGE-A3蛋白表達，見圖6。

圖4 MAGE-A3蛋白兔多克隆抗體特異性Western blot分析

圖5 3株細胞中MAGE-A3基因的RT-PCR檢測

2.4.3 胃癌組織免疫組織化學檢測：A-375、SGC-7901和BGC-823 3種腫瘤石蠟組織，經(jīng)常規(guī)切片、HE染色，在普通光鏡顯微鏡下觀察，可見腫瘤組織中腫瘤細胞異行性程度高，并伴淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，血管擴張充血、小灶性凝固性壞死；腫瘤細胞被間質(zhì)分隔，腫瘤細胞核大深染且易見核分裂相等腫瘤病理性特征。在A-375黑色素瘤腫瘤組織和SGC-7901胃癌腫瘤組織切片中，腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)團狀棕黃色沉淀顆粒，而在BGC-823腫瘤組織切片中，未見棕黃色沉淀；PBS血清組，也未見陽性反應(yīng)，見圖7。

3 討論

MAGE-A3屬于人類黑色素瘤抗原（MAGE-A）家族成員，由314個氨基酸組成，是一可溶性的胞漿蛋白[4]。由于眾多的腫瘤均有MAGE-A3的表達，尤其在胃癌中表達陽性率可達42%～45%[5-6]，因此，在腫瘤免疫診斷和治療方面，MAGE-A3的研究具有重要意義，許多研究者聚焦于MAGE-A3表位的研究。早在2001年，SCHULTZ等[7]利用計算機軟件，分析了MAGE-A3的HLA-B35提呈CTL表位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAGE-A3的表位肽（TQHFVQENYLEY），由HLA-B35分子提呈到CD4+T淋巴細胞表位可誘導人外周血單個核細胞，產(chǎn)生對腫瘤細胞的特異性殺傷活性，為MAGE-A3陽性腫瘤細胞的治療提供了基礎(chǔ)；本實驗室曾對MAGE-A3的CTL和B細胞表位進行了分析，預(yù)測了MAGE-A家族共同B細胞表位，發(fā)現(xiàn)HCKPEE、EEEGP、RAREPVTK、GEPRKLLT等肽段可能為MAGE-A家族共同B細胞優(yōu)勢表位[8]；此外，本實驗室對MAGE-A3表位肽進行了研究，發(fā)現(xiàn)MAGE-A3肽段QRSQHCKPEEGLEARGEAL、KVAELVHFL LLK、YRAREPVT及EGREDSILGDPKKLL分別含有B細胞表位，HLA-A2和A24限制性的CTL表位，及HLA-DRB限制性Th表位，為免疫優(yōu)勢表位，在胃癌患者的血清中可檢測到相應(yīng)的特異性抗體，在胃癌的診斷方面具有較高的敏感性和特異性[8]。

圖6 MAGE-A3兔多克隆抗體間接免疫熒光檢測（×400）

圖7 胃癌組織免疫組織化學檢測

雖然表位肽疫苗具有安全、穩(wěn)定、費用低、靶特異性強等優(yōu)點，但免疫原性較弱，且受MHC限制等使表位肽在診斷和疫苗研究方面具有一定局限性。而MAGE-A3蛋白不僅含有多種CTL表位、Th和B細胞表位，且不被特定HLA表型所限制，免疫效果更好，在基于MAGE-A3的免疫診斷和治療方面也具有較廣的應(yīng)用前景[9-11]。本研究采用基因工程技術(shù)，將MAGE-A3全長核酸序列經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后構(gòu)建了pET21a（+）/MAGE-A3重組質(zhì)粒，將目的基因經(jīng)NedI和XhoI兩個酶切位點插入載體，利用NedI中的ATG密碼子，可以直接在多克隆位點的翻譯的起始密碼子處直接啟動蛋白翻譯，而避免了載體蛋白的影響。本研究用純化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔，制備兔多克隆抗體，并進一步通過Western blot初步驗證該抗體可特異性識別原核表達的重組MAGEA3蛋白的特性。

盡管MAGE-A3的單克隆抗體已經(jīng)應(yīng)用于臨床的實驗研究，但單克隆抗體僅識別單一的B表位而存在一定的局限性，其不能進行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測方法不能用單克隆抗體完成；且單克隆抗體制造技術(shù)要求高，費時費力，而多克隆抗體由于可識別更多的B細胞表位，也具有重要的研究意義[12-14]。因此，多克隆抗體在免疫診斷和實驗研究中仍然具有重要的應(yīng)用前景。本研究利用原核表達的MAGE-A3蛋白制備的兔多克隆抗體對人胃癌細胞細胞株中天然的MAGE-A3進行初步檢測。細胞免疫熒光結(jié)果顯示了該兔多克隆抗體可特異性識別SGC-7901細胞株表達的MAGE-A3蛋白，在胞漿內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光團塊，與陽性對照A-375細胞株檢測結(jié)果相一致；結(jié)果表明，MAGE-A3兔多克隆抗體能在組織水平特異性地識別腫瘤細胞表達的天然的MAGEA3蛋白，并與RT-PCR的檢測胃癌腫瘤細胞中MAGE-A3表達的結(jié)果相一致。結(jié)合ELISA實驗結(jié)果，可認為該多克隆抗體有較高的效價，可達1∶40 000。免疫組織化學染色結(jié)果進一步顯示，該兔多克隆抗體可識別SGC-7901細胞荷瘤裸鼠腫瘤組織中的MAGE-A3蛋白?？傊?，本研究通過原核表達系統(tǒng)成功制備了MAGE-A3蛋白，經(jīng)ELISA驗證具有較好的免疫原性及抗原性；利用原核表達純化后的MAGE-A3蛋白制備兔多克隆抗體，特異性強，效價高，能夠識別天然的MAGE-A3蛋白，可為基于MAGE-A3的生物學和免疫學等研究提供基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳彬）

Preparation of MAGE-A3 polyclonal antibody and its application in detection of human gastric cancer

cell CAI Yiqi1, CHENG Kai1, CHEN Xudong1, CHEN Xiaodong1, CEN Danwei2, ZHANG Chanqiong2, SONG Yiling2, MAO Shanshan2, YE Xiaoxian2, ZHANG Lifang2, ZHU Guanbao1. 1.Department of Gastroenterological Surgery, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Instiute of Molecular Virology and Immunology, Department of Medical Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To prepare Human MAGE-A3 (MAGE-A3) protein by prokaryotic expression system. At the same time, a polyclonal antibody was prepared to against it, after preliminary identi fi cation and application. Methods: The MAGE-A3 full-length nucleic acid sequences were synthetized and cloned into pET21a (+) plasmid to construct pET21a (+)/MAGE-A3 restructuring plasmids. After sequencing, the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3). The MAGE-A3 protein was expressed through Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducing. Then the recombinant protein of MAGE-A3 was puri fi ed by Ni-NTA af fi nity chromatography and con fi rmed by SDS-PAGE and Western blot analysis, the rabbits were immunized with the puri fi ed protein MAGE-A3 in order to prepare the polyclonal antibody. The titers of speci fi c antibodies were detected by ELISA. The speci fi city activity was further detected by Western blot and immuno fl uorescence technique analysis. Its preliminary application was detected in human gastric cancer cells by immunohistochemical techniques. Results: The recombinant plasmids pET21a(+)/MAGE-A3 (full-length) were successfullyconstructed. The MAGE-A3 recombinant protein could be expressed and puri fi ed in the prokaryotic expression system. SDS-PAGE showed the size of the protein about 48 kDa was consistent with the expected size of the protein and identi fi ed by Western blot. The polyclonal antibodies were produced in the rabbits immunized with the MAGE-A3 recombinant protein. The Antigen-antibody reactions reached a peak in the eighth week. Western blot analysis indicated that the polyclonal antibody could speci fi cally recognize the MAGE-A3 recombinant protein. The immuno fl uorescence showed that fl uorescent clumps appeared in intracytoplasm of MAGE-A3 positive cells A-375 (melanoma cell line) and SGC-7901 cells (gastric cancer cell line). It con fi rmed that polyclonal antibody could specifically recognizes natural MAGE-A3 protein. ELISA analysis indicated the titer of the polyclonal IgG was up to 1:40 000 in the eighth week; Immunohistochemistry display appeared in the cytoplasm A-375 and SGC-7901 tumor tissue lumpy brown granular precipitate, while a negative in BGC-823 tumor tissues, suggesting that the preparation of the MAGE-A3 rabbit polyclonal antibody was capable identi fi ng MAGE-A3 protein speci fi cally in tumor tissue. Conclusion: MAGE-A3 recombinant protein is expressed by the prokaryotic expression system and its polyclonal antibody is prepared successfully. And the polyclonal antibody can speci fi cally recognize MAGE-A3 protein in human gastric cancer cells.

human melanoma antigen-A3; prokaryotic expression system; polyclonal antibody; stomach neoplasms

R392．7

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.002

2016-06-22

國家自然科學基金資助項目（81372447）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2100660）。

蔡一奇（1990-），男，浙江溫州人，碩士生。

朱冠保，教授，碩士生導師，Email：zgbwmc@126.com。