四物合劑干預(yù)順鉑作用卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平的實(shí)驗(yàn)研究

武虹波 趙丕文 孫麗萍 蔡欣悅 趙笛 楊蕾 盧迪

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四物合劑干預(yù)順鉑作用卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平的實(shí)驗(yàn)研究

武虹波 趙丕文 孫麗萍 蔡欣悅 趙笛 楊蕾 盧迪

目的 探討四物合劑對(duì)順鉑損傷后顆粒細(xì)胞分泌E2水平的影響。 方法 取10只22～24天SD雌性大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)，另取48只22～24天SD雌鼠隨機(jī)分為生理對(duì)照組、模型組、陽性組、四物合劑大、中、小劑量組，每組8只，以生理鹽水(生理對(duì)照組與模型組，0.5 mL/天)，戊酸雌二醇片陽性組(0.4 mg/kg·d)，四物合劑大劑量組(13.5 mL/kg·d)、中劑量組(6.75 mL/kg·d)、小劑量組(3.38 mL/kg·d)分別灌胃3天后取藥理血清。顆粒細(xì)胞用含20 %藥理血清的細(xì)胞培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24小時(shí)后檢測指標(biāo)。MTT法觀察藥理血清對(duì)順鉑損傷后原代顆粒細(xì)胞增殖的影響；放射免疫法觀測四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌的干預(yù)效果；免疫組化法檢測四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用顆粒細(xì)胞CYP19a1基因表達(dá)和Smad2/3激活的干預(yù)效果。 結(jié)果 MTT法檢測結(jié)果表明：與模型組相比，陽性組、四物合劑各劑量組細(xì)胞吸光度均增強(qiáng)，四物合劑大劑量數(shù)值最高(P<0.01)；放免法檢測結(jié)果表明，四物合劑藥理血清對(duì)E2的分泌有促進(jìn)作用，且大劑量效果最明顯(P<0.05)；免疫組化法結(jié)果表明，四物合劑藥理血清可以提高CYP19a1基因、Smad2/3蛋白、Psmad2/3蛋白的表達(dá)，其中大劑量作用明顯(P<0.01)。 結(jié)論 四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用后的顆粒細(xì)胞E2的分泌水平有改善作用，但可能還不能起到完全修復(fù)的作用，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。

卵巢顆粒細(xì)胞； 順鉑； 四物合劑； 雌二醇

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指婦女40歲之前卵巢功能衰退、閉經(jīng)，伴有低雌激素和高促性腺激素狀態(tài)的一組疾病[1]，其病因復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)理目前仍有待探究。近年來關(guān)于癌癥化療藥物導(dǎo)致卵巢雌激素分泌水平的下降形成卵巢早衰的報(bào)道日益增多[2]。順鉑(cis-diamne dichloroplatinum,CDDP)是一種用來治療多種腫瘤的化療藥物，有研究表明，順鉑的使用對(duì)卵巢有直接的不良作用，可誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，最終形成卵巢早衰[3-4]。西醫(yī)對(duì)該病多采取激素替代療法，但不良反應(yīng)明顯。本實(shí)驗(yàn)選用四物湯中成藥即四物合劑來作為治療藥物。人類細(xì)胞色素蛋白P450(CYP19a1)作為雌二醇(estradiol，E2)合成關(guān)鍵酶，E2的合成與分泌又與TGF-β-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[5]，Smad2/3蛋白作為該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)分子，故本研究擬通過使用四物合劑作用于順鉑建立起來的大鼠卵巢早衰模型，通過檢測對(duì)CYP19a1以及Smad2/3蛋白表達(dá)的影響，探討四物合劑對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性22～24天SD大鼠，體質(zhì)量75～80 g，清潔級(jí)，檢疫合格，購自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。許可證號(hào)：SCXK(京) 2011-0004。

1.2 藥物、試劑與儀器

DMEM F-12培養(yǎng)液(批號(hào)：SH-30023，Hyclone公司)、DAB顯色試劑(批號(hào)：ZLI-9018，中杉金橋)，免疫組化試劑盒(批號(hào)：SP-9001，中杉金橋)，DMSO(批號(hào)：DB370，Amresco)。Smad2/3(批號(hào)：sc-8332，Santa)，Psmad2/3(批號(hào)：sc-11769，Santa)，CYP19a1(批號(hào)：sc-30086，Santa)，二抗：山羊抗兔IgG(批號(hào)：ZB2301)、山羊抗小鼠IgG(批號(hào)：ZB2305)由中杉金橋公司生產(chǎn)。

順鉑粉針劑(CDDP，濟(jì)南齊魯制藥，10 mg/支，批號(hào)：H37021358)，注射時(shí)使用生理鹽水將其配制濃度為2.5 μg/mL稀釋液；四物合劑(吉泰安藥業(yè)有限公司，100 mL/瓶)；補(bǔ)佳樂(拜耳醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，1 mg/片，批號(hào)：B01007102)。

CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)；超凈工作臺(tái)(北京亞泰隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，022-2522) ；低溫離心機(jī) (SIGMA，3K15)；倒置顯微鏡( NIKON，TS100)；多功能熒光酶標(biāo)儀( TECAN，SAFIRE2 )。

1.3 原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分離收集

取22～24天SD雌性大鼠，腹腔注射孕馬血清(PMSG，50 IU/只)，常規(guī)飼養(yǎng)48小時(shí)后，10%水合氯醛麻醉后處死，無菌條件下取出雙側(cè)卵巢并用預(yù)冷的Hank’s液清洗3次。將卵巢移入3 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)中，用1 mL一次性注射器針頭刺破卵泡，釋放顆粒細(xì)胞，加入0.25%胰酶1mL，用吸管反復(fù)吹打懸液數(shù)次，使顆粒細(xì)胞團(tuán)塊分離，37℃消化10分鐘(其間每隔3分鐘振蕩或吹打1次)。加入5 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(含20 %胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)終止胰酶消化，并靜置10分鐘，取懸液加入離心管離心(1000 rpm，10分鐘)，棄上清，加入5 mL Hank’s液，吹散細(xì)胞后再離心一次，棄上清，加入1 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)后吹打，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×105/mL。

1.4 藥理血清制備

將48只22～24天SD大鼠隨機(jī)分六組，每組8只，分組及造模方法：(1)生理對(duì)照組：生理鹽水灌胃每天0.5 mL/次；(2)模型組：同生理對(duì)照組；(3)陽性組：每天0.4 mg/kg；(3)四物合劑大劑量組(成人用藥量20倍)：每天13.5 mL/kg；(4)四物合劑中劑量組(成人用藥量10倍)：每天6.75 mL/kg；(5)四物合劑低劑量組(成人用藥量5倍)：每天3.38 mL/kg。各組連續(xù)灌胃3天，最后1次灌胃1小時(shí)后心臟取血并分離血清，在超凈臺(tái)過濾后分裝，-20℃保存。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 MTT法觀察藥理血清對(duì)CDDP損傷后原代顆粒細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL。在蓋上做好標(biāo)記，每兩列為一組，共六組，分為生理對(duì)照組、模型組、陽性組、四物合劑大劑量組、四物合劑中劑量組、四物合劑小劑量組。培養(yǎng)72小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，除正常組外，其余吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入等體積的CDDP稀釋液(濃度為2.5 μg/mL)，作用12小時(shí)后，吸去所有孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入各組對(duì)應(yīng)血清(藥理血清濃度為20 %)。培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加MTT溶液20 μL(5 mg/mL，用PBS配制，pH=7.4)，37oC孵育4小時(shí)后，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀波長490 nm，測吸光度值(optical density，OD)。

1.5.2 放免法測定四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌水平的影響 細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的密度接種于48孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液總體積為400 μL。將48孔板分六組，方法同上。培養(yǎng)72小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，除生理對(duì)照組外，其余組吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入等體積的CDDP稀釋液，作用12小時(shí)后，吸去所有孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入等量血清稀釋液(濃度為20%)以及E2分泌誘導(dǎo)劑雄烯二酮(0.5 μmol/L)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH，14 IU/L)。藥理血清培養(yǎng)24小時(shí)后，取每孔上清液測定E2水平。

1.5.3 免疫組化法觀察四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用顆粒細(xì)胞CYP19a1基因表達(dá)的影響以及對(duì)Smad2/3蛋白的激活效果 選取細(xì)胞密度約5×105個(gè)/孔的48孔板，移去培養(yǎng)基，用PBS 清洗一遍；4%的多聚甲醛室溫固定20分鐘；PBS室溫漂洗三次，3分鐘/每次；含0.5% Triton-X-100室溫通透處理20 分鐘；PBS室溫漂洗三次；3% H2O2去離子水孵育10分鐘；PBS室溫漂洗三次；滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)室溫孵育15分鐘，傾去，勿洗；各蛋白抗體作為一抗，室溫孵育2～3小時(shí)；PBS室溫漂洗三次；滴加試劑B(生物素二抗工作液)，室溫或37℃孵育10～15分鐘；PBS室溫漂洗三次；滴加試劑C(辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液)，37℃孵育30分鐘，PBS沖洗3次；DAB顯色劑顯色，室溫孵育10～15分鐘，自來水洗兩次；于倒置顯微鏡下觀察拍照并使用Image pro-plus進(jìn)行圖像分析，測定積分光密度值(immunity group image gradation analysis integral light density，IOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT計(jì)數(shù)法及放免法觀察藥理血清對(duì)CDDP作用顆粒細(xì)胞吸光度、E2分泌水平的影響

MTT法結(jié)果顯示：與生理對(duì)照組相比，模型組吸光度值降低明顯(P<0.01)，證明造模成功；與模型組相比，陽性組、四物合劑各劑量組細(xì)胞吸光度均增強(qiáng)，效果尤以四物合劑大劑量組明顯(P<0.01)。

放免法結(jié)果顯示：模型組細(xì)胞在順鉑作用下E2分泌水平較生理對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，在陽性藥與四物合劑各劑量組的作用下，E2分泌水平均較模型組有所增加，除陽性組效果較為明顯之外(P<0.01)，四物合劑大劑量組也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 免疫組化法檢測四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用顆粒細(xì)胞CYP19a1基因表達(dá)和Smad2/3蛋白激活的干預(yù)

順鉑作用后，顆粒細(xì)胞中CYP19al蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，在陽性藥及四物合劑各劑量組作用后，表達(dá)量有所提升，其中四物合劑組中以大劑量組染色較深，蛋白表達(dá)量增加較顯著(P<0.01)， 分析IOD值后得出四物合劑各劑量組相比模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，大劑量組效果最為顯著，中劑量次之。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19a1、Smad2/3、Psmad2/3表達(dá)的IOD值

注： 與生理對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

注： A.生理對(duì)照組；B.模型組；C.陽性組；D.四物合劑大劑量組；E.四物合劑中劑量組；F.四物合劑小劑量組

圖1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Cyp19al基因的表達(dá)(DAB染色法×400)

注： A.生理對(duì)照組；B.模型組；C.陽性組；D.四物合劑大劑量組；E.四物合劑中劑量組；F.四物合劑小劑量組

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Smad2/3蛋白的表達(dá)(DAB染色法×400)

注： A.生理對(duì)照組；B.模型組；C.陽性組；D.四物合劑大劑量組；E.四物合劑中劑量組；F.四物合劑小劑量組

圖3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Psmad2/3蛋白的表達(dá)(DAB染色法×400)

表1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞吸光度值及E2分泌水平

注： 與生理對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

Smad2/3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，磷酸化的Smad2/3蛋白即Psmad2/3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中。如圖1～3所示，順鉑作用后的顆粒細(xì)胞，Smad2/3蛋白及Psmad2/3蛋白表達(dá)量均下降(P<0.01)，陽性藥以及四物合劑作用后各組蛋白表達(dá)量均較模型組增加，四物合劑組中以大劑量效果較為顯著(P<0.01)。

3 討論

四物合劑來源于補(bǔ)血調(diào)經(jīng)的經(jīng)典名方“四物湯”，是由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎四味藥在傳統(tǒng)方劑的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)而制成的口服液。四物湯出自唐人集著的《仙授理傷續(xù)斷秘方》，在宋代的《太平惠民和劑局方》中被列入治療“婦科諸疾”[6]，歷來都是醫(yī)家治療婦科疾病的經(jīng)典要方。本研究旨在探討四物合劑對(duì)順鉑損傷后的卵巢顆粒細(xì)胞分泌E2水平的影響，明確四物合劑對(duì)卵巢早衰的治療效果，從而為四物合劑在臨床上對(duì)卵巢早衰的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

研究表明，順鉑可引起卵巢抗氧化及氧化損傷指標(biāo)的異常，從而導(dǎo)致卵巢功能衰退[7]，故本實(shí)驗(yàn)采用順鉑作用于正常卵巢顆粒細(xì)胞造模。MTT計(jì)數(shù)法和放免法檢測結(jié)果表明，順鉑造模后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力減弱，且E2分泌水平降低，但在四物合劑的作用下，細(xì)胞增殖能力以及E2分泌水平均有所改善，且在本研究中，四物合劑各組中以大劑量效果較為顯著。

E2作為女性體內(nèi)最為重要的性激素之一，具有促進(jìn)卵泡生長，改善卵巢功能的作用。E2的合成原料為膽固醇，在類固醇激素快速合成調(diào)節(jié)蛋白作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，經(jīng)一系列酶催化轉(zhuǎn)化為E2，此過程中CYP19a1是E2生成的限速酶[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，順鉑作用下，影響顆粒細(xì)胞分泌E2能力的CYP19a1的表達(dá)水平下降，但在四物合劑藥理血清的干預(yù)下，CYP19a1的表達(dá)水平上升，尤以大劑量組效果最為明顯，說明四物合劑可通過影響CYP19a1基因的表達(dá)而提高顆粒細(xì)胞E2的分泌水平。

Samds家族是一個(gè)在脊椎動(dòng)物、昆蟲和線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子家族，迄今為止在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)8個(gè)成員：Smad1～8[9]。Smad蛋白將細(xì)胞表面轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[10]。Smad2和Smad3是TGF-β受體的直接底物，在TGF-β刺激下，Smad2和Smad3蛋白被磷酸化，與Smad4形成復(fù)合物，然后穿入細(xì)胞核調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。故Smad蛋白在E2的合成過程起到了至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在順鉑作用下，Smad2/3的胞核分布均減少，但在四物合劑藥理血清干預(yù)后，Smad2/3蛋白的核質(zhì)分布均增多，且大劑量效果最為明顯，表明四物合劑對(duì)顆粒細(xì)胞分泌E2有改善作用，且該作用經(jīng)過了TGF-β和Smad2/3信號(hào)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，對(duì)于化療藥物順鉑所致的大鼠卵巢早衰，四物合劑確有療效，可以提升顆粒細(xì)胞E2的分泌水平，從而改善由卵巢早衰引起的低雌激素癥狀。但研究也表明，四物合劑的使用也有劑量上的要求，大、中劑量表現(xiàn)出一定的治療作用，而且治療作用隨著劑量降低依次減弱。此外，四物合劑對(duì)E2分泌的調(diào)節(jié)作用有可能是通過TGF-β和Smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，但其具體的分子作用靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步的考察。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Experimental study ofSiwumixture intervening the secretion level of E2in ovarian granulose cell induced by cisplatin chemotherapy

WUHongbo，ZHAOPiwen，SUNLiping，etal.

SchoolofBasicMedicalSciences，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

ZhaoPiwen，E-mail：pwzhao@263.net

Objective To explore the effect ofSiwumixture on secretion level of E2in ovarian granulose cell induced by cisplatin chemotherapy. Methods Ovarian granulosa cells from ten SD female rat of 22 to 24 days were taken to culture cells. 48 healthy SD female rats from 22 to 24 days were randomly divided into 6 groups: normal group, model group, positive medicine group, and the high、medium and low dose ofSiwumixture group, 8 rats in each group. Rats were given corresponding drug by gavage for 3 days：Physiological saline (normal group and model group, 0.5 mL/d),Estradiol valerate tablets(positive medicine group, 0.4 mg/kg·d),Siwumixture high group(13.5 mL/kg·d),Siwumixture medium group(6.75 mL/kg·d),Siwumixture low group(3.38 mL/kg·d). The ovarian granulosa cells were cultured by 20% pharmacological serum for 24 hours.MTT method was used to observe the effect of pharmacological serum on proliferation of primary granulosa cells after cisplatin injury. RIA was used to observe the intervention effect of pharmacological serum on E2secretion. Mmunohistochemistry was used to detect intervention effect of serum pharmacological on CYP19a1 gene expression and activation of Smad2/3. Results MTT assay results showed that absorbance of positive medicine group andSiwumixture groups were higher than the normal group, and theSiwumixture high dose group was the highest(P<0.01), RIA method results showed thatSiwumixture had a auxo-action of E2, and high dose group was the most obvious(P<0.05). Immunohistochemical method results showed thatSiwumixture could improve the expression of CYP19a1 gene and Smad2/3 and Psmad2/3 protein, the effect of high dose group was the most obvious(P<0.01，P<0.01，P<0.01). ConclusionSiwumixture has the effect of improvement on the secretion of E2. But it may not be able to play the role of completely repair, and need for further experimental observation.

Ovarian granulose cell; Cisplatin;Siwumixture; Estradiol

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81673764)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目(2015-JYBJSMS016)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 [武虹波(碩士研究生)、蔡欣悅(碩士研究生)、趙笛(碩士研究生)、楊蕾(碩士研究生)、盧迪(碩士研究生)、趙丕文、孫麗萍]

武虹波( 1989- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：婦科常用中藥的作用機(jī)制。E-mail: wuhongbo0112@126.com

趙丕文( 1967- )，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：婦科常用中藥的作用機(jī)制。E-mail: pwzhao@263.net

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.014

2016-10-10)