調(diào)脂通脈方對動脈粥樣硬化兔模型血管重塑的影響

蘇兆鐸 郭書文 張璐 馬卉 鄭敏 武建功 吳佳妮 陳曦 劉文臣 馬如風

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調(diào)脂通脈方對動脈粥樣硬化兔模型血管重塑的影響

蘇兆鐸 郭書文 張璐 馬卉 鄭敏 武建功 吳佳妮 陳曦 劉文臣 馬如風

目的 探討調(diào)脂通脈方對動脈粥樣硬化兔模型血管重塑相關影響因素的調(diào)控機制。方法 通過高脂飼料飲食及球囊損傷術建立動脈粥樣硬化兔模型，54只兔隨機分成5組，正常組、模型組、假手術組、阿托伐他汀組(2.2 mg/kg)和調(diào)脂通脈方組(8 g/kg)；除正常組外，其余四組選擇45天、90天兩個觀察點，45天時觀察動物30只，90天時觀察動物24只。對各組兔模型左頸總動脈的管腔內(nèi)徑、內(nèi)中膜厚度和收縮期峰值流速采用超聲測量；對頸總動脈作病理學觀察；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清MMP-1、MMP-2、TIMP-1、PD-ECGF、UA水平。結果 兩個時間點，模型組兔血清中MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA表達水平明顯高于假手術組(P<0.01)，TIMP-1低于假手術組(P<0.01)。調(diào)脂通脈方組家兔血清MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA水平較模型組明顯下降(P<0.01)，TIMP-1水平明顯升高(P<0.01)，與阿托伐他汀組無明顯差異。結論 調(diào)脂通脈方降低了MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA水平，提高了TIMP-1水平，從而影響動脈粥樣硬化的血管重塑，進而改善動脈粥樣硬化，可能是其作用機制。

調(diào)脂通脈中藥； 動脈粥樣硬化； 血管重塑

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一組最常見的血管硬化疾病，以動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小為特點。目前，對于AS的了解尚不全面，仍不能全面解釋其發(fā)生發(fā)展的機制，形成了內(nèi)皮損傷學說及炎癥反應學說等，從不同角度分別闡述了AS的形成過程。但可以確定的是，在AS過程中始終伴隨著血管腔形態(tài)、面積改變，血管壁成分、結構改變和血管功能的改變，即血管重塑。因此，改善AS可從調(diào)控血管重塑著手。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)等構成了復雜的微環(huán)境，這些因子通過活化、釋放、促進等作用使血管發(fā)生重塑進而影響動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展[1]。西醫(yī)常規(guī)治療AS的藥物有他汀類降脂藥及阿司匹林等，均存在不同程度的不良反應。由生黃芪、當歸、生山楂、地龍、決明子、澤瀉、三七粉組成的調(diào)脂通脈方，配伍精當，可有效調(diào)節(jié)脂代謝，且毒副作用較小。聯(lián)合高脂飼料飲食及球囊損傷術的方法建立AS兔模型，通過該方進行干預，觀察MMP-1、MMP-2、TIMP-1、PD-ECGF、尿酸(uric acid,UA)的變化情況，探討調(diào)脂通脈方改善AS的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和飼料

由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司提供的健康6周齡清潔級新西蘭大白兔，體質量(2.0±0.2)kg，許可證編號SCXK(京)2010-0001。飼養(yǎng)條件：于北京大學醫(yī)學部普通動物實驗室，室內(nèi)溫度24℃、相對濕度50%，符合國家二級標準。

高脂飲食飼料：高脂部分(10%蛋黃粉+3%豬油+1%膽固醇)與86%基礎飼料混勻。提供方：北京華阜康生物科技股份有限公司。許可證編號：SCXK(京)2009-0008。

1.2 實驗藥物

1.2.1 造模藥物 烏拉坦(國藥集團化學試劑北京有限公司，SCRC301912)；速眠新(吉林華牧動物保健，120627)；肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥有限公司，國藥準字H32022088)；鹽酸利多卡因注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，國藥準字H11020323)；注射用青霉素鉀[杭州養(yǎng)寶生物制藥有限公司，獸藥字(2011)110341253]。

1.2.2 中藥 黃芪20 g、當歸15 g、山楂30 g、地龍15 g、決明子30 g、澤瀉12 g、三七粉6 g，組成調(diào)脂通脈方，共128 g。按中藥復方顆粒劑的規(guī)范制備工藝制作，按比例遵循處方稱取中藥材，加適量水煎煮二次，濾過煎液，合并濃縮至適量，采用噴霧干燥，加入適量輔料，混合均勻，制成顆粒，包裝，20 g/劑。調(diào)脂通脈方的臨床等效劑量：約7.3 g(生藥量)/(kg·d)。由北京中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院提供。

1.2.3 西藥 阿托伐他汀，按臨床20 mg/天換算，兔等效劑量為2.2 mg/(kg·d)，每片20 mg。提供方：輝瑞制藥有限公司。編號：國藥準字H19990258。阿托伐他汀為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)選擇性抑制劑，HMG-CoA還原酶可調(diào)控細胞內(nèi)游離膽固醇含量，降低膽固醇，降低血脂，減少AS斑塊的形成[2]。

1.3 主要試劑及材料

ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司CUSABIO。2.5 mm×2.0 mm球囊導管，德國貝朗公司。球囊擴張壓力泵，美國麥瑞特公司，備皮刀，無菌帶線縫合針，持針器，手術臺，注射器，棉球，紗布等。

1.4 方法

1.4.1 手術方法 采取球囊損傷術[3]制備模型。術前準備：禁食12小時，可飲水。麻醉：速眠新0.05 mL/kg，肌肉注射；25%烏拉坦4 mL/kg，耳緣部靜脈注射；兔平穩(wěn)后，肝素納200 lU/kg，耳緣靜脈注入。手術過程：將兔仰面固定于操作臺，頸部脫毛，消毒，切開頸正中部皮膚，鈍性分離肌肉，動作宜輕柔。在甲狀軟骨上緣水平位置，充分暴露左側頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，分離左側頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，在左頸外動脈遠心端結扎，結扎時盡量靠近遠心端。夾閉左頸總動脈和左頸內(nèi)動脈。在左頸外動脈與頸總動脈分叉之間剪“V”形切口，迅速將球囊插入切口處，直至左頸總動脈。連接手動壓力泵，將球囊充氣，向回牽拉大約1 cm，將球囊抽氣，再次送入，重復3次后取出。將左頸外動脈近心端結扎，打開被關閉的左頸總動脈和左頸內(nèi)動脈?？p合傷口并包扎。術后措施：青霉素80萬單位，肌肉注射，持續(xù)3天。假手術組手術操作過程同上，但不行球囊損傷，僅結扎左頸外動脈。

1.4.2 分組與給藥 分組方法：隨機數(shù)字表法。分為正常組、模型組、假手術組、西藥組和中藥組。飲食：正常組正常飲食，其他四組高脂飼料飲食。頸動脈球囊損傷術于2周后進行，術后分別灌胃相應藥物，1次/天。西藥組：阿托伐他汀2.2 mg/(kg·d)，中藥組：調(diào)脂通脈方8 g/(kg·d)。正常組、模型組和假手術組無藥物干預，灌胃相同體積的蒸餾水。

1.4.3 主要觀測指標及測定方法 超聲評價動脈粥樣硬化模型建立情況：采用Mindray公司M7便攜彩超診斷儀測量兔左側頸總動脈，分別測量其管腔內(nèi)徑、內(nèi)中膜厚度和收縮期峰值流速。

蘇木素-伊紅(HE)染色：兩個時間點處死動物后，將頸總動脈病變明顯處剪取0.5 cm長的組織，用石蠟組織包埋血管節(jié)段標本，手動輪轉式切片機連續(xù)切4 μm片，用HE自動染色機做HE染色組織切片，用CellSens照相系統(tǒng)連接光學顯微鏡觀察并拍攝照片。

ELISA檢測：用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血液中MMP-1、MMP-2、TIMP-1、PD-ECGF、UA水平，按試劑盒上的說明進行操作，稀釋標準品，依次入孔，將待測樣品加入樣品孔(100 μL/孔)，分別加入稀釋后的生物素標記的抗MMP-1、抗MMP-2、抗TIMP-1、抗PD-ECGF、抗UA檢測抗體，水浴箱溫育，洗板，加辣根過氧化物酶37℃溫育30分鐘，洗板，加顯色液，避光溫育，加終止液，酶標儀讀取OD值。觀察第45、90天指標變化情況。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組頸動脈內(nèi)徑、內(nèi)中膜厚度及血流速度變化情況

第45天，假手術組頸總動脈內(nèi)徑在0.2～0.23 cm之間，內(nèi)中膜厚度0.04 cm，頸總動脈流速16.7 cm/s。模型組頸總動脈內(nèi)徑在0.19～0.21 cm之間，內(nèi)中膜厚度0.08 cm，頸總動脈流速10.51 cm/s。西藥組頸總動脈內(nèi)徑在0.25～0.31 cm之間，內(nèi)中膜厚度<0.08 cm，頸總動脈流速25.9 cm/s。中藥組頸總動脈內(nèi)徑在0.25～0.31 cm之間，內(nèi)中膜厚度<0.08 cm，頸總動脈流速28.33 cm/s。見圖1。

注：A：模型組；B：假手術組；C：西藥組；D：中藥組

圖1 45天頻譜多普勒測定兔左頸總動脈的收縮期峰值流速

第90天，假手術組內(nèi)中膜厚度增厚，頸總動脈流速18.58 cm/s。模型組內(nèi)中膜厚度增厚，頸總動脈流速15.76 cm/s。西藥組內(nèi)中膜厚度未增厚，頸總動脈流速22.89 cm/s。中藥組內(nèi)中膜厚度未增厚，頸總動脈流速33.03 cm/s。見圖2。

注：A：模型組；B：假手術組；C：西藥組；D：中藥組

圖2 90天頻譜多普勒測定兔左頸總動脈的收縮期峰值流速

2.2 各組兔頸動脈病理改變情況

第45天，正常組頸總動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞連續(xù)性好且排列規(guī)整，未見脂質條紋形成；假手術組可看做單純高脂飼料造模法，頸動脈內(nèi)膜較正常組稍增厚，內(nèi)皮細胞連續(xù)性良好，排列規(guī)整，未見脂質條紋形成，血管壁無明顯變化。與假手術組相比，模型組內(nèi)皮細胞排列紊亂，可見大量泡沫細胞蓄積，局部管壁增粗、膨隆、變色，部分內(nèi)膜可見大小不等的圓形或條紋狀的脂質斑塊。與模型組相比，西藥組、中藥組可見內(nèi)膜相對排列規(guī)整，僅有少量泡沫細胞蓄積，平滑肌細胞排列整齊，血管壁無明顯變化，無脂質沉著。見圖3。

第90天，模型組可見增厚的內(nèi)膜，內(nèi)彈力板中斷、消失，大量的泡沫細胞、脂質及炎細胞浸潤內(nèi)膜，形成明顯的脂質斑塊，中膜明顯萎縮，平滑肌細胞排列紊亂伴隨大量膠原沉積。假手術組內(nèi)膜增厚，不光滑，內(nèi)皮細胞排列紊亂，可見少量部分泡沫細胞蓄積。西藥組和中藥組的少量內(nèi)膜增生，未見明顯的沉積脂質，僅有少量內(nèi)膜增生性改變；內(nèi)膜整齊的排列著梭形或橢圓形的平滑肌細胞，胞漿為嗜酸性紅染，中藥組內(nèi)膜僅有少量點狀突起，西藥組無明顯變化，結締組織未見異常變化，未見明顯脂質沉積。見圖4。

2.3 各組血清中MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA變化情況

第45天，與假手術組比較，模型組兔血清中MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA水平明顯升高(P<0.05)，TIMP-1水平下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，說明高脂飲食合并球囊損傷術的造模方式較單純的高脂飲食造模方式效果更好，第90天時差距更加明顯。第45天及第90天，中藥組家兔血清與模型組比較，MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA水平明顯下降(P<0.05)，TIMP-1水平明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。中藥組與西藥組結果無明顯差異(P>0.05)，表明單純中藥干預可有效改善疾病情況，效果與單純使用阿托伐他汀干預差別不大。結果見表1、表2。

注：A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：西藥組；E：中藥組

注：A：假手術組；B：模型組；C：西藥組；D：中藥組

表1 45天各組血清MMP-1、MMP-2、TIMP-1、PD-ECGF、UA水平

注： 與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 90天各組血清MMP-1、MMP-2、TIMP-1、PD-ECGF、UA水平

注： 與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

在AS的發(fā)展過程中，“內(nèi)皮損傷反應學說”[4]認為AS的始動因素為動脈壁內(nèi)皮損傷[5]。血管壁在各種刺激因素下受到損傷，繼發(fā)了炎性反應，在此過程中，黏附于內(nèi)皮細胞損傷處的血小板、吞噬細胞、內(nèi)皮細胞釋放多種生長因子，刺激平滑肌細胞進入內(nèi)膜并迅速增殖，低密度和極低密度脂蛋白增多，并進入內(nèi)膜，伴隨一系列的炎癥反應，引起MMPS活化，改變細胞外基質降解，使蛋白質沉積，血管壁及內(nèi)膜的成分和結構改變，形成了AS。

血管重塑(vascular remodeling，VR)是指血管的直徑發(fā)生慢性變化或血管壁的結構發(fā)生改變，分為正性重塑和負性重塑。AS血管在發(fā)生重塑時，主要是損傷后的血管通過炎性反應造成的。VR參與并影響了AS的發(fā)生、發(fā)展和結局。VR是在血流動力學改變、內(nèi)皮細胞的氧化還原反應等因素刺激下，血管產(chǎn)生的一系列代償效應，伴隨著血管外膜成纖維細胞和中膜的平滑肌細胞的改變。在這一過程中，內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡，逐漸形成新的內(nèi)膜，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)也發(fā)生降解，血管的組織、形態(tài)和幾何學結構發(fā)生變化。AS過程中脂代謝紊亂增加體內(nèi)氧化應激反應，ECM代謝失衡，心血管結構重塑、功能受損。血流對血管的剪切力也發(fā)生改變，血管內(nèi)皮受損，黏附聚集于血管壁的血小板釋放多種生長因子；受損血管壁處中性粒細胞、單核/巨噬細胞等滲透性增加，繼發(fā)的炎癥反應導致了MMPs及TIMPs活性改變。UA含量提高伴隨AS發(fā)展互相影響。

ECM降解平衡易被MMP-1活化打破[6]；在AS過程中，MMP-1被激活而高度表達，加重了炎癥反應，且促進炎癥因子釋放，降解斑塊纖維帽，破壞斑塊的穩(wěn)定性，且預示著活躍的VR。MMP-2針對降解Ⅳ型膠原，促使平滑肌細胞進入內(nèi)膜，參與了內(nèi)膜的增生，改變內(nèi)膜厚度，降解包繞在中層平滑肌的ECM，促進中層平滑肌細胞內(nèi)遷，分泌更多的ECM，為AS形成斑塊提供條件；TIMP-1是MMP-1和MMP-2的抑制劑，有效抑制MMP-1和MMP-2活性；調(diào)節(jié)組織受損時ECM的蓄積，恢復ECM降解平衡[7]，且MMPs/TIMP的值對AS的活躍程度更為敏感，值得進一步研究。PD-ECGF導致血管堵塞，通過誘導內(nèi)皮細胞增殖[8]，促進內(nèi)皮細胞及平滑肌的遷移，加重VR嚴重程度。UA可促進低密度脂蛋白的氧化和脂質過氧化，使脂質蓄積，代謝失衡；高濃度的UA直接損傷血管，刺激血管壁炎癥反應，加速斑塊形成，加快加重AS的進程[9]。

已有大量相關文獻[10-12]證實，單純給予兔模型高脂飲食45天后，兔血中總膽固醇水平即可大量增高，血脂含量明顯升高。球囊損傷術后血管內(nèi)皮細胞層被損傷，脂質更易沉積在血管壁而形成斑塊。本實驗采用聯(lián)合高脂飲食和球囊損傷頸動脈內(nèi)膜建立AS兔模型，共選取手術54只，選擇術后第45天、90天2個節(jié)點。45天觀察動物30只，90天觀察動物24只。實驗結果可見，通過調(diào)脂通脈方干預，明顯減少了頸總動脈內(nèi)膜的脂肪含量，超聲顯示內(nèi)中膜厚度未見增厚，峰值速度增加，推測其可調(diào)節(jié)血管重塑相關因子而調(diào)節(jié)AS。ELISA結果顯示，與模型組比較，調(diào)脂通脈中藥可有效減少血清MMP-1、MMP-2、PD-ECGF、UA含量，增加TIMP-1含量，與西藥組無明顯差異，改善內(nèi)膜細胞的排列，控制內(nèi)膜細胞增生，從而調(diào)節(jié)VR。

中醫(yī)學把動脈粥樣硬化歸屬于“痰凝”“血瘀”的范疇當中，證屬氣血虧虛，痰瘀阻絡，病系本虛標實，病機為因虛致實，因實致虛，虛實夾雜。脾失健運通常為AS的始動因素，脾為后天之本，脾虛不運，氣血生化乏源，脾為生痰之源，痰濁內(nèi)生，瘀阻絡脈，成痰瘀互阻之勢。針對病機當從脾胃論治，補氣健脾，活血化痰[13]，化解膠結日久之痰濁、瘀血，通利血脈。調(diào)脂通脈方中黃芪和當歸，取當歸補血湯之補氣生血，以補本虛，祛瘀生新；當歸入心、肝、脾經(jīng)，補血活血，既為補血之圣藥，又可活血和血，配伍黃芪補氣健脾，祛邪先扶正。血行不利，而成瘀血，久之則脈道不利，痰濁瘀血叢生。葉桂云“每取蟲蟻迅速飛走諸靈，俾飛者升，走者降，血無凝著，氣可宣通”，遂用地龍通絡，并引諸藥歸經(jīng)；配合三七粉活血化瘀，祛瘀通絡，山楂行血行氣；再伍入利濕消痰、活血化瘀的澤瀉及決明子共奏補氣活血，通絡導滯之功。

從藥理學角度講，黃芪多糖可明顯降低血清中總膽固醇、丙二醛、三酰甘油和內(nèi)皮縮血管肽的含量，減輕內(nèi)皮縮血管肽對血管造成的損傷[14]，降低血管炎性反應；當歸的有效成分阿魏酸鈉，可降低血漿甘油三酯水平，改善高脂血癥引起的內(nèi)皮細胞損傷；此外，當歸有效成分能增加對細胞內(nèi)氧自由基的吸收，抑制血小板聚集和血管平滑肌增殖[15]。三七的有效成分三七總皂苷能減輕有害因子對內(nèi)皮細胞的損傷，三七總黃酮能促進血液中高密度脂蛋白成倍增加，與血液中的“毒素”發(fā)生中和，軟化血管[16]。地龍的活性成分可降血脂并加強膽固醇的轉化與排泄[17]；山楂的主要成分能通過多通路的協(xié)調(diào)作用發(fā)揮抗AS作用[18]；澤瀉可促進NO的合成，以舒張血管，通過升高超氧化物歧化酶對抗氧自由基，對血管內(nèi)皮細胞有一定的保護作用[19]；蒽醌糖苷是決明子發(fā)揮增加膽固醇吸收作用的主要成份，此外決明子中的酚類化合物能夠抗氧化，防止氧化低密度蛋白聚集[20]。

由此可得出，調(diào)脂通脈方扶正固本，補氣活血，化瘀通絡，標本兼治，從治病求本的理念上治療動脈粥樣硬化，為臨床用藥提供參考及思路。

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(本文編輯： 禹佳)

Influences ofTiaozhiTongmaiformula on vascular remodeling in rabbits with atherosclerosis

SUZhaoduo，GUOShuwen，ZHANGLu，etal.

BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

GUOShuwen,E-mail:guo1163@163.com

Objective To investigate the regulatory mechanism ofTiaozhiTongmaiformula on vascular remodeling related factors in rabbits with atherosclerosis. Method The rabbit model of atherosclerosis was established by high fat diet and balloon injury. 54 rabbits were randomly divided into normal group, model group, sham operation group, atorvastatin group and Chinese medicine group. Except the rabbits in normal group, the remaining four groups to choose the observation point at 45 day and 90 day after treatment. At 45 days, 30 animals were observed. At 90 days, 24 animals were observed. The lumen diameter and the intima-media thickness and the peak systolic velocity was measured by ultrasound. The common carotid arteries were observed by pathology. The levels of matrix metalloproteinases (MMP-1, MMP-2), tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1), platelet derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) and uric acid was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Result There are two time points, the expression levels of MMP-1, MMP-2, PD-ECGF and UA in the model group were significantly higher than those in the sham operation group (P<0.01), TIMP-1 was lower than that in sham operation group(P<0.01). The serum levels of MMP-1, MMP-2, PD-ECGF and UA in theTiaozhiTongmaformula group was significantly lower than those in the model group(P<0.01), the level of TIMP-1 was significantly increased(P<0.01), there was no significant difference from atorvastatin group. ConclusionsTiaozhiTongmaiformula can reduced the level of MMP-1, MMP-2,PD-ECGF, UA, and increase the level of TIMP-1, therefore influence the vascular remodeling to improve atherosclerosis, this may be the mechanism of its.

TiaozhiTongmaiformula; Atherosclerosis; Vascular remodeling

國家國際科技合作專項(2011DFA33040)

100029 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院[蘇兆鐸(碩士研究生)、郭書文、張璐、武建功、吳佳妮、陳曦、劉文臣、馬如風]；北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院皮膚科(馬卉)；中日友好醫(yī)院超聲診斷科(鄭敏)

蘇兆鐸(1990- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結合防治心血管疾病。E-mail:suzhaoduo@126.com

郭書文(1965- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：中西醫(yī)結合防治心血管疾病。E-mail:guo1163@163.com

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10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.011

2016-11-05)