熱性驚厥患兒人類(lèi)皰疹病毒6型感染的檢測(cè)分析

孫巖+王鋒+于靜+馬蘭紅+古麗比亞+余亮+羅新輝+孫荷

摘要：目的 了解熱性驚厥患兒人類(lèi)皰疹病毒6型（HHV-6）的感染情況。方法 采集患兒血清及腦脊液樣本，采用間接免疫熒光法檢測(cè)樣本中的HHV-6 IgM、IgG抗體，采用巢氏PCR法檢測(cè)樣本中的HHV-6 DNA。結(jié)果 熱性驚厥患兒血清HHV-6 IgM陽(yáng)性率為17.00%（9/53），IgG陽(yáng)性率為66.00%（35/53）；腦脊液HHV-6 IgM和IgG均未檢出陽(yáng)性。血清樣本中，HHV-6 DNA擴(kuò)增陽(yáng)性率為18.90%（10/53），其中有7例IgM為陽(yáng)性，95份腦脊液樣本均未擴(kuò)增出HHV-6 DNA。結(jié)論 熱性驚厥和HHV-6感染可能有相關(guān)性，但本研究?jī)H在部分熱性驚厥患兒血清中查出HHV-6 IgM或HHV-6 DNA，腦脊液樣本均未查出HHV-6 IgM或HHV-6 DNA，因此本研究未能證實(shí)HHV-6的噬神經(jīng)特點(diǎn)，有待加大樣本量進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：兒童；熱性驚厥；皰疹病毒6型

Abstract：Objective To investigate the effects of febrile seizures in children with human herpes simplex virus type 6（HHV-6）infection.Methods Serum and CSF samples were collected and detected by indirect immunofluorescence assay in samples of HHV-6 IgM，IgG antibody，using nested PCR method to detect the samples of HHV-6 DNA.Results the positive rate of serum HHV-6 in children with febrile convulsion（9/53）of IgM was 17.00%， IgG positive rate was 66.00%（35/53）；Cerebrospinal fluid HHV-6 IgM and IgG were not detected positive.The positive rate of HHV-6 DNA amplification was 18.90%（10/53）in serum samples.Among them，IgM was positive in 7 cases and HHV-6 DNA was not amplified in 95 cerebrospinal fluid samples.Conclusion Febrile convulsion and HHV-6 infection may have a correlation，but only part of this study in the serum of children with febrile convulsion was found in HHV-6 IgM or HHV-6 DNA，cerebrospinal fluid samples were not found in HHV-6 IgM or HHV-6 DNA，so this study failed to confirm the neuronophagia characteristics of HHV-6，to add a large sample of further research.

Key words：Children；Febrile convulsion；Herpesvirus 6

1986年Sslahuddin等發(fā)現(xiàn)了一種具有皰疹病毒形態(tài)和嗜淋巴細(xì)胞的新病毒，最初認(rèn)為該病毒只感染新鮮分離的B淋巴細(xì)胞，曾被命名為人嗜B淋巴細(xì)胞病毒，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)它與皰疹病毒科中的其它病毒抗原性和酶切圖譜不同，故更名為人皰疹病毒6型（Human herpesvirus-6， HHV-6），此后世界各地又陸續(xù)分離出一些毒株，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HHV-6分為兩個(gè)亞型，即A組（GS株）和B組（Z29株）[1]。HHV-6屬于人類(lèi)皰疹病毒 亞族，這一亞族病毒的細(xì)胞感染范圍廣，致病性尚未完全了解，其感染與臨床上許多疾病有關(guān)，如幼兒急疹、慢性疲勞綜合征等[2]，有研究表明，部分3歲以內(nèi)患兒伴發(fā)熱的嚴(yán)重驚厥或擬似腦炎與HHV-6感染相關(guān)[3]。本研究通過(guò)了解熱性驚厥患兒HHV-6感染情況，探討患兒熱性驚厥與HHV-6感染的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料 2010年9月～2015年3月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院兒科就診的高熱驚厥兒童共95例，其中腦脊液和血清標(biāo)本都有的53例，其它42例僅有腦脊液（未收集到血清），其中男童48例，女童47例；維吾爾族52例，漢族26例，回族8例，哈薩克族9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡為新生兒～14歲，有高熱驚厥癥狀；排除標(biāo)準(zhǔn)：被診斷為結(jié)核性腦炎、細(xì)菌性腦炎及非感染性腦炎患兒。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集 在發(fā)熱3 d內(nèi)采集患兒靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉無(wú)菌抗凝，分離血清，4℃保存?zhèn)溆?；腦脊液標(biāo)本的收集：留取2 ml以上腦脊液放入無(wú)菌試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 采用間接免疫熒光法檢測(cè)患兒血清及腦脊液中HHV-6 IgM、IgG抗體，間接免疫熒光法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自歐盟醫(yī)學(xué)診斷（中國(guó)）有限公司，將血清或腦脊液用吸附劑按1：10稀釋?zhuān)靹蚝?，點(diǎn)于載玻片上，37 ℃溫育90 min，用PBS洗3次，加入含有伊文斯藍(lán)的熒光素標(biāo)記抗人IgM或IgG FITC結(jié)合物，37℃孵育30 min，用PBS洗3次，用蒸餾水脫去鹽分1次。風(fēng)干后封片，在熒光顯微鏡下讀片，放大倍數(shù)400倍，熒光顯微鏡下細(xì)胞膜、胞漿或細(xì)胞核可見(jiàn)綠色熒光判為陽(yáng)性，試劑盒提供陽(yáng)性及陰性對(duì)照做質(zhì)控。血清和腦脊液的IgM、IgG均按照1：10滴度進(jìn)行檢測(cè)。

采用巢氏PCR法檢測(cè)所有樣本中HHV-6 DNA。試劑盒提取血清及CSF中HHV-6 DNA，置-20℃?zhèn)溆?，根?jù)HHV-6大衣殼蛋白基因（LTP gene）的DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，各引物序列，見(jiàn)表1。外（內(nèi)）引物PCR反應(yīng)體系為：上游引物10 μmol，下游引物10 μmol，Taq DNA聚合酶 1U，dNTP 20 mmol，Mgcl2 30 mmol，10×PCR Buffer 2.5 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。外引物、內(nèi)引物PCR的反應(yīng)參數(shù)均為：94℃預(yù)變性5 min；（94℃ 35 s，55℃ 45 s ，72℃ 55s），共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸8min，取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見(jiàn)表1。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用EXECL2003和SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理。

2結(jié)果

2.1間接免疫熒光法 熱性驚厥患兒血清HHV-6 IgM陽(yáng)性率為17.00%（9/53），IgG陽(yáng)性率為66.00%（35/53）；腦脊液HHV-6 IgM和IgG均未檢出陽(yáng)性。

2.2巢氏PCR法 取10 μl PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90V 30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶并拍照，外引物PCR產(chǎn)物片段為287 bp，內(nèi)引物PCR產(chǎn)物片段為163 bp，見(jiàn)圖1。

53例血清中，巢氏PCR陽(yáng)性10例，陽(yáng)性率為18.9%，其中8例年齡在1歲以下，10例中有7例的間接免疫熒光法結(jié)果為陽(yáng)性，提示巢氏PCR法敏感性高于間接免疫熒光法。95例腦脊液樣本均未擴(kuò)增出HHV-6 DNA。

3討論

兒童熱性驚厥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、感染、免疫、發(fā)熱等有關(guān)。首次熱性驚厥患兒年齡在2個(gè)月～6歲，發(fā)病高峰期是1～2歲，呼吸道感染、幼兒急診、急性中耳炎與熱性驚厥的發(fā)生有關(guān)，孫冬青等報(bào)道94.70%的首次熱性驚厥患兒患有呼吸道感染或幼兒急疹，首次熱性驚厥患兒與HHV-6感染合并率為34.7%[4]，本研究在18.90%的熱性驚厥患兒中擴(kuò)增出了HHV-6 DNA，其中的大部分患兒都<1歲，提示HHV-6感染與熱性驚厥的發(fā)生相關(guān)，如果<1歲的兒童首次發(fā)生熱性驚厥時(shí)，應(yīng)考慮到HHV-6感染。

國(guó)外一些研究也證實(shí)HHV-6有噬神經(jīng)的特點(diǎn)，但大部分熱性驚厥患兒只能從血液中查到HHV-6，在腦脊液中很難檢出HHV-6 DNA[5]，也有在腦脊液中檢出HHV-6 DNA的報(bào)道，如Kondo等對(duì)僅有一次熱性痙攣發(fā)作的患兒腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，HHV-6 DNA都為陰性[6]，但幼兒急疹患病后熱性痙攣反復(fù)發(fā)作3次以上者，腦脊液中HHV-6 DNA檢出率很高，據(jù)此他推測(cè)HHV-6在原發(fā)感染后形成潛伏感染，反復(fù)的熱性驚厥可能與潛伏的HHV-6被激活有關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，熱性驚厥與HHV-6感染有相關(guān)性，但僅在部分熱性驚厥病例血清中查出HHV-6 IgM抗體或HHV-6 DNA，在滴度為1：10時(shí)95例熱性驚厥患兒腦脊液IgG抗體均為陰性，且通過(guò)巢氏PCR檢測(cè)所有腦脊液中均未擴(kuò)增出HHV-6 DNA，因此本研究未能證實(shí)HHV-6的噬神經(jīng)特點(diǎn)，有待加大樣本量進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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[4]張冬青，孫若鵬.首次熱性驚厥與人皰疹病毒6型感染的關(guān)系[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，46（2）：185-187.

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編輯/李樺