氟對小鼠MC3T3-E成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO濃度的影響

邢艷剛，張丹丹，張文艷，周文麗，閻小艷，5

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031；3.深圳大學(xué)生物科技學(xué)院，廣東深圳518000；4.華南師范大學(xué)生物科技學(xué)院，廣東廣州510000；5.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生系，山西太原030001）

氟對小鼠MC3T3-E成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO濃度的影響

邢艷剛1，張丹丹2，張文艷3，周文麗4，閻小艷1，5

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031；3.深圳大學(xué)生物科技學(xué)院，廣東深圳518000；4.華南師范大學(xué)生物科技學(xué)院，廣東廣州510000；5.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生系，山西太原030001）

為了探究不同濃度的氟化鈉對小鼠MC3T3-E成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO濃度以及細(xì)胞凋亡的影響，建立細(xì)胞梯度染氟模型，獲取MTT細(xì)胞增殖曲線；通過DAPI和HE染色觀察細(xì)胞核及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；運(yùn)用熒光探針Fluo-3 AM和DAF-FMDA標(biāo)記染氟成骨細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀測定成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO濃度變化。結(jié)果表明，隨著氟濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞增殖率降低，成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO的濃度增加，高氟長時(shí)間作用會(huì)使細(xì)胞生命活性降低，生理反應(yīng)減弱或缺失，從而影響Ca2+，NO的濃度。試驗(yàn)證明，高氟通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO的濃度抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

氟；成骨細(xì)胞；Ca2+；NO

氟是機(jī)體維持正常新陳代謝不可缺少的微量元素之一，但如果長期攝入過量氟會(huì)使機(jī)體發(fā)生氟中毒。氟中毒是一種慢性全身性疾病，主要形成氟斑牙和氟骨癥[1]。慢性氟中毒可引發(fā)骨硬化、骨軟化、骨質(zhì)疏松、軟組織化骨以及軟骨和關(guān)節(jié)等不同性質(zhì)的病變[2-4]。氟對骨骼系統(tǒng)的損害作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，但是關(guān)于高氟致成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制仍不清楚。Ca2+和NO在引發(fā)細(xì)胞凋亡過程中具有重要的信號(hào)分子作用，國內(nèi)外的一些文獻(xiàn)對此都有論述，GAO等[5]、馬軼杰等[6]、CHAO等[7]、ELROD等[8]、SHARP等[9]、LIU等[10]都已探討過鈣離子和NO對細(xì)胞的作用，但Ca2+和NO在氟致成骨細(xì)胞毒性中起什么作用及其機(jī)制尚不清楚。

本試驗(yàn)通過建立氟對成骨細(xì)胞作用的體外模型，運(yùn)用MTT法測定氟對成骨細(xì)胞增殖的影響，通過HE和DAPI染色觀察氟對成骨細(xì)胞形態(tài)，用熒光探針Fluo-3 AM和DAF-FM DA標(biāo)記染氟成骨細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測氟致小鼠成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+和NO的濃度變化，以探究氟誘導(dǎo)的小鼠成骨細(xì)胞凋亡過程中Ca2+，NO的濃度變化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株MC3T3-E1 Subclone 14小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14細(xì)胞株（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.1.2 主要溶液胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，0.5% MTT，無Ca2+和Mg2+的無菌PBS緩沖液，DAF-FM DA稀釋液，F(xiàn)luo-3 AM。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氟對成骨細(xì)胞作用的體外模型的影響用含有10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1 Subclone 14小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14細(xì)胞，置于5%CO2培養(yǎng)箱，每3 d換液一次。細(xì)胞密度大于95%時(shí)，用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行后續(xù)測定。

1.2.2 氟對小鼠成骨細(xì)胞形態(tài)的影響細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。48 h后棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌，換不同質(zhì)量濃度NaF（0，5，10，30 mg/L）處理，72 h后進(jìn)行HE和DAPI染色。分別在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT法測成骨細(xì)胞增殖率貼壁細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔板，不同質(zhì)量濃度NaF（0，1，5，10，30 mg/L）處理，隔天換液。分別于藥物處理24，48，72，96 h后加入0.5%MTT，20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜（DMSO），用自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm處測定OD值。

1.2.4 氟誘導(dǎo)對小鼠成骨細(xì)胞Ca2+，NO水平的影響細(xì)胞接種于含10%胎牛血清培養(yǎng)液中。細(xì)胞貼壁后，不同質(zhì)量濃度NaF（0，5，10，30 mg/L）作用72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1×106個(gè)/mL。Ca2+和NO測定分別加入10 μL Fluo-3 AM稀釋液和10 μL DAF-FMDA稀釋液混勻；37℃避光孵育20 min；1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟誘導(dǎo)對小鼠成骨細(xì)胞形態(tài)的影響

2.1.1 HE染色由圖1可知，對照組細(xì)胞形態(tài)自然，細(xì)胞核完整呈卵圓形；5 mg/LNaF作用72 h后，對成骨細(xì)胞影響不明顯，少數(shù)細(xì)胞的胞質(zhì)濃縮（圖2）；當(dāng)10 mg/LNaF作用時(shí)，一些細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的胞質(zhì)濃縮（圖3）；當(dāng)高濃度30 mg/L NaF作用時(shí)表現(xiàn)出明顯的毒性，很多細(xì)胞核膜破裂（圖4）。

2.1.2 DAPI染色由圖5可知，對照組細(xì)胞核完整，細(xì)胞生長旺盛；5 mg/LNaF作用72 h后，對細(xì)胞影響不明顯，少數(shù)細(xì)胞的胞核固縮（圖6）；10 mg/L NaF作用后，一些細(xì)胞細(xì)胞核固縮，有少量核分裂（圖7）；30 mg/LNaF作用時(shí)，表現(xiàn)出明顯的毒性，很多細(xì)胞核固縮，核分裂，有凋亡小體的形成（圖8）。

2.2 氟對體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

氟作用24，48，72 h后，較高質(zhì)量濃度的氟（30 mg/L）對成骨細(xì)胞增殖率有明顯抑制作用，且差異極顯著（P＜0.01）；10 mg/L氟作用24，48，72 h后，也明顯抑制成骨細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；而較低質(zhì)量濃度的氟（1，5 mg/L）對成骨細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。作用96 h后，5，10，30 mg/L氟均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且差異極顯著（P＜0.01），隨氟濃度的增加抑制作用增強(qiáng)（表1）。

表1 氟對成骨細(xì)胞增殖（M77法）的影響

2.3 氟誘導(dǎo)對小鼠成骨細(xì)胞Ca2+水平的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，經(jīng)5 mg/L氟化鈉處理72 h后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增加，大約是對照組的3倍；10，30 mg/L氟化鈉處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度也有所增加，約為對照組的1.5倍，但不明顯（圖9），可能是由于成骨細(xì)胞在高氟的長時(shí)間作用下，細(xì)胞活性降低，生理反應(yīng)減弱或缺失，說明氟化鈉可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+水平升高。

2.4 氟誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞NO的分析

流式細(xì)胞儀檢測，經(jīng)5，30mg/L氟化鈉處理72 h后，成骨細(xì)胞發(fā)出了亮綠色的熒光，與對照組相比，約為對照組的1.2倍。10 mg/L處理72 h后熒光強(qiáng)度明顯較對照組增強(qiáng)，約為對照組的2倍（圖10）。說明氟化鈉可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞胞內(nèi)NO水平升高。

3 討論

3.1 氟誘導(dǎo)對小鼠成骨細(xì)胞形態(tài)的影響

成骨細(xì)胞是氟進(jìn)入機(jī)體的主要靶細(xì)胞之一，近年來研究表明，長期氟暴露對成骨細(xì)胞增殖會(huì)產(chǎn)生一定影響[11]，但Ca2+和NO對成骨細(xì)胞的影響機(jī)制仍不清楚。本試驗(yàn)中，通過建立成骨細(xì)胞染氟模型（0，5，10，30 mg/L），觀察成骨細(xì)胞形態(tài)的變化。隨著氟濃度的升高，小鼠成骨細(xì)胞的病理損傷逐漸加重，高氟組損傷最明顯，胞膜破裂，胞質(zhì)濃縮、核膜破裂，核固縮。DAPI染色顯示，隨著氟濃度的升高，小鼠成骨細(xì)胞發(fā)生了顯著的細(xì)胞核變，高氟組大多數(shù)細(xì)胞核固縮，核分裂，有凋亡小體的形成，表明高氟能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡跡象。

3.2 氟對體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

郭曉東等[12]利用氟誘導(dǎo)成骨細(xì)胞MC3T3-E1，表明氟能明顯抑制成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、誘發(fā)細(xì)胞凋亡，其抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性。本試驗(yàn)利用MTT法檢測成骨細(xì)胞生長情況，結(jié)果表明，氟短期作用成骨細(xì)胞時(shí)，低劑量氟對細(xì)胞的增殖沒有影響，高劑量的氟對成骨細(xì)胞主要表現(xiàn)為抑制作用。隨著染氟時(shí)間的延長，低劑量氟對成骨細(xì)胞的增殖也出現(xiàn)抑制的情況。說明氟對成骨細(xì)胞的增殖作用呈現(xiàn)時(shí)間相關(guān)性。

3.3 氟誘導(dǎo)對小鼠成骨細(xì)胞Ca2+水平的測定

Ca2+作為一種重要的第2信使，在細(xì)胞生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，胞漿或線粒體內(nèi)Ca2+超載是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的起始因素，同時(shí)通過直接或間接激活可觸發(fā)細(xì)胞凋亡多種酶，引起細(xì)胞凋亡。通常，逆境脅迫可導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度升高，而高濃度的Ca2+又導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，甚至凋亡[13]。王俊玲等[14]對氟致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究表明，過量氟會(huì)刺激Ca2+濃度增多。本試驗(yàn)表明，在NaF處理后，成骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高，可能是因?yàn)镹aF進(jìn)入細(xì)胞后激活了質(zhì)膜上的Ca2+通道，導(dǎo)致胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)較高Ca2+濃度可激活Ca2+依賴性酶，使DNA發(fā)生斷裂，細(xì)胞骨架破壞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；或者通過誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS上升使細(xì)胞凋亡。此外，Ca2+還可通過刺激PTP開放或cyt c釋放，進(jìn)而激活下游的細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。本試驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高或下降可引起細(xì)胞凋亡，由此推測，Ca2+濃度失衡是氟誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的重要原因。氟致成骨細(xì)胞凋亡發(fā)生在Ca2+濃度失衡的狀況下。

3.4 氟誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞NO的分析

NO是骨重構(gòu)過程中一個(gè)重要的信號(hào)分子，它既可作用于破骨細(xì)胞抑制骨吸收，還可以作用于成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成，NO是L-精氨酸和分子氧在NOS作用下生成的一種自由基，在很多生理或病理過程中起著信號(hào)分子的作用。很多研究表明，氟誘導(dǎo)可使細(xì)胞內(nèi)NO濃度增加。LOREDANA等[16]研究了氟致成骨細(xì)胞毒性作用；MESQUITA等[17]研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞凋亡過程中NO水平顯著升高；顏凌等[18]研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS、培養(yǎng)液內(nèi)NO含量增加，且與時(shí)間、劑量相關(guān)。本試驗(yàn)利用NO熒光指示劑DAF-FMDA檢測了成骨細(xì)胞內(nèi)的NO水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10 mg/L氟化鈉作用72 h后，成骨細(xì)胞內(nèi)NO水平顯著升高，可能是由于氟化鈉進(jìn)入生物體內(nèi)，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)Ca2+濃度升高，激活NOS，NOS在誘導(dǎo)刺激下催化L-精氨酸能力加強(qiáng)，迅速產(chǎn)生大量的NO，最終導(dǎo)致胞內(nèi)NO水平升高。表明氟在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的過程中，NO的升高產(chǎn)生重要作用。

4 結(jié)論

本研究在模擬氟中毒試驗(yàn)中，通過對小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行HE和DAPI染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著氟濃度的升高，小鼠成骨細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核均發(fā)生了顯著的病理變化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的氟可以導(dǎo)致胞質(zhì)形變及細(xì)胞核固縮或分裂，形成凋亡小體。高氟的刺激，使成骨細(xì)胞做出應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+，NO的濃度增加，證明氟作用小鼠成骨細(xì)胞，通過增加Ca2+，NO的濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而氟長時(shí)間的作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至失去應(yīng)激能力，無法產(chǎn)生Ca2+，NO?？傊?，高氟會(huì)對成骨細(xì)胞造成一定的損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且Ca2+，NO在此過程中起著重要的作用。但是Ca2+，NO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體途徑還不清楚以及氟誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的主要途徑還有待探究。

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Effects of Fluorine on the Concentration of Ca2+and NO in MC3T3-E Osteoblast of Mice

XINGYangang1，ZHANGDandan2，ZHANGWenyan3，ZHOUWenli4，YANXiaoyan1，5
（1.College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.College ofBiological Science and Technology，Shenzhen University，Shenzhen 518000，China；4.College ofBiological Science and Technology，Huanan Normal University，Guangzhou 510000，China；5.Department ofPublic Health，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China）

To explore the effects ofdifferent concentrations ofsodium fluoride on the cell morphology,the concentration of Ca2+and NO in mice MC3T3-E osteoblast,the sodium fluoride concentration gradient model was established.According to the growth curve of MTT,the effect offluoride on the proliferation ofosteoblasts was determined.DAPI and HE stainingwere used toobserve the nucleus and morphology changes.Using fluorescent probes Fluo-3 AM and DAF-FM DA labeled with fluoride osteoblasts and changes in the concentration of Ca2+and NO in osteoblasts were tested by flow cytometry.The results showed that with the increase of fluoride concentration,the cell proliferation rate decreased and the cell morphology was more variable,cytoplasmic condensation and nuclear condensation.The concentration of NO and Ca2+in osteoblast increased.The long time effect of high fluoride can decrease the activity of cell and the physiological reaction,which can affect the concentration of Ca2+and NO.This study suggests that high concentration of fluoride can inhibit cell proliferation,change the cell morphology and cell apoptosis by increasing the concentration ofCa2+and NO in the cell.

fluorine;osteoblasts;Ca2+;NO

R599.9

：A

：1002-2481（2017）06-0940-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.19

2017-05-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31240009，31302158）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2012-079）；山西省科技廳軟科學(xué)項(xiàng)目（2013041084-03）

邢艷剛（1989-），男，山西太原人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)代謝調(diào)控與食品質(zhì)量安全。閻小艷為通信作者。