磁珠提取法和離心柱提取法在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)中幽門螺桿菌核酸提取效果的對(duì)比研究

彭賢慧，周麗雅，何利華，宋志強(qiáng)，張建中

·論著·

磁珠提取法和離心柱提取法在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)中幽門螺桿菌核酸提取效果的對(duì)比研究

彭賢慧1，2，周麗雅3，何利華1，2，宋志強(qiáng)3，張建中1，2

目的 比較磁珠提取法和離心柱提取法在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中幽門螺桿菌(HP)核酸提取效果、重復(fù)性及臨床標(biāo)本檢測(cè)能力。方法 將100～10-6系列梯度稀釋的HP標(biāo)準(zhǔn)菌株作為模板，分別采用磁珠提取法和離心柱提取法平行提取HP核酸，比較兩種提取方法的核酸提取效果、變異系數(shù)(CV)；將35份胃液標(biāo)本作為模板，分別采用磁珠提取法和離心柱提取法平行提取HP核酸，比較兩種提取方法對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)能力。結(jié)果 兩種核酸提取方法提取100、10-5濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CT值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；離心柱提取法提取10-1、10-2、10-3、10-4、10-6濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CT值低于磁珠提取法(P<0.05)。兩種提取方法提取HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CV比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩種提取方法提取胃液HP核酸的CT值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 磁珠提取法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的HP核酸提取效果優(yōu)于離心柱提取法，而其重復(fù)性及臨床樣本檢測(cè)能力與離心柱提取法相當(dāng)。

聚合酶鏈反應(yīng)；幽門螺桿菌；磁珠提取法；離心柱提取法

彭賢慧，周麗雅，何利華，等.磁珠提取法和離心柱提取法在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)中幽門螺桿菌核酸提取效果的對(duì)比研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2017，25(4)：51-55.[www.syxnf.net]

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幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)是導(dǎo)致慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌等胃腸道疾病的重要病原體。近年研究發(fā)現(xiàn)，HP感染可能還與胃腸道之外疾病密切相關(guān)，特別是心血管疾病[1-3]和腦血管疾病[4-6]；此外，cagA基因型HP感染與冠心病發(fā)病有關(guān)[7]。因此，早期準(zhǔn)確檢測(cè)特定基因型HP并給予及時(shí)有效的治療對(duì)預(yù)防心腦血管疾病具有重要的臨床意義。以往臨床篩查胃腸道疾病患者HP主要采用快速尿素酶檢測(cè)、呼氣試驗(yàn)、抗原抗體檢測(cè)等方法，但上述方法準(zhǔn)確率不高。因此，建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的HP檢測(cè)方法對(duì)開展HP與心腦血管疾病相關(guān)性研究至關(guān)重要。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確的核酸定量檢測(cè)技術(shù)，目前已廣泛用于醫(yī)學(xué)[8]、食品[9]、微生物學(xué)[10]等領(lǐng)域。核酸提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，DNA模板的濃度和純度直接影響熒光定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此選擇合適的核酸提取方法非常重要。提取核酸的傳統(tǒng)方法主要包括胍鹽裂解法[11]、堿裂解法[12]、CTAB裂解法[13]及酚抽提法[14]等，但上述核酸提取方法需大量生物樣本，且操作步驟繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)、提取效率低、自動(dòng)化程度低。隨著分子生物學(xué)及高分子材料學(xué)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)核酸提取方法已逐漸被固相吸附載體為主的新方法取代，尤其是離心柱提取法、二氧化硅基質(zhì)法、陰離子交換法及磁珠提取法等。目前，應(yīng)用較廣泛的核酸提取方法是離心柱提取法，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器依賴性高、成本昂貴，不適合大樣本篩查研究。磁珠提取法有效解決了以上問題，且磁珠提取法還具有操作步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。本研究旨在比較磁珠提取法和離心柱提取法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中HP核酸提取效果、重復(fù)性及臨床標(biāo)本檢測(cè)能力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 HP標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC26695)由傳染病所診斷室保存，培養(yǎng)48 h后采用0.85%氯化鈉溶液稀釋至濃度為OD600(OD600=1.0)，將HP標(biāo)準(zhǔn)菌株分別稀釋為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；隨機(jī)選取35份快速尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性的胃液標(biāo)本，由北京大學(xué)第三人民醫(yī)院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 EmerTher磁珠法基因組DNA提取試劑盒(上海醫(yī)脈賽科技有限公司)和QIAamp DNA Mini Kit(德國(guó)QIAGEN公司)。

1.1.3 引物與探針 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的HP引物和探針由傳染病控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，檢測(cè)靈敏度為101 copies/μl(構(gòu)建質(zhì)粒)。

1.1.4 儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Bio-Rad CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System熒光檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 胃液預(yù)處理 取1 ml胃液加入1.5 ml離心管中，加入等量Tris緩沖液(0.67 M，pH值7.4)，振蕩均勻，室溫下放置2 h。13 000 r/min離心5 min，棄上清液留沉淀。

1.2.2 離心柱提取法 按照QIAamp DNA Mini Kit說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下：(1)在經(jīng)預(yù)處理的胃液沉淀中加入180 μl 組織裂解液(ATL)和20 μl 蛋白酶K，振蕩混勻，置于金屬浴或空氣搖床中，56 ℃振蕩2 h；(2)從金屬浴或空氣搖床中取出離心管，進(jìn)行短暫離心，在離心管中加入200 μl 細(xì)胞裂解液(AL)，振蕩混勻；(3)離心管置于金屬浴中，70 ℃振蕩10 min，8 000 r/min離心10 s；(4)在離心管中加入200 μl 新鮮無水乙醇，振蕩混勻，短暫離心；(5)將離心管中的液體全部轉(zhuǎn)入到離心柱中，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，保留柱子；(6)將柱子轉(zhuǎn)入到一個(gè)新的廢液收集管中，加緩沖液AW 1 500 μl，之后8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，保留柱子；(7)將柱子轉(zhuǎn)入到一個(gè)新的廢液收集管中，加緩沖液AW 2 500 μl，之后13 000 r/min離心3 min，棄去廢液，保留柱子；(8)將柱子轉(zhuǎn)入到一個(gè)新的廢液收集管中，13 000 r/min離心1 min，將柱子轉(zhuǎn)入到一個(gè)新的1.5 ml離心管中，在生物安全柜中打開蓋晾2 min；(9)在柱子中加入100 μl DNA溶解液——buffer AE，蓋上蓋放置5 min，8 000 r/min離心1 min，收集洗脫出含DNA的液體；(10)將收集的含DNA的液體重新加入柱子中，蓋上蓋放置5 min，8 000 r/min離心1 min，收集DNA，棄去柱子，置于-80 ℃環(huán)境中保存。

1.2.3 磁珠提取法 按照EmerTher磁珠法基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下：(1)在經(jīng)預(yù)處理的胃液沉淀中加入700 μl 裂解吸附液，混合均勻，裂解細(xì)胞6 min；(2)加入50 μl磁珠懸浮液，振蕩混合10 min；(3)用磁分離架吸附磁珠，棄上清液；(4)加入1.0 ml 洗滌液I 洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清液；(5)再次加入1.0 ml洗滌液Ⅰ洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清液；(6)加入850 μl 洗滌液Ⅱ洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清液；(7)再次加入850 μl 洗滌液Ⅱ洗滌磁珠，吸附磁珠，棄上清液后靜置3～6 min，去除乙醇?xì)埩簦?8)加入 100 μl無核酶水(nuclease-free water)，混合均勻后洗脫5 min；(9)吸附磁珠，回收含基因組DNA的洗脫液至另一離心管中。以上操作均在同批實(shí)驗(yàn)中完成，提取3次取平均值。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及熱循環(huán)參數(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系采用invitrogen Platinum?Taq DNA Polymerase Kit。PCR體系為20 μl，其中10×buffer 2 μl，0.4 mM dNTP，2 mM Mg2+，0.5 mM上、下游引物，0.2 mM Taqman探針。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 45 s(采集熒光)，40個(gè)循環(huán)。采用CT值反映HP DNA含量。

1.4 觀察指標(biāo) 以100～10-6系列梯度稀釋的HP標(biāo)準(zhǔn)菌株作為模板，分別采用兩種提取方法平行提取HP核酸，比較兩種提取方法核酸提取效果、變異系數(shù)(CV)；將35份胃液標(biāo)本作為模板，分別采用兩種提取方法平行提取HP核酸，比較兩種提取方法核酸提取效果。

2 結(jié)果

2.1 兩種核酸提取方法對(duì)不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸提取效果比較 兩種核酸提取方法提取100、10-5濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CT值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；磁珠提取法提取10-1、10-2、10-3、10-4、10-6濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CT值高于離心柱提取法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。兩種核酸提取方法提取的不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的拷貝數(shù)指數(shù)見表2，將離心柱提取法提取的不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的拷貝數(shù)指數(shù)作為參照(均定義為100%)，兩種核酸提取方法提取不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的相對(duì)拷貝數(shù)指數(shù)見圖1。

2.2 兩種核酸提取方法提取HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的重復(fù)性比較 磁珠提取法提取HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CV為(1.32±0.79)，離心柱提取法提取HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CV為(0.98±0.64)，兩種提取方法提取HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CV比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.675，P=0.361，見表3)。

Table 2 Comparison of copy number index in standard strains ofH.pyloriwith different diluted concentration between the two methods

方法10010-110-210-310-410-510-6磁珠提取法7.956.665.203.582.051.040.36離心柱提取法7.907.105.834.383.351.991.45

圖1 兩種核酸提取方法提取不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸相對(duì)拷貝數(shù)指數(shù)的柱形圖

Figure 1 Column chart for relative copy number index in standard strains ofH.pyloriwith different diluted concentration between the two methods

表3 兩種核酸提取方法提取不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CV

Table 3 CV in standard strains ofH.pyloriwith different diluted concentration of the two methods

方法10010-110-210-310-410-510-6磁珠提取法1.080.582.172.032.220.490.70離心柱提取法2.041.031.180.700.211.410.31

2.3 兩種核酸提取方法臨床標(biāo)本檢測(cè)能力比較 磁珠提取法提取胃液HP核酸的CT值為(24.32±4.76)，離心柱提取法提取胃液HP核酸的CT值為(23.41±3.56)，兩種提取方法提取胃液HP核酸的CT值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.369，P=0.924)。對(duì)于HP含量較高的樣本1和樣本2，兩種核酸提取方法所得CT值無差異，但磁珠提取法熒光強(qiáng)度較高；對(duì)于HP含量較低的樣本3，離心柱提取法所得CT值稍高，但磁珠提取法熒光強(qiáng)度較高，見圖2。

表1 兩種核酸提取方法提取不同濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CT值比較±s)

注：1、2分別為磁珠提取法、離心柱提取法提取樣本1；3、4分別為磁珠提取法、離心柱提取法提取樣本2；5、6分別為磁珠提取法、離心柱提取法提取樣本3

圖2 兩種核酸提取方法提取胃液HP核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Figure 2 Amplification curve of real-time fluorescence quantitative PCR for nucleic acid extraction of H.pylori in specimens of gastric fluid

3 討論

近年來，HP感染與心腦血管疾病的相關(guān)性已引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注[15-16]，但檢測(cè)HP尚缺乏合適的方法，特別是HP分型及其樣品處理。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)因敏感、快速、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于病原微生物核酸檢測(cè)[17-19]，其中DNA模板的質(zhì)量和純度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果具有重要影響，而選擇合適的核酸提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦很重要[20-21]。本研究從實(shí)際情況出發(fā)，旨在評(píng)價(jià)磁珠提取法和離心柱提取法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中HP核酸提取效果。

本研究結(jié)果顯示，離心柱提取法提取10-1、10-2、10-3、10-4、10-6濃度HP標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的CT值低于磁珠提取法，提示磁珠提取法在提取低濃度樣本時(shí)核酸提取效果優(yōu)于離心柱提取法。本研究結(jié)果還顯示，兩種核酸提取方法重復(fù)性及臨床標(biāo)本檢測(cè)能力相當(dāng)。目前，離心柱提取法應(yīng)用較廣泛，該方法是利用高分子硅材料吸附DNA的特征，通過高鹽酸性緩沖液去除樣品中RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，通過低鹽堿性緩沖液洗脫結(jié)合在吸附柱上的DNA。離心柱提取法雖具有較高的核酸提取效果，但因需反復(fù)離心而對(duì)儀器設(shè)備依賴性較高，不利于大規(guī)模樣品篩查及突發(fā)疫情的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和控制。磁珠提取法能有效解決離心柱提取法的缺點(diǎn)，其通過納米磁珠特異性吸附DNA的原理而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的簡(jiǎn)單高效提取，具有其他方法無可比擬的優(yōu)勢(shì)：(1)自動(dòng)化程度高：不需要有機(jī)溶劑，也不需要反復(fù)離心，僅以核酸結(jié)合磁珠為基礎(chǔ)，極大地減少了對(duì)操作人員的危害，并降低了對(duì)儀器設(shè)備的要求；(2)高通量：能同時(shí)對(duì)多樣本進(jìn)行核酸提取，現(xiàn)有許多自動(dòng)化工作站能同時(shí)對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行處理，如MagNA Pure LC 2.0 System(Roche)、BioRobot MDx Workstation(QIAGEN)、LabTurbo(Thermo Fisher)等；(3)操作步驟簡(jiǎn)單、人工耗時(shí)短：整個(gè)操作流程大概需要30 min；(4)成本低廉，適用于大規(guī)模樣品篩查及檢測(cè)。

綜上所述，磁珠提取法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的HP核酸提取效果優(yōu)于離心柱提取法，而其重復(fù)性及臨床樣本檢測(cè)能力與離心柱提取法相當(dāng)，但磁珠提取法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低廉及自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，適合大規(guī)模樣品篩查及檢測(cè)。

作者貢獻(xiàn)：彭賢慧進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；彭賢慧、何利華進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、結(jié)果整理；周麗雅、何利華、宋志強(qiáng)進(jìn)行資料收集整理；張建中進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：謝武英)

Comparison of Nucleic Acid Extraction Effect onH.pyloriin Real-time Fluorescence Quantitative PCR between Magnetic Bead Method and Spin Column Method

PENGXian-hui1，2，ZHOULi-ya3，HELi-hua1，2，SONGZhi-qiang3，ZHANGJian-zhong1，2

1.PreventionandControlInstituteforInfectiousDisease，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention(NationalKeyLaboratoryforInfectiousDisease)，Beijing102206，China2.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases，Hangzhou310003，China3.DepartmentofGastroenterology，theThirdHospitalofPekingUniversity，Beijing100191，China

ZHANGJian-zhong，E-mail：zhangjianzhong@icdc.cn

Objective To compare the nucleic acid extraction effect，repeatability and clinical specimens detection ability onH.pyloriin real-time fluorescence quantitative PCR between magnetic bead method and spin column method.Methods Standard strains ofH.pyloriwith diluted concentration from 100to 10-6were prepared as templates and nucleic acid ofH.pyloriwas parallelly extracted by magnetic bead method and spin column method，then nucleic acid extraction effect and coefficient of variation were compared between the two methods；meanwhile 35 specimens of gastric fluid were prepared as templates and nucleic acid ofH.pyloriwas parallelly extracted by magnetic bead method and spin column method，then nucleic acid extraction effect was compared between the two methods.Results No statistically significant differences of nucleic acid CT value was found in standard strains ofH.pyloriwith 100or 10-5diluted concentration between the two methods(P>0.05)，while nucleic acid CT value extracted by spin column method was statistically significantly lower than that extracted by magnetic bead method in standard strains ofH.pyloriwith 10-1，10-2，10-3，10-4and 10-6diluted concentration，respectively(P<0.05).No statistically significant differences of coefficient of variation was found in nucleic acid extraction of standard strains ofH.pyloribetween the two methods(P>0.05).No statistically significant differences of nucleic acid CT value ofH.pyloriwas found in specimens of gastric fluid(P>0.05).Conclusion Magnetic bead method has better nucleic acid extraction effect onH.pylorithan spin column method in real-time fluorescence quantitative PCR，while the two methods have similar coefficient of variation and clinical specimens detection ability.

Polymerase chain reaction；Helicobacter pylori；Magnetic bead extraction；Spin column extraction

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI06B02)

張建中，E-mail：zhangjianzhong@icdc.cn

R 349.82

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.04.y01

2017-01-15；

2017-04-12)

1.102206北京市，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所(傳染病控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

2.310003浙江省杭州市，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心

3.100191北京市，北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科