5種石斛對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

王凱+眭丹娟+王長鎖+楊麗+歐陽臻+陳乃富+韓邦興+魏淵

[摘要] 該文旨在研究比較霍山石斛、鐵皮石斛（霍山）、鐵皮石斛（云南）、銅皮石斛和河南石斛等5種石斛對四氯化碳急性肝損傷的保護作用。實驗將C57BL/6小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、5種石斛高（7.5 g·kg^-1）和低（1.25 g·kg^-1）2個劑量組。各組連續(xù)給藥2周，末次給藥2 h后，除對照組腹腔注射橄欖油外，其余各組腹腔注射0.5%CCl4橄欖油溶液。16 h后，采集小鼠血清及肝組織，測定小鼠血清中ALT，AST的活性；并檢測肝組織中SOD和MDA的水平；計算肝臟指數(shù)并觀察肝組織病理學變化，熒光定量PCR技術(shù)檢測肝組織中IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA 的表達水平。結(jié)果顯示，與模型組相比，各石斛組均能降低小鼠血清指標ALT和AST水平，使肝組織中MDA含量下降，SOD活性升高，減輕CCl4對肝臟的病理損傷。此外，霍山石斛肝組織中IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA表達水平顯著下調(diào)。結(jié)果表明，5種石斛對四氯化碳急性肝損傷具有保護作用。但不同產(chǎn)地石斛和不同種石斛的保肝效果有所不同，其中霍山石斛效果最為顯著，其他幾種石斛保肝效果依次為鐵皮石斛（云南）、鐵皮石斛（霍山）、河南石斛和銅皮石斛，這可能與不同基源品種石斛化學成分不同有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 石斛； 保肝； 四氯化碳； 急性肝損傷

[Abstract] This study aims to investigate the protective effect of Dendrobium huoshanense， D.officinale（Huoshan）， D.officinale（Yunnan）， D.moniliforme and D. henanense on CCl4-induced hepatic damage in mice. C57BL/6 mice were randomly divided into control group， model group， high-dose（7.5 g·kg^-1） and low-dose （1.25 g·kg^-1） groups of the five Dendrobium. Each group was intragastrically administered with drugs for 2 weeks. The control group was intraperitoneally injected with Olive oil solution， while the other groups were intraperitoneally given 0.5%CCl4combined with Olive oil solution 2 h later after the last administration. Subsequently， ALT and AST activities in serum， SOD activities and MDA contents in liver tissues were determined in all groups 16 h later after administration. The liver index was calculated， and hepatic histopathological examination was performed. The mRNA expressions of IL-1β， IL-6 and TNF-α were analyzed by Real-time PCR. Compared with the CCl4 model group， the activities of ALT and AST in serum decreased significantly in the five different Dendrobium groups. Meanwhile， in liver tissues， the levels of MDA reduced obviously， while the SOD activities markedly increased. Furthermore， liver tissue damage induced by CCl4 was ameliorated according to the histopathological examination. IL-1β， IL-6 and TNF-α mRNA expressions in D.huoshanense-treated liver tissues were significantly decreased. In conclusion， the five different Dendrobium groups showed hepatoprotective effects on CCl4-induced acute liver injury in mice. However， there were differences among Dendrobium of different types and origins. The protect effect of D.huoshanense is the most obvious， and the order of the protective effect of the other Dendrobium from high to low is D.officinale（Yunnan）， D. officinale（Huoshan）， D.henanense and D.moniliforme. The differences between the different types of Dendrobium might be related to their chemical components.

[Key words] Dendrobium； liver protection； CCl4； acute liver injury

石斛為蘭科多年生草本植物，作為一種中國傳統(tǒng)的中藥材，其用藥歷史悠久，具有益胃生津、滋陰清熱的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明石斛具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝損傷和降低血糖的作用，在防治白內(nèi)障和提高免疫力方面也有很好的療效[1-2]。石斛植物來源眾多，主要分布在華東、西南及華南地區(qū)，其中近40種可被藥用[3]。石斛中化學成分類型多樣，除生物堿外，還有菲類、聯(lián)芐類、芴酮類、倍半萜類、香豆素、多糖、甾體及揮發(fā)油等[4]，各類成分的化學結(jié)構(gòu)各有不同，其藥理作用也存在一定區(qū)別，主要表現(xiàn)在不同石斛具有各自的特殊藥理作用，相同藥理作用又存在藥效高低的不同[5-7]。

已有文獻報道霍山石斛和鐵皮石斛對急性肝損傷具有保護作用[8]，但其他幾種石斛的保肝作用尚未見報道。同時，不同種石斛所含化學成分類型不同，同種不同產(chǎn)地的石斛，其化學成分含量也有差異，它們對肝損傷的療效是否相同尚不確定。故本實驗采集了霍山、云南2種不同產(chǎn)地鐵皮石斛，并選取霍山、鐵皮、河南、銅皮4個不同種石斛，通過建立四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型，對石斛抗肝損傷作用進行對比研究，并初步探討其作用機制，為合理開發(fā)和利用石斛提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康SPF級C57BL/6小鼠，雄性，8周大，體重（20±2） g，購買于江蘇大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（蘇）2013-0011。在實驗室適應性飼養(yǎng)1周后用于正式實驗，12 h明暗交替照明，自由進食、飲水。

1.2 藥品 霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng、鐵皮石斛D. officinale Kimura et Migo（霍山）、鐵皮石斛D. officinale Kimura et Migo（云南）、銅皮石斛D. moniliforme（L.） Sw和河南石斛 D. henanense J. L. Lu et L. X. Gao5種石斛（鮮品）均由皖西學院韓邦興副教授提供和鑒定。石斛榨汁液的制備：將新鮮的石斛去根洗凈，剪段，準確稱量10 g后，將剪好的片段倒入榨汁機中，分次適量加入100 mL蒸餾水榨汁，用200目濾布過濾，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 四氯化碳購買于國藥集團化學試劑有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒（MM031）購自徐州溥博生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）購自美國賽默飛科技公司；熒光定量試劑盒（Fast Start Essential DNA Green Master）購自瑞士羅氏公司。

1.4 儀器 SpectraMax 190型酶標儀（美國MD公司）；Model754型紫外分光光度計（上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；IKA T10B型磁力攪拌器（德國IKA公司）；Pic017臺式離心機（美國賽默飛科技公司）；LC-96熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥方法 將C57BL/6小鼠隨機分為12組，每組10只，分別為空白對照組、模型組、霍山石斛低劑量組（含生藥1.25 g·kg^-1，參照《中國藥典》石斛用量）、霍山石斛高劑量組（含生藥7.5 g·kg^-1）、鐵皮石斛（霍山）低劑量組（含生藥1.25 g·kg^-1）、鐵皮石斛（霍山）高劑量組（含生藥7.5 g·kg^-1）、鐵皮石斛（云南）低劑量組（含生藥1.25 g·kg^-1）、鐵皮石斛（云南）高劑量組（含生藥7.5 g·kg^-1）、銅皮石斛低劑量組（含生藥1.25 g·kg^-1）、銅皮石斛高劑量組（含生藥7.5 g·kg^-1）、河南石斛低劑量組（含生藥1.25 g·kg^-1）、河南石斛高劑量組（含生藥7.5 g·kg^-1）。各給藥組連續(xù)灌胃給藥2周，每天1次，正常組和模型組同時給予等量的生理鹽水。末次給藥2 h后，將模型組和各給藥組一次性腹腔注射0.5% CCl4橄欖油溶液10 mL·kg^-1，對照組給予等量的橄欖油。禁食16 h后使用二氧化碳窒息法處死小鼠。心臟取血，并分離小鼠肝臟。

2.2 肝臟指數(shù)的計算 4 ℃生理鹽水去除肝臟表面殘血，濾紙吸干后稱重，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/小鼠體重（g）×100%。

2.3 血清指標及肝組織中相關(guān)酶活力的測定 小鼠血樣室溫靜置2 h后，3 500 r·min^-1離心10 min，取血清，按照試劑盒的說明分別測定小鼠血清中ALT和AST的含量。稱取肝臟相同部位的肝組織，加入9倍的生理鹽水制成10%肝勻漿，3 500 r·min^-1離心10 min，取上清，按試劑盒說明檢測SOD的活力及MDA含量。

2.4 肝臟病理組織切片觀察 取小鼠肝臟右葉組織，放入10%甲醛中浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（片厚5 μm）、HE染色，由江蘇大學附屬醫(yī)院病理科陳淼主任光學顯微鏡觀察肝臟組織病理學變化。

2.5 熒光定量PCR檢測小鼠肝臟組織中相關(guān)炎癥因子的表達 按照試劑盒說明提取小鼠肝臟組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參基因，進行熒光定量PCR。PCR引物由上海生工生物公司設計合成，TNF-α的上游引物為5′-CTTCCAGAACTCCAGGCGGT-3′，下游引物為5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGACG-3′；IL-1β的上游引物為5′-CTCGTGCTGTCGGACCCAT-3′，下游引物為5′-CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGA-3′；IL-6的上游引物為5′-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3′，下游引物為5′-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3′；β-actin的上游引物為5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物為5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。實時熒光定量PCR條件為： 95 ℃預變性300 s；95 ℃變性15 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重復40個循環(huán)。實驗重復3次，mRNA的表達水平采用比較閾值法進行分析，目的基因擴增的倍數(shù)值表示為2-ΔΔCt。

2.6 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA） ，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 5種石斛對CCl4肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響 與對照組相比，模型組肝臟指數(shù)有顯著性升高（P<0.01）。5種不同石斛給藥高劑量組與模型組相比肝指數(shù)均有所下降，其中霍山石斛、鐵皮石斛（霍山）和鐵皮石斛 （云南）有顯著性降低（P<0.05），見表1。

3.2 5種石斛對CCl4肝損傷小鼠血清ALT，AST活性的影響 與對照組相比，模型組小鼠血清中ALT和AST活力顯著升高（P<0.01），說明本次實驗模型造模成功。與CCl4模型組比較，各石斛高低劑量組均能降低小鼠血清中ALT和AST的活性，其中鐵皮石斛（云南）和鐵皮石斛（霍山）高劑量組均有顯著差異（P<0.05），而霍山石斛降低效果最為顯著（P<0.01），見表1。

3.3 5種石斛對CCl4肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)的影響 對照組的肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，分界清楚，肝細胞無壞死現(xiàn)象；而模型組細胞結(jié)構(gòu)紊亂，細胞核消失，肝細胞大量壞死以及炎癥細胞浸潤；而各石斛給藥組小鼠肝組織病理學形態(tài)均有不同程度的改變，病理損傷減輕，細胞排列整齊，肝臟壞死和炎癥細胞浸潤均有不同程度的減輕，見圖1。

3.4 5種石斛對CCl4肝損傷小鼠肝組織SOD活性及MDA含量的影響 與對照組相比，模型組小鼠肝組織中SOD的活力顯著性降低（P<0.01），MDA含量顯著性升高（P<0.01）。與模型組比較，5種石斛給藥組均能夠升高SOD的含量，并且能夠抑制MDA含量的升高。其中，鐵皮石斛（云南）和鐵皮石斛（霍山）高劑量組均有顯著差異（P<0.05），霍山石斛的效果最為顯著（P<0.01），見表2。

3.5 霍山石斛對小鼠肝組織中炎癥相關(guān)因子水平的影響 前期實驗顯示霍山石斛的保肝效果最為顯著，而炎癥反應在CCl4肝臟損傷過程中發(fā)揮重要作用，故選取霍山石斛研究石斛的保肝機制是否與炎癥有關(guān)。與對照組相比，模型組肝臟組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA水平顯著升高（P<0.01），而霍山石斛給藥組的小鼠抑制了肝組織中IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA的過表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且不同劑量下，mRNA表達水平均降低。這些結(jié)果表明，霍山石斛可以通過增加抗炎活性來預防肝損傷，見圖2。

4 討論

為研究石斛的保肝作用，本實驗采用CCl4肝損傷模型，該模型目前是研究急性肝損傷的典型模型，重復性好，是研究保肝藥物的常用模型之一。在CCl4肝損傷模型中，CCl4在肝微粒體細胞色素P450激活下生成三氯甲基自由基，這些自由基可與肝細胞內(nèi)大分子發(fā)生共價結(jié)合，也可攻擊膜不飽和脂質(zhì)，引起脂質(zhì)過氧化，使肝細胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶從受損的肝細胞內(nèi)溢出，使血清中轉(zhuǎn)氨酶升高[9-10]，所以通過測定血清中ALT，AST的含量，可以判斷肝臟的損傷程度。本實驗過程中，模型組注射0.5%CCl4后，與正常組比較，血清中ALT和AST含量顯著升高（P<0.01），說明小鼠肝細胞受損，造模成功。與模型組比較，各石斛給藥劑量組均能夠降低小鼠血清中的ALT和AST含量，其中鐵皮石斛（云南） 和鐵皮石斛（霍山）高劑量（7.5 g·kg^-1）組有顯著差異（P<0.05），而霍山石斛降低效果最為顯著（P<0.01）。

SOD是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活力的高低反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，MDA含量的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊時組織的過氧化損傷程度[11]。因此，測定肝勻漿中SOD和MDA的含量可反應肝細胞的受損傷情況。本實驗結(jié)果顯示，CCl4模型組小鼠比正常對照組小鼠肝組織SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，說明肝細胞清除自由基的能力降低，細胞結(jié)構(gòu)受損嚴重。而與CCl4模型組相比，5種石斛給藥組均能不同程度的升高小鼠肝組織SOD活性，降低MDA含量，說明石斛可通過保護細胞膜，清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應，從而降低肝細胞的損傷程度。

CCl4誘導活性氧類（ROS）的產(chǎn)生，ROS能夠活化NLRP3炎性小體，并導致IL-1β，IL-6和TNF-α等炎癥細胞因子的釋放和表達，引發(fā)了炎癥反應，從而加重肝臟損傷程度[12-13]。前期實驗結(jié)果顯示霍山石斛保肝效果最好，故選取霍山石斛研究石斛的保肝機制是否與炎癥有關(guān)。實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織病理切片中肝細胞大量壞死，充血以及炎癥細胞浸潤，熒光定量PCR結(jié)果顯示模型組小鼠肝組織中IL-1β，IL-6和TNF-α炎癥因子mRNA的表達水平顯著高于對照組，這些結(jié)果表明CCl4顯著誘導了小鼠的急性肝損傷，并引發(fā)炎癥反應。而霍山石斛可顯著抑制炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的表達，減輕肝臟組織中的炎癥癥狀，說明霍山石斛可通過抑制炎癥通路發(fā)揮保肝作用。

有研究表明，迭鞘、馬鞭、金鐵、鼓槌、鐵皮5種不同石斛對胃腸運動、對胃黏膜的保護、抗疲勞作用和增強免疫作用的藥理作用各不相同[14-15]。本實驗中霍山、鐵皮、銅皮、河南4種石斛對CCl4急性肝損傷的保肝效果不盡相同，說明可能不同種石斛，由于其化學成分的不同，藥理作用存在一定的差異。龔慶芳等研究發(fā)現(xiàn)廣西、安徽、云南、浙江不同產(chǎn)地的鐵皮石斛由于氣候、土質(zhì)等環(huán)境因素的差異，其多糖、甘露糖和毛蘭素含量差異顯著[16]。本實驗選取云南和安徽2種不同產(chǎn)地鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)其對CCl4急性肝損傷的保護效果有所不同，進一步說明可能由于不同產(chǎn)地石斛生長環(huán)境不同，化學成分含量之間存在差異，其藥理療效也有所區(qū)別。

霍山石斛是安徽道地藥材之一，其用藥歷史悠久具有良好的藥用價值。藥理研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛中含有大量的中性多糖（DHP1）可能是其潛在的保肝成分，它的保肝活性可能與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系[17]。本實驗結(jié)果表明，與其他幾種石斛相比，道地藥材霍山石斛顯示出較好的保肝效果，實驗結(jié)果進一步證明道地藥材霍山石斛可能由于其特殊的結(jié)構(gòu)和化學成分，具有獨特的藥理價值。

綜上所述，本實驗研究的5種石斛對四氯化碳肝損傷均具有保護作用，其作用機制可能與抑制脂質(zhì)過氧化和炎癥因子過表達相關(guān)。此外，本實驗結(jié)果顯示不同種石斛和不同產(chǎn)地石斛的保肝效果有差異，這可能是由于不同石斛化學成分和結(jié)構(gòu)之間存在差異，其保肝的作用效果也不盡相同，到底何種成分起著重要作用，仍有待進一步的研究。

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[責任編輯 張寧寧]