基于化學(xué)成分和生物效應(yīng)的栝樓桂枝湯質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

李煌+喬麗菲+張玉琴+許文+徐偉+褚克丹+林羽

[摘要] 該研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，分析測(cè)定栝樓桂枝湯中的24種化學(xué)成分，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合嗎替麥考酚酯誘導(dǎo)的斑馬魚神經(jīng)元損傷藥效模型對(duì)栝樓桂枝湯進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)生物活性評(píng)價(jià)，旨在探討建立一種綜合化學(xué)成分與生物效應(yīng)的栝樓桂枝湯質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，研究結(jié)果表明建立的方法可行，基本穩(wěn)定可靠，可為中藥復(fù)方的質(zhì)量控制研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 栝樓桂枝湯； 超高效液相色譜-質(zhì)譜； 斑馬魚神經(jīng)損傷模型

[Abstract] The paper was aimed to establish a quality evaluation model for Gualou Guizhi decoction based on the chemical compositions and biological effects. Ultra high performance liquid chromatograph-mass spectrometer was used to analyze and determine 24 kinds of chemical compositions in Gualou Guizhi decoction， and then， biological activity effect was quantitatively assessed in a zebrafish neuronal injury model which was induced by mycophenolate mofetil （MMF）. As a result， the established method for quality evaluation of Gualou Guizhi decoction based on the chemical compositions and biological effects is feasible， stable and reliable， which can provide reference for quality control of compound Chinese medicines.

[Key words] Gualou Guizhi decoction； UPLC-MS； Zebrafish neuronal injury model

在保證安全性的前提下，中藥復(fù)方的質(zhì)量控制，其關(guān)鍵在于評(píng)價(jià)其有效性與可控性。然而目前的質(zhì)控方法，主要通過(guò)檢測(cè)一種或某幾種有效成分來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，存在一定的缺陷，如缺乏質(zhì)量控制的科學(xué)性與系統(tǒng)性，存在非法添加對(duì)照品的風(fēng)險(xiǎn)等。隨著近年來(lái)生物活性測(cè)定法，具有整體可控，藥效密切相關(guān)等優(yōu)勢(shì)的凸顯，已逐漸成為中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的重要發(fā)展方向[1-4]。

栝樓桂枝湯，處方來(lái)源于張仲景的《金匱要略》，具有解肌祛邪，舒緩筋脈之功效。在課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，該方通過(guò)多途徑發(fā)揮對(duì)MCAO模型大鼠的腦保護(hù)作用[5-9]。目前，斑馬魚模型已被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)保護(hù)的藥物活性篩選[10-12]。本實(shí)驗(yàn)在采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，結(jié)合斑馬魚神經(jīng)元損傷模型，進(jìn)行栝樓桂枝湯對(duì)中樞腦保護(hù)的生物活性檢測(cè)，初步探索建立基于化學(xué)測(cè)定和生物活性的中藥復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，為豐富中藥復(fù)方質(zhì)量控制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀，Xevo TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；與顯微鏡相連的相機(jī)（TK-C1481EC）；精密電子天平（CP214，OHAUS，America）；AZ100型熒光顯微鏡（尼康公司）；NIS-Elements D 3.10 高級(jí)圖像處理軟件（Media Cybernetics 公司）。

1.2 試劑

沒(méi)食子酸甲酯、芍藥內(nèi)酯苷、2-羥基肉桂酸、酸棗仁皂苷A，購(gòu)自于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均≥98%；沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、甘草酸、6-姜酚、甘草次酸、獐牙菜苦苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、4-羥基苯甲酸甲酯，購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均≥99%；氧化芍藥苷、4-羥基肉桂酸、紫云英苷、3-羥基肉桂酸、異甘草苷、甘草查爾酮A、8-姜酚、6-姜烯酚購(gòu)于上海同田生物科技有限公司，純度均≥98%。

色譜純乙腈（美國(guó)Merck公司）；水為超純水。嗎替麥考酚酯（購(gòu)自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)H14J6335），吖啶橙染料（Alorich，批號(hào)494-38-2）；谷胱甘肽，簡(jiǎn)稱GSH，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)為45463；甲基纖維素（Aladdin，Shanghai，China）。

1.3 藥材

栝樓、白芍、桂枝、甘草、生姜、大棗購(gòu)自福州回春中藥飲片廠有限公司，上述藥材經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典》相關(guān)要求。

2 方法

2.1 栝樓桂枝湯制備

取生姜、桂枝藥材，分別按10倍加量水，采用水蒸氣蒸餾法提取6 h，并收集其揮發(fā)油，再將上述藥渣與處方中其他4味藥材混合，按處方比例加入10倍水，煎煮2次，每次1.5 h，過(guò)濾合并藥液，濃縮藥液，置-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 超高效液相色譜分析測(cè)定栝樓桂枝湯中的24種成分

2.2.1 UPLC的色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動(dòng)相為水（含0.1%甲酸，A）-乙腈（B），梯度洗脫，條件見(jiàn)表1，流速0.25 mL·min^-1。進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為 45 ℃。

質(zhì)譜條件：去溶劑氣體為氮?dú)?，碰撞氣體為氬氣，離子源溫度150 ℃，毛細(xì)管電壓3.0 KV，錐孔電壓30.0 V，去溶劑氣體流量800 L·h^-1，錐孔氣流50 L·h^-1，脫溶劑溫度200 ℃。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

稱取 24 種待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品和 3 種內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，甲醇適量超聲溶解，定容制刻度，搖勻，分別制備成濃度為1.00 g·L^-1的對(duì)照品母液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液溶液的制備

精密吸取栝樓桂枝湯適量，置于25 mL量瓶中，先加50%甲醇45 mL超聲提取30 min，靜置，放冷，再用50%甲醇定容，搖勻，靜置，取一定量至EP管中，12 000 r·min^-1離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 取上述24種對(duì)照品的儲(chǔ)備液，精確配制不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)3 次，將各成分特征碎片離子峰面積平均值（Y）與被測(cè)組分的質(zhì)量濃度（X，mg·L^-1）進(jìn)行線性分析，獲得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍；以信噪比（S/N）等于3，計(jì)算24種待測(cè)成分的檢出限LOD，以信噪比（S/N）等于10，計(jì)算24種待測(cè)組分的定量限LOQ，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.4.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率試驗(yàn) 按照藥典的相關(guān)要求，分別進(jìn)行了儀器精密度、樣品的穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均符合要求。

2.2.5 3批栝樓桂枝湯樣品的含量測(cè)定

分別精密稱取3批樣品，按2.2.3項(xiàng)制備栝樓桂枝湯樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜，質(zhì)譜條件進(jìn)行樣品測(cè)定，分別將各成分峰面積代入相應(yīng)的回歸方程，計(jì)算獲得樣品中24種活性成分的含量，其結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 栝樓桂枝湯對(duì)斑馬魚中樞神經(jīng)的保護(hù)作用

隨機(jī)選取270尾受精后1 d野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚，用嗎替麥考酚酯誘發(fā)斑馬魚中樞神經(jīng)損傷。分別水溶給予A組60，100，130 mg·L^-1和B組924，1 540，2 000 mg·L^-1，陽(yáng)性對(duì)照藥GSH 154 mg·L^-1，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚）和模型對(duì)照組，每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量為3 mL。A組和B組分別與嗎替麥考酚酯共同處理24 h后，用吖啶橙進(jìn)行染色，染色后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用NIS-Elements D 3.10 高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度（S），進(jìn)行定量分析，并統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用±s表示，A組和B組對(duì)斑馬魚中樞神經(jīng)的保護(hù)作用計(jì)算公式如下。

中樞神經(jīng)保護(hù)作用=S模型對(duì)照組-S供試品組S模型對(duì)照組-S正常對(duì)照組×100%

結(jié)果采用方差分析和Dunnett′s t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表明具有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 栝樓桂枝湯中24種成分的UPLC測(cè)定

在上述色譜條件下對(duì)照品和栝樓桂枝湯的色譜見(jiàn)圖1，2，所有樣品在保留時(shí)間6.5 min內(nèi)，均得到較好的分離；栝樓桂枝湯測(cè)定24種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍結(jié)果見(jiàn)表2，3批栝樓桂枝湯含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.2 斑馬魚損傷模型的建立

采用0.25 mol·mL^-1嗎替麥考酚酯處理受精后1 d野生型AB品系斑馬魚24 h，建立斑馬魚中樞神經(jīng)損傷模型。AO 染料染色，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色，熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判斷造模成功率（造模成功率95%），見(jiàn)圖3。斑馬魚凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量分析可對(duì)藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效率進(jìn)行快速、可靠的評(píng)價(jià)。

3.3 栝樓桂枝湯對(duì)斑馬魚損傷模型的最大耐受濃度測(cè)定

栝樓桂枝濃縮干燥的粉末，采用養(yǎng)殖用水配制成2 g·L^-1母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)配制成1，10，100，250，500，1 000，2 000 mg·L^-1質(zhì)量濃度的樣品溶液，結(jié)果顯示在2 000 mg·L^-1時(shí)，除嗎替麥考酚酯誘導(dǎo)的毒性（軀干彎曲，腦袋變性）外，對(duì)斑馬魚未產(chǎn)生其他毒副作用，也未引起斑馬魚死亡，且2 000 mg·L^-1為最大耐受濃度檢測(cè)上限。因此確定栝樓桂枝湯對(duì)斑馬魚MTC為2 000 mg·L^-1。

3.4 栝樓桂枝湯對(duì)斑馬魚中樞神經(jīng)的保護(hù)作用

將栝樓桂枝湯母液為2 g·L^-1，分別加入1 386，2 310，3 000 μL到3 mL養(yǎng)殖用水中，配制成低、中、高3個(gè)劑量組（924，1540，2 000 mg·L^-1）。按2.3項(xiàng)下方法測(cè)定栝樓桂枝湯處理下斑馬魚凋亡細(xì)胞F，計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)率P，結(jié)果見(jiàn)表4。

模型對(duì)照組斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度與正常對(duì)照組比較P<0.001，表明模型建立成功；陽(yáng)性對(duì)照藥GSH 154 mg·L^-1組斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度為83 460像素，與模型對(duì)照組比較P<0.001，其對(duì)斑馬魚中樞神經(jīng)保護(hù)作用為83%，說(shuō)明GSH對(duì)斑馬魚中樞神經(jīng)有保護(hù)作用。

栝樓桂枝湯的924，1 540，2 000 mg·L^-1組斑馬魚中樞神經(jīng)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為106 711，69 716，70 174像素，中樞神經(jīng)保護(hù)作用分別為65%，93%，93%，與模型對(duì)照組比較，各組均P<0.001，提示栝樓桂枝湯在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下對(duì)斑馬魚中樞神經(jīng)有明顯的保護(hù)作用，見(jiàn)表4，圖4。

4 討論

4.1 色譜條件的優(yōu)化

考慮到栝樓桂枝湯中，可能存在著同分異構(gòu)體易造成干擾的問(wèn)題，如桂枝藥材存在2，3，4-位，3種不同位置的羥基肉桂酸；白芍中芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷，結(jié)構(gòu)上僅差1個(gè)酯鍵；甘草藥材中的甘草苷與異甘草苷等成分，其母離子和子離子完全一樣，若未能選擇好色譜條件，則可能影響質(zhì)譜檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)流動(dòng)相的進(jìn)行了優(yōu)選，預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.02 mol·L^-1乙酸銨、乙腈-0.02 mol·L^-1乙酸銨-0.1%甲酸水等流動(dòng)相條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①甲醇體系的分離度不如乙腈體系；②甲酸或乙酸銨對(duì)色譜分離及峰形改善均有作用，但其對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)與峰形改善程度與單用甲酸相差不大，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相。

其次，實(shí)驗(yàn)中篩選了不同類型的色譜柱Waters CORTECS C18，Waters HSS T3 C18，Phenomenexkintecx，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.6 μm的超高效液相色譜柱，其分離效果和檢測(cè)的靈敏度均高于其他色譜柱，且達(dá)到基線分離的分析時(shí)間縮短，分離的效率較高，所以本實(shí)驗(yàn)中選擇Waters CORTECS C18色譜柱。

4.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

結(jié)合文獻(xiàn)研究，栝樓桂枝湯中主要成分為白芍萜苷類及甘草三萜酸類成分。實(shí)驗(yàn)中分析比較了正、負(fù)離子檢測(cè)模式等質(zhì)譜條件，發(fā)現(xiàn)上述2類成分在負(fù)離子模式條件下檢測(cè)靈敏度顯著高于正離子模式，并且其他化合物在該模式下也有穩(wěn)定的子離子和較高的響應(yīng)度，故最終選擇負(fù)離子模式。

4.3 栝樓桂枝湯化學(xué)成分與藥效相關(guān)性

中藥復(fù)方質(zhì)控評(píng)價(jià)體系的建立其指標(biāo)選擇是關(guān)鍵問(wèn)題，本文選擇的分析測(cè)定成分主要基于以下方面考慮，一是前期研究發(fā)現(xiàn)的復(fù)方中具有透過(guò)血腦屏障的作用成分如：如沒(méi)食子酸、芍藥苷、甘草素、甘草苷等[7]；或已有文獻(xiàn)報(bào)道具有神經(jīng)保護(hù)作用成分芍藥內(nèi)酯苷[13]、6-姜酚[14]、甘草酸[15]；此外，還包括了構(gòu)成復(fù)方各味藥材的藥典主要測(cè)定指標(biāo)。

4.4 斑馬魚中樞神經(jīng)保護(hù)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

目前缺氧缺血再灌注腦損傷的模型，通常選擇大鼠、豬、羊，鑒于造模后的大鼠往往沒(méi)有任何精神、運(yùn)動(dòng)障礙的表現(xiàn)，而采用羊、豬胎兒模型則實(shí)驗(yàn)成本較高[16]。因此，建立一個(gè)新型、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便且能大量繁殖的動(dòng)物模型，對(duì)缺氧缺血再灌注腦損傷的研究，具有重要的意義。

斑馬魚作為一種新型模式動(dòng)物，具有易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、胚胎透明、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)，已在藥物活性篩選中廣泛應(yīng)用[17-18]，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域，如，李曉穩(wěn)等[10]建立了采用斑馬魚神經(jīng)元損傷模型評(píng)價(jià)養(yǎng)血清腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的模式。陳衍晨等[11]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧會(huì)導(dǎo)致斑馬魚腦細(xì)胞內(nèi)c-fos基因表達(dá)上調(diào)，可能是導(dǎo)致缺氧后期腦細(xì)胞凋亡激增的機(jī)制之一。Buenafe等[19]發(fā)現(xiàn)丹參丙酮粗提物能夠抑制戊四氮誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎癲癇發(fā)作。

[致謝] 斑馬魚中樞神經(jīng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)得到了杭州環(huán)特生物科技有限公司的技術(shù)支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 馮偉紅，李春，信偉梅，等.生物測(cè)定法用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的探索研究——以夏枯草抗氧化活性與總酚酸含量相關(guān)性的研究為例[J]. 中國(guó)中藥雜志，2016，41（14）：2660.

[2] 李寒冰，鄢丹，武彥舒，等. 基于抗病毒活性檢測(cè)的板藍(lán)根質(zhì)量生物評(píng)價(jià)方法及優(yōu)化研究[J]. 中草藥，2011，42（8）：1560.

[3] 鄢丹，肖小河. 基于道地藥材和生物測(cè)定的中藥質(zhì)量控制模式與方法研究——黃連質(zhì)量生物測(cè)定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（5）：568.

[4] 肖小河，金城，趙中振，等. 論中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)模式的創(chuàng)新與發(fā)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2007，32（14）：1377.

[5] Zhang Yuqin， Li Huang， Huang Mei， et al.Neuroprotective effects of Gualou Guizhi decoction in vivo and in vitro[J]. J Ethnopharmacol， 2014， 158：76.

[6] Hu H， Li Z， Zhu X， et al. Gua Lou Gui Zhi decoction suppresses LPS-induced activation of the TLR4/NF-κB pathway in BV-2 murine microglial cells[J]. Int J Mol Med， 2013， 31： 1327.

[7] Li Huang， Ye Miao， Zhang Yuqin， et al.Blood brain barrier permeability and neuroprotection of GualouGuizhi granule in ischemia-reperfusion injury[J]. Mol Med Rep， 2015， 12：1272.

[8] Zhang Shengnan， Zhang Yuqin， Li Huang， et al. Gualou Guizhi decoction treatment of focal cerebral ischemia/reperfusion injury via its anti-oxidative and anti apoptotic effects in rats[J].Exp Ther Med，2015， 9： 2121.

[9] 李煌，許文，徐偉. GC-MS 分析栝樓桂枝湯及其入腦的揮發(fā)性成分[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（8）：173.

[10] 李曉穩(wěn)，佟玲，李東翔，等. 斑馬魚神經(jīng)元損傷模型在養(yǎng)血清腦顆粒質(zhì)量控制中的應(yīng)用分析[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（9）：1.

[11] 陳衍晨，趙丹，卿娣，等. 缺氧再灌注斑馬魚胚胎腦部細(xì)胞凋亡及c-fos基因的表達(dá)[J]. 中國(guó)組織工程研究，2013，17（37）：6613.

[12] 羅濟(jì)璇，程燕，趙丹，等. ?；撬釋?duì)缺氧再灌注斑馬魚幼魚腦部?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的影響[J]. 臨床兒科雜志，2015，33（3）：269.

[13] 張玉琴，李煌，許文，等.栝樓桂枝顆粒對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障通透性及神經(jīng)保護(hù)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（5）：1410.

[14] 孫承銘，謝岱希，鄭文華.6-姜酚對(duì)腦缺血損傷模型小鼠的保護(hù)作用[J].山東醫(yī)藥，2011，51（52），41.

[15] 張明發(fā)，金玉潔，沈雅琴.甘草酸保護(hù)腦損傷及改善記憶功能的藥理作用研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2013，36（1）：59.

[16] Northington F J. Brief update on animal models of hypoxic-ischemic encephalopathy and neonatal stroke[J]. Inst Lab Animal Res，2006，47（1）：32.

[17] 殷梧， 鄒蘇琪，王光輝，等. 模式動(dòng)物斑馬魚在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)， 2008，20（5）： 773.

[18] 全珊珊，吳新榮. 斑馬魚人類疾病研究的理想模式動(dòng)物[J]. 生命的化學(xué)， 2008，28（3）： 260.

[19] Buenafe O E， Orellana-Paucar A， Maes J， et al. Tanshinone ⅡA exhibits anticonvulsant activity in zebrafish and mouse seizure models[J]. Neuro Sci，2013， 4（11）： 1479.

[責(zé)任編輯 孔晶晶]