抗腫瘤化合物告達亭的早期毒性機制研究

唐紅艷, 胡思揚,3, 張家雯, 施佳玉, 吳小雨, 張 閃, 張曉涵, 彭顆紅, 周 暢

(1.湖南師范大學生命科學學院，動物多肽藥物創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程實驗室,中國 長沙 410081;2.湖南省腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤科, 中國 長沙 410013；3.湖南師大附中梅溪湖中學,中國 長沙 410205)

抗腫瘤化合物告達亭的早期毒性機制研究

唐紅艷1, 胡思揚1,3, 張家雯1, 施佳玉1, 吳小雨1, 張 閃1, 張曉涵1, 彭顆紅2*, 周 暢1

(1.湖南師范大學生命科學學院，動物多肽藥物創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程實驗室,中國 長沙 410081;2.湖南省腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤科, 中國 長沙 410013；3.湖南師大附中梅溪湖中學,中國 長沙 410205)

為探究告達亭(Caudatin)對雄性昆明小鼠的毒性影響，按照告達亭質(zhì)量比為5和10 mg/kg以及溶劑對照組對SPF級昆明鼠通過腹腔注射的方法，進行為期14 d的毒理學研究.實驗動物總共30只昆明鼠，隨機分為6組，分2批進行實驗，兩次實驗結(jié)果一致：實驗昆明鼠在不同濃度告達亭處理14 d后體質(zhì)量無明顯變化，血液學指標檢測正常，心、肝、肺、腎以及睪丸均無組織畸變.

告達亭；慢性毒理實驗；血液成分生化分析

圖1 告達亭的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of Caudatin

近年來，中藥新品種逐年增加，其應(yīng)用的范圍越來越廣.關(guān)于中藥毒副作用給人體造成嚴重損害的報道時有發(fā)生，中藥的安全性成為其走向國際市場必須突破的瓶頸.C21甾體苷類化合物主要存在于蘿藦科中,告達亭(Caudatin)是從白首烏中分離得到的一種C21甾體苷元，分子式為C28H42O7，其結(jié)構(gòu)式如圖1[1-2].前期研究發(fā)現(xiàn)告達亭可以體外阻滯包括AGS細胞和HeLa細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞周期，起到抑制細胞增殖的作用；通過克隆形成和Tunel等實驗證明告達亭可以誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡； 劃痕實驗驗證告達亭對多種腫瘤細胞的遷移速率有顯著的抑制作用[3-5].告達亭在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、化療藥物增效減毒等方面具有重要的生物活性[6].但是到目前為止，未見有關(guān)告達亭藥物毒性的報道.中藥有效成分在開發(fā)成新藥前對其有效性及安全性做出初步評價必不可少，早期毒性指標的發(fā)現(xiàn)對于藥物毒性的早期預警尤為重要.本論文采用模式生物小鼠做為研究對象，首次對告達亭是否影響小鼠血清生化指標以及臟器毒理關(guān)系進行了研究，為臨床合理用藥提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

告達亭購于深圳美荷生物公司，戊巴比妥納、苦味酸、乙二胺四乙酸(K2-EDTA)等為上海生工的進口分裝試劑.所用儀器有五分類血液細胞分析儀BC-5500(Mindray 公司)，倒置顯微鏡CX-41(Zeiss公司)等.

1.2 實驗動物

SPF級6周齡雄性昆明鼠30只，健康狀況良好，體質(zhì)量為35～40 g，購自斯萊克景達實驗動物中心.

1.3 動物分組及告達亭劑量

將30只雄性昆明鼠隨機分為6組，每組5只，用全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，培養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房，室溫:22～24 ℃，濕度:50%～64%.實驗重復兩次，每次15只小鼠,分3組.于每日上午8～9時分別以5和10 mg/kg及等容量溶劑腹腔注射，對照組所注射的溶劑為丙二醇和PEG400按照體積比1∶9 配制，再用水稀釋至總體積占比20%，過濾滅菌.

1.4 觀察指標

1.4.1 行為觀察及體重檢測 每天進行一般觀察的項目，包括小鼠精神狀態(tài)、行為活動、糞便性狀、腺體分泌、皮膚被毛等.隔日稱取體質(zhì)量，進行監(jiān)測.

1.4.2 血清生化指標的檢測 末次給藥24 h后，對小鼠腹腔注射1%戊巴比妥納進行麻醉，所有小鼠均用眼眶下采血法收取血液，先取1.5 mL血液樣本按照1∶100 的比例加入10% K2-EDTA 抗凝劑.取2 mL血液樣本，自然凝固后，檢測肌酐(CREA)、膽固醇(CHOL)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)等血清生化指標.檢測血液學指標包括紅細胞(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞容積(HCT)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)、紅細胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、白細胞數(shù)(WBC)、血小板壓積(PCT)、血小板數(shù)(PLT)、血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW).

1.5 病理學檢查

用頸椎拉斷法處死小鼠后尸解，取出心、肝、肺、腎和睪丸5個臟器組織，首先經(jīng) Bouin氏液固定24 h，在自來水下流水沖洗10 min.用70%，80%，90%，95%，100%各級酒精梯度脫水，每級10～30 min.用二甲苯將材料進行透明，每次20～30 min，進行2次.浸蠟，包埋后保存.經(jīng)切片、展片與貼片，脫蠟，染色，脫水，透明，封片，鏡下觀察并拍照[7-8].

2 結(jié)果

2.1 告達亭對雄性小鼠的影響

雄性昆明小鼠在給藥前經(jīng)SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，經(jīng)為期14 d告達亭給藥處理，每次給藥后未見小鼠口、鼻、眼有異常分泌物.14 d 后所有小鼠行為活動正常，精神狀態(tài)良好、毛發(fā)光潤，未見糞便異常，無一例死亡.

2.2 告達亭對雄性小鼠體質(zhì)量增長的影響

圖2 告達亭對小鼠體質(zhì)量增長變化圖 Fig.2 Changes of body weight growth of mice under treatment of Caudatin

體質(zhì)量增長的幅度可以反映動物機體發(fā)育是否正常，通常通過檢測實驗組和對照組動物的體質(zhì)量變化，來觀察是否存在藥物毒性[9].正常情況下，6周齡小鼠的體質(zhì)量會逐日增長，若小鼠患有某些疾病，則體質(zhì)量增長會受到影響.每隔一天的相同時間為實驗鼠稱體質(zhì)量，計算平均值.統(tǒng)計結(jié)果見圖2，與溶劑對照組比較，5 mg/kg告達亭處理組體質(zhì)量增長較快，10 mg/kg 告達亭劑量處理組的體質(zhì)量增長速率基本一致，結(jié)果表明告達亭對小鼠的體質(zhì)量無明顯抑制作用.

2.3 告達亭對雄性小鼠血液學指標的影響

對雄性昆明小鼠連續(xù)腹腔注射給藥14 d，末次給藥24 h后，眼球取血檢測各項血液學指標.血液中各種指標的增高或降低都與機體的健康狀態(tài)息息相關(guān)，主要血液指標見表1.結(jié)果顯示，低劑量組白細胞(WBC)計數(shù)與同期溶劑對照組比較略有降低，高劑量組WBC計數(shù)與對照組比較下降明顯.白細胞的多少與身體免疫能力息息相關(guān)，可見告達亭在一定程度上降低了身體的免疫能力.其他組各項指標與同期溶劑對照組比較，中劑量組和高劑量組都沒有顯著性差異.統(tǒng)計結(jié)果如圖3.

表1 雄性小鼠腹腔注射告達亭14 d后血液學指標的檢測結(jié)果(x±s)

2.4 告達亭對雄性小鼠血清生化指標的影響

各組動物血清生化指標見表2，告達亭處理組與溶劑對照組比較，CREA(肌酐)、TP(總蛋白)和UA(尿酸)的檢測結(jié)果均無明顯影響.TG(甘油三酯)和CHOL(膽固醇)在告達亭低濃度組略有升高，在高濃度組又下降.統(tǒng)計結(jié)果見圖4.

表2 雄性小鼠腹腔注射告達亭14 d后血清生化指標的檢測結(jié)果(x±s)

圖3 告達亭對雄性小鼠血液生化指標的影響Fig.3 Effect of Caudatin on blood biochemical indexes of male mice

圖4 告達亭對小鼠血清生化指標的影響Fig.4 Effect of Caudatin on serum biochemical indexes in mice

圖5 雄性小鼠腹腔注射14 d后組織HE染色結(jié)果(200×)Fig.5 The results of HE staining after intraperitoneal injection of Caudatin for 14 days in male mice(200×)

2.5 告達亭不影響雄性小鼠組織器官的發(fā)育

采取常規(guī)脫頸椎法處死實驗鼠，解剖并仔細觀察各主要臟器，未見臟器萎縮、壞死等異?，F(xiàn)象.采用常規(guī)石蠟切片，然后對各組織伊紅染色，蘇木精復染，樹膠封片，鏡檢.結(jié)果如圖5所示.肺、睪丸、腎臟、心臟和肝臟組織中均未發(fā)現(xiàn)病灶情況.各組肺部結(jié)構(gòu)清晰，細胞核質(zhì)分布明顯；睪丸是機體的生殖和內(nèi)分泌器官，對照組以及5和10 mg/kg告達亭劑量處理組中小鼠睪丸的結(jié)構(gòu)正常.曲細精管管腔內(nèi)細胞層數(shù)未見減少，各級生精細胞排列規(guī)則、層數(shù)多，曲細精管管腔內(nèi)充滿較多精子，間質(zhì)細胞成群分布；與對照組比較，5和10 mg/kg告達亭劑量處理組腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球和腎小管輪廓清晰，未見異?，F(xiàn)象；心臟為循環(huán)系統(tǒng)中一個主要的器官，心內(nèi)膜切片結(jié)果顯示，與對照組比較，內(nèi)皮下層的結(jié)締組織較為致密，無結(jié)構(gòu)異常.告達亭劑量組與溶劑對照組相比，肝組織結(jié)構(gòu)完好，可見肝小葉和匯管區(qū)，無異常變化.

3 討論

藥物研發(fā)環(huán)節(jié)中需要進行毒理學研究，淘汰因毒性問題不適宜進一步研發(fā)的中藥或合成化合物，有助于降低投資風險、提高研發(fā)成功率.耳葉牛皮消分布廣泛，藥用塊根具有養(yǎng)陰清熱、止咳、抗炎等功效.但它因為含耳葉牛皮消根蘿蘑毒素(cynanchotoxin)，食用后出現(xiàn)的中毒癥狀有流涎、嘔吐、痙攣、呼吸困難、心跳緩慢等.告達亭是從耳葉牛皮消中提取出的一種C21甾體化合物，初步藥效學證實它可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡，具有良好的應(yīng)用前景[10].告達亭作為耳葉牛皮消的一種衍生物，其一般毒性、毒性作用靶器官、毒性作用機制均未開展系統(tǒng)研究.

六周齡雄性小鼠購買后，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，稱取體質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)差別不大.隨機將小鼠分成3組， 14 d連續(xù)小鼠尾靜脈注射告達亭，注射劑量分別按0，5和10 mg/kg.14天后觀察，3組動物全部存活，精神和運動未見異常；對照組與高劑量告達亭實驗組小鼠平均體質(zhì)量增長無明顯差異，表明此濃度范圍內(nèi)的告達亭對體質(zhì)量增長無抑制作用；低劑量告達亭實驗組與對照組比較平均體質(zhì)量有小幅增加，說明低劑量告達亭可以促進消化和吸收食物，有利于體質(zhì)量增長.血液學檢查RBC，HGB，HCT和RDW等發(fā)現(xiàn)，與同期溶劑對照組比較，低劑量組和高劑量組都沒有顯著性差異，變化在正常參考值范圍內(nèi).低劑量組WBC計數(shù)與對照組比較略有降低，但在正常參考值范圍內(nèi)，而告達亭高劑量組WBC計數(shù)與同期溶劑對照組比較有顯著性降低.白細胞減少與感染、毒素或藥物引發(fā)有關(guān).告達亭是否會引起白細胞持續(xù)下降，是否引起動物乏力、食欲減退，毒性程度是否嚴重，將通過延長給藥時間、增加給藥劑量等實驗來證明.血漿生化指標檢查發(fā)現(xiàn)，和肝功能代謝能力相關(guān)的TP，與腎功能相關(guān)的CREA和UA，以及血脂分析的常規(guī)項目TG和CHOL均未見明顯改變.進一步觀察HE染色的組織切片發(fā)現(xiàn)各組器官均正常.高劑量組和低劑量組告達亭處理后的小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索和肝血竇均沒有變形，大小比例正常.告達亭處理組的腎小球剖面界限清晰，腎小管和間質(zhì)未見明顯異常.近年來研究發(fā)現(xiàn)，生殖細胞對藥物更敏感，抗腫瘤藥物有效殺死腫瘤細胞的同時，往往引起生精細胞的大量凋亡，甚至男性生精功能急劇下降，從而導致不育.兩組告達亭處理組的睪丸曲細精管形狀正常，每一個曲細精管內(nèi)均見多層細胞，生精細胞與支持細胞數(shù)目豐富，管腔從外向內(nèi)有各級生精細胞排列規(guī)則，最內(nèi)層精子形態(tài)和數(shù)量正常.藥物組未見小鼠心肌萎縮、心肌斷裂、心肌出血，心肌細胞核完整.兩組告達亭處理組的肺組織是正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蘇木精復染后，細胞核清晰可見，胞核與胞漿對比鮮明，從組織形態(tài)未看出病變.綜上實驗結(jié)果說明，一定濃度的告達亭對小鼠血液系統(tǒng)以及肝、腎、睪丸、心和肺等重要器官的毒性作用很小.

在藥物的毒性反應(yīng)中還須考慮神經(jīng)毒性.藥物產(chǎn)生的神經(jīng)毒性會引起神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，有可能造成包括藥物成癮在內(nèi)的諸多不良后果.據(jù)統(tǒng)計，大約有10%的新藥因為神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)而不能面市[11-13].因此下一步將著重研究告達亭是否會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，并研究告達亭對雌性小鼠有無生殖毒性.另外，遺傳毒理學也是目前新興的一項毒理實驗研究學，筆者想從中藥抗誘變性的角度研究告達亭是否起中藥抗誘變性作用，能否與其他成熟的化療藥物配合使用，降低化療藥物的劑量，達到更好的治療效果.

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(編輯 WJ)

Study on the Early Toxicity and Mechanism for Antitumor Compound Caudatin

TANGHong-yan1,HUSi-yang1,3,ZHANGJia-wen1,SHIJia-yu1,WUXiao-yu1,ZHANGShan1,ZHANGXiao-han1,PENGKe-hong2*,ZHOUChang1*
(1.The National and Local Joint Engineering Laboratory of Animal Peptide Drug Development,College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;2.Department of Gynecological Oncology, Hunan Cancer Hospital, Changsha 410013, China;3.The High School Attached to HNU-Meixihu High School, Changsha 410205, China)

To examine the toxic effect of Caudatin on male Kunming mice, using Caudatin concentrations of 5 mg/kg, 10 mg/kg and the vehicle control group of SPF grade Kunming mice by intraperitoneal injection method, we conducted the toxicological study for a period of 14 days. These 30 Kunming mice were randomly divided into six groups, within two sub-experiments. We found that the results from these two sub-experiments are consistent with each other. There was no significant change in body weight and hematological parameters. We observed no markedly pathological change in the tissue of heart, liver, lung, kidney and testis of 30 Kunming mice after the treatment of different concentrations of Caudatin for 14 days.

Caudatin; chronic toxicity test; biochemical analysis of blood components

2016-08-07

湖南省科技計劃資助項目(2013FJ3147)；湖南省研究生科研創(chuàng)新資助項目(CX2017B232);湖南師范大學本科生創(chuàng)新性實驗資助項目(2016086);湖南師范大學教學改革研究資助項目(201467)

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.03.006

R99

A

1000-2537(2017)03-0032-05

*通訊作者,E-mail：zhouchang1972@126.com;pengkehong@hnszlyy.com