滇重樓總皂苷對(duì)涎腺腺樣囊性癌ACC-83細(xì)胞增殖抑制及其機(jī)制的研究

1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650106；

2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041

滇重樓總皂苷對(duì)涎腺腺樣囊性癌ACC-83細(xì)胞增殖抑制及其機(jī)制的研究

何秋敏1許彪1王衛(wèi)紅1包崇云2胡少偉1

1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650106；

2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041

目的 探討滇重樓總皂苷對(duì)涎腺腺樣囊性癌ACC-83細(xì)胞的增殖抑制作用及其相關(guān)機(jī)制，為滇重樓治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。方法 通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測不同藥物質(zhì)量濃度（5、10、20、40、60、80、100 μg·m L-1）的滇重樓總皂苷對(duì)ACC-83細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，采用流式細(xì)胞儀檢測不同藥物質(zhì)量濃度（25、50、100 μg·m L-1）的滇重樓總皂苷對(duì)ACC-83細(xì)胞的凋亡率，Western blot及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）和CD74的表達(dá)。結(jié)果 滇重樓總皂苷可促進(jìn)ACC-83細(xì)胞凋亡，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。ACC-83細(xì)胞中存在MIF和CD74的表達(dá)，滇重樓總皂苷可抑制MIF和CD74的表達(dá)。結(jié)論 滇重樓總皂苷對(duì)ACC-83細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，可以抑制MIF及CD74的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為其臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

滇重樓總皂苷； 涎腺腺樣囊性癌； 巨噬細(xì)胞游走抑制因子

涎腺腺樣囊性癌是涎腺腫瘤中較為常見的惡性腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高、嗜神經(jīng)等特性，臨床療效不佳。研究[1]發(fā)現(xiàn)，術(shù)后輔助化療可以有效提高腫瘤的局部控制率，因此尋找低毒高效的抗癌藥物具有重要意義。近年來，重樓皂苷因具有抗腫瘤和抗菌消炎等作用而備受關(guān)注[2]。大量研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，滇重樓總皂苷對(duì)乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等均有明顯抑制作用且有增效減毒的作用，但是重樓皂苷對(duì)ACC的研究還較為少見。本研究以涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-83為研究對(duì)象，探討滇重樓總皂苷對(duì)ACC-83細(xì)胞的增殖抑制作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用重樓治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

ACC-83細(xì)胞株由北京大學(xué)口腔醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室李盛林課題組饋贈(zèng)；重樓皂苷由中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。RPM I-1640購自美國Thermo公司，胎牛血清購自美國Sciencecell公司，Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Anti-巨噬細(xì)胞游走抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、Anti-CD74、兔抗人β-actin抗體購自美國Abcam公司，Eastep總RNA提取試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自美國Promega公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長期的ACC-83細(xì)胞，接種于96孔板中培養(yǎng)，設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，將質(zhì)量濃度梯度分別為5、10、20、40、60、80、100 μg·m L-1的藥物按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給各實(shí)驗(yàn)組加藥，分別設(shè)置陰性對(duì)照組（僅為完全培養(yǎng)基和ACC-83細(xì)胞）、調(diào)零組（僅為完全培養(yǎng)基），24 h后終止藥物作用，加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后上酶標(biāo)儀檢測，波長450 nm下測定并記錄光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（陰性對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的ACC-83細(xì)胞，接種于6孔板中培養(yǎng)，參考IC50值設(shè)置藥物質(zhì)量濃度梯度為低、中、高（分別為25、50、100 μg·m L-1）3組，設(shè)置陰性對(duì)照組（僅完全培養(yǎng)基和ACC-83細(xì)胞），24 h后終止藥物作用，收集細(xì)胞，離心3~5 min，去上清，加入約1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞后離心沉淀，細(xì)胞共洗滌2次，去上清，250 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)，取100 μL細(xì)胞懸液于5 m L流式管中，加入5 μL異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI，質(zhì)量濃度為20 μg·m L-1）溶液，室溫避光孵育15 m in；上流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 Western blot檢測MIF、CD74蛋白的表達(dá) 組織裂解液提取各實(shí)驗(yàn)組藥物質(zhì)量濃度梯度為低、中、高（分別為25、50、100 μg·m L-1）3組以及陰性對(duì)照組細(xì)胞中的總蛋白，運(yùn)用超微量紫外分光光度計(jì)測定各組蛋白濃度，計(jì)算上樣量。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylam ide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠，上樣、電泳、切膠及轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，漂洗3次，按1∶1 000和1∶500的比例分別配置MIF和CD-74的一抗， 4 °C孵育并過夜；漂洗3次，按1∶6 000的比例配置二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次。以β-actin為內(nèi)參。將A、B兩種發(fā)光底物試劑按照1∶1配置，凝膠成像儀顯影；Image J圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RTPCR）檢測MIF、CD74 mRNA的表達(dá) 參照RNA提取試劑盒的說明書提取各實(shí)驗(yàn)組藥物質(zhì)量濃度梯度為低、中、高（分別為25、50、100 μg·m L-1）3組以及陰性對(duì)照組細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA溶液的濃度和純度，配置RT-M ix，反應(yīng)體系為10 μL，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄程序，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s。MIF上游引物：5’- GTGGTGTCCGAGAAGTCAGG-3’，下游引物：5’- TTGCTGTAGGAGCGGTTCTG-3’；CD74上游引物：5’-GGCTACTGCTGGTGTGTCTT-3’，下游引物：5’-TCCAAGGGTGACGAAAGAGC-3’；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物：5’- ACCACAGTCCA- TGCCATCAC-3’，下游引物：5’- TCCACCACCCTG- TTGCTGTA-3’。程序完成后，得到cDNA。根據(jù)樣品和目的基因的數(shù)目，編排上樣表中的順序，配置PCR反應(yīng)體系，所用為10 μm體系，PCR反應(yīng)體系為：95 °C 5 m in；95 °C 30 s，60 °C 45 s，72 °C 30 s，共25個(gè)循環(huán)。采用RT-PCR儀進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)根據(jù)表達(dá)量=2-ΔΔCt分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者采用One-way ANOVA分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差不齊者采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同藥物質(zhì)量濃度的滇重樓總皂苷對(duì)ACC-83細(xì)胞均有不同程度的生長抑制作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（具體數(shù)值見表1）。各組抑制率組間比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=258.395，P<0.05），進(jìn)一步行兩兩比較，各組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），可見在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)細(xì)胞抑制率呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，其IC50值為37.956 μg·m L-1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖1，可見各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均發(fā)生不同程度的凋亡。藥物低、中、高質(zhì)量濃度組的凋亡率分別為3.29%±1.18%、60.23%±4.26%和81.51%± 5.11%，陰性對(duì)照組為2.60%±0.57%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，陰性對(duì)照組與低質(zhì)量濃度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與中、高質(zhì)量濃度組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示中高質(zhì)量濃度組具有明顯的促凋亡作用。

表 1 CCK-8檢測各組的細(xì)胞增殖抑制率Tab 1 CCK-8 detection of cell proliferation inhibition rate n=5

圖 1 流式細(xì)胞儀檢測各實(shí)驗(yàn)組ACC-83細(xì)胞的凋亡Fig 1 The apoptosis of ACC-83 cell in each experimental group was detected by flow cytometry

2.3 Western blot檢測MIF、CD74蛋白的表達(dá)

MIF和CD74蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果見圖2。藥物低、中、高質(zhì)量濃度組MIF蛋白灰度值分別為39 530.17±415.93、26 512.56±5 617.44和20 706.47± 1 358.78，陰性對(duì)照組的灰度值為39 065.78±2 747.97（圖3A）。經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，與陰性對(duì)照組相比，高質(zhì)量濃度組的MIF灰度值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025），其余兩組與陰性對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各實(shí)驗(yàn)組CD74蛋白的灰度值分別為34 078.22±943.24、30 021.12±754.27和11 154.92±385.02，陰性對(duì)照組為34 912.08±1 367.42（圖3B）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，陰性對(duì)照組與低質(zhì)量濃度組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與其余兩組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。該結(jié)果提示，ACC-83細(xì)胞中有MIF、CD74蛋白的表達(dá)，中高質(zhì)量濃度的滇重樓總皂苷可明顯抑制MIF、CD74蛋白的表達(dá)。

圖 2 Western blot檢測各組MIF和CD74蛋白表達(dá)Fig 2 The expression of MIF and CD74 protein in each group de- tected by Western blot

2.4 RT-PCR檢測MIF、CD74 mRNA的表達(dá)

藥物低、中、高質(zhì)量濃度組MIF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.95±0.12、0.86±0.14和0.45±0.09（圖3C），與陰性對(duì)照組（設(shè)為1）相比，高質(zhì)量濃度組中MIF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P=0.001）。各實(shí)驗(yàn)組CD74 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.90±0.107、0.86±0.068和0.56±0.008（圖3D），與陰性對(duì)照組相比，高質(zhì)量濃度組表達(dá)量明顯減少（P<0.05），其余各組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該結(jié)果提示高質(zhì)量濃度的滇重樓總皂苷可明顯抑制MIF和CD74 mRNA的表達(dá)。

圖 3 MIF和CD74蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 3 The relative expression of MIF protein, CD74 protein, MIF mRNA and CD74 mRNA

3 討論

近年來，隨著中藥重樓對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制及治療方法研究的深入，以中藥重樓為主或?yàn)檩o的抗癌藥物已經(jīng)得以應(yīng)用。目前以重樓為主的抗癌藥物肝復(fù)樂已應(yīng)用于臨床，作為原發(fā)性肝癌的輔助治療手段。重樓皂苷的抗腫瘤機(jī)制主要有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，阻遏癌細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制腫瘤血管生成等，但其分子機(jī)制尚不明確。顏璐璐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷有廣泛的抗腫瘤活性，對(duì)10多種腫瘤細(xì)胞株均有抑制作用。目前有關(guān)重樓皂苷對(duì)腺樣囊性癌的研究還較少。本研究表明，重樓皂苷可誘導(dǎo)ACC-83細(xì)胞發(fā)生凋亡，高質(zhì)量濃度組的細(xì)胞凋亡率達(dá)81.51%±5.11%，且無明顯的細(xì)胞毒性作用；中低質(zhì)量濃度組的促凋亡作用較弱，可能是因?yàn)樗幬餅榭偺崛』旌衔?，藥物有效活性成分及純度還有待進(jìn)一步篩選。總體來看，滇重樓總皂苷對(duì)ACC-83細(xì)胞增殖具有有效的抑制作用，這為后續(xù)重樓活性成分及藥效學(xué)的綜合研究奠定了基礎(chǔ)。

MIF是由T細(xì)胞產(chǎn)生的多功能致炎細(xì)胞因子，可抑制單核/巨噬細(xì)胞移動(dòng)，其來源廣泛，除正常組織及免疫細(xì)胞中有表達(dá)外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIF在ACC-83細(xì)胞中也有高表達(dá)。異常表達(dá)的MIF所涉及的多種細(xì)胞信號(hào)通路通過多種方式參與免疫、炎癥、腫瘤等多種病理過程，已經(jīng)成為炎癥和腫瘤等疾病的研究靶標(biāo)。長期慢性炎癥可導(dǎo)致MIF的異常表達(dá)，有助于某些特定腫瘤的生長和侵襲，其主要機(jī)制包括以下兩點(diǎn)。1）下調(diào)p53，上調(diào)環(huán)氧化酶2和前列腺素E2，誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)腫瘤的增殖及侵襲[7-8]。2）異常表達(dá)的MIF可激活促分裂原活化蛋白激酶（m itogen activated protein kinase，MAPK）家族成員和MIF特異性膜受體CD74發(fā)生磷酸化[9-10]，募集CD44形成CD74-CD44復(fù)合體，促進(jìn)下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/AKT，PI3K/Akt）通路持續(xù)活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[11-12]。MIF通過多條經(jīng)典信號(hào)通路的協(xié)調(diào)作用誘導(dǎo)炎癥因子、癌基因及抑癌基因的惡性轉(zhuǎn)化，間接調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，而MIF作為共同樞紐，成為抗炎抗腫瘤治療的最佳靶點(diǎn)[13]。

Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷可誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的線粒體功能障礙及MAPK通路發(fā)生細(xì)胞凋亡。He等[15]研究證實(shí)，重樓可下調(diào)人肺腺癌A549中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metaloproteinase，MMP）-2、MMP-9，抑制其黏附、遷徙及轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIF、CD74在ACC-83細(xì)胞中高表達(dá)，藥物作用于ACC-83細(xì)胞后，MIF、CD74蛋白和mRNA的表達(dá)量隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而降低，高質(zhì)量濃度組MIF與陰性對(duì)照組相比有明顯差異，且與CD74的表達(dá)量呈正相關(guān)。Meyer-Siegler等[16]通過阻滯CD74來阻斷MIF的信號(hào)傳導(dǎo)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可抑制前列腺癌的增殖轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。由此推測，重樓誘導(dǎo)的ACC-83細(xì)胞凋亡與MIF和CD74介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)，這為MIF-CD74作為治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)[17]。

本研究結(jié)果表明，滇重樓總皂苷對(duì)涎腺腺樣囊性癌ACC-83細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，可以有效降低MIF及CD74的表達(dá)，促進(jìn)ACC-83細(xì)胞凋亡，為滇重樓單體及MIF抑制劑的研究提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯 吳愛華）

Inhibitory effect and underlying mechanism of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on the proliferation of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-83 cells

He Qiumin1, Xu Biao1, Wang Weihong1, Bao Chongyun2, Hu Shao-

wei1. (1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650106, China; 2. State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: State Key Laboratory of Oral Diseases Research Project (SKLOD2015OF10); The Research Project of Research Institute of Yunnan Medical and Health Units (2016NS115). Correspondence: Xu Biao, E-mail: xubiao1962@163.com.

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and underlying mechanism of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on the proliferation of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-83 cells.MethodsIn vitro cell culture was performed. The proliferation of ACC-83 cells treated with different concentrations (5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg·mL–1) of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis was observed using CCK-8 assay. Meanwhile, the apoptosis of ACC-83 cells treated with different concentrations (25, 50, 100 μg·m L–1) of the total saponins was observed using flow cytometry. The expression levels of macrophage m igration inhibitory factor (MIF) and CD74 were measured using Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction.ResultsThe total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis induced apoptosis and expressed dose-effect relationship. ACC-83 cells expressed MIF and CD74, and the total saponins suppressed MIF and CD74 expression in ACC-83 cells.ConclusionThe total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis can significantly inhibit the proliferation, suppress MIF and CD74 expression, and promote apoptosis in ACC-83 cells. This study provides a theoretical basis for the treatment of salivary adenoid cystic carcinoma using Paris polyphylla var. yunnanensis.

total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis; salivary adenoid cystic carcinoma; macrophage migration inhibitory factor

R 730.52

A

10.7518/hxkq.2017.03.016

2017-02-18；

2017-04-12

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（SKLOD2015OF10）；云南省醫(yī)療衛(wèi)生單位內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)科研項(xiàng)目（2016NS115）

何秋敏，碩士，E-mail：1165679243@qq.com

許彪，教授，博士，E-mail：xubiao1962@163.com