柚皮苷協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

徐高麗柳毅吳立立史秋濤霍光谷志遠

1.浙江中醫(yī)藥大學口腔醫(yī)學院；2.浙江醫(yī)院口腔科，杭州 310053；3.荷蘭阿姆斯特丹大學口腔種植和修復中心，阿姆斯特丹 1011-1109

柚皮苷協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

徐高麗1,2柳毅1,3吳立立1史秋濤1霍光1谷志遠1

1.浙江中醫(yī)藥大學口腔醫(yī)學院；2.浙江醫(yī)院口腔科，杭州 310053；3.荷蘭阿姆斯特丹大學口腔種植和修復中心，阿姆斯特丹 1011-1109

目的 研究柚皮苷（NAR）聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2對體外培養(yǎng)的成骨前體細胞MC3T3-E1增殖、堿性磷酸酶（ALP）活性及成骨相關基因ALP、骨鈣素（OCN）、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）表達的影響。方法 以成骨細胞株MC3T3-E1為體外藥效的試驗模型，通過A lamar blue法檢測第1、4和7天3種不同濃度NAR（10、100和1 000 μmol·L-1）單獨作用以及分別與50 ng·m L-1BMP-2聯(lián)合誘導對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響。同時在第4天和7天測定成骨細胞內(nèi)ALP活性，采用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測成骨相關基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表達。結果 單純NAR刺激及聯(lián)合BMP-2刺激能夠促進細胞增殖，在NAR濃度為100 μmol·L-1時達到高峰（P<0.05），且該濃度NAR與BMP-2聯(lián)合作用時增殖效果大于兩者單獨作用（P<0.05）。單純NAR刺激及聯(lián)合BMP-2刺激4 d和7 d時均能促進細胞ALP活性，100 μmol·L-1NAR與BMP-2聯(lián)合作用時ALP活性最強（P<0.05）。100~1 000 μmol·L-1的NAR單獨及聯(lián)合作用在不同程度上能促進ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相關基因表達。結論 NAR能有效促進成骨細胞株MC3T3-E1增殖、分化，且適宜濃度的NAR和BMP-2有協(xié)同和促進作用。

成骨細胞； 柚皮苷； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2； 增殖； 分化

足量骨組織是獲得頜面部美學和肌肉骨骼功能的前提條件，腭裂及牙槽嵴裂等是口腔頜面高發(fā)疾病，現(xiàn)今臨床上的修復方式主要是自體骨移植，但其有一定的局限性，往往會引起植骨供區(qū)并發(fā)癥[1]。修復骨缺損在口腔種植、頜面外科等領域仍然是個巨大的挑戰(zhàn)，且隨著口腔種植學的快速發(fā)展，牙槽骨再生和改建已成為國內(nèi)外研究的熱點。生長因子是促進組織再生的條件之一，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一種多功能生長因子，BMP-2是誘導成骨細胞成骨最重要的細胞外信號分子之一[2]，參與骨形成和重建[3]，主要通過調(diào)控成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（osteocalin，OCN）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原酶（collagen Ⅰ，ColⅠ）等成骨相關基因的表達，參與成骨細胞分化，促進骨形成和抑制骨吸收[4-6]。且大量研究[7]表明，用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP）-2進行骨缺損移植與自體骨無明顯差異。然而BMP-2的臨床有效使用劑量非常高[8-9]，這不僅加大了患者的治療成本，同時也帶來高劑量副作用的可能性，因此其臨床應用也較為局限。中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學的精髓，且在治療骨缺損方面具有悠久的歷史考證。柚皮苷（naringin，NAR）是骨碎補中含量最為豐富的黃酮類物質(zhì)，具有補腎強骨、治療骨質(zhì)疏松、促進骨折愈合等功效[10]。目前研究顯示NAR對成骨細胞的增殖有一定的促進作用[11]，也可通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）、蘇氨酸激酶（threonine kinases，Akt）、c-Fos/c-Jun和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）旁路誘導BMP-2的表達，促進成骨細胞的增殖、分化和成熟[12]。且其來源廣泛，藥效作用和化學結構基本明確，符合現(xiàn)代中藥的發(fā)展趨勢，有較好的臨床運用前景。

本實驗采用成骨前體細胞MC3T3-E1進行培養(yǎng)，觀察不同濃度NAR及與BMP-2聯(lián)合作用時對成骨細胞增殖、ALP活性以及成骨相關基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ表達的影響，為NAR和BMP-2在臨床牙槽骨缺損的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

成骨前體細胞系MC3T3-E1（上海中科院細胞庫）；中藥NAR單體（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；細胞培養(yǎng)基α-MEM和胎牛血清（GibcoTMInvitrogen公司，美國）；rhBMPs（R&D Systems Inc，美國）；細胞裂解液（Sigma-Aldrich公司，美國）；ALP檢測試劑盒（W ako Pure Chem icals公司，日本）；BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；總RNA抽提試劑盒（Giagen GmbH公司，德國）；逆轉(zhuǎn)錄反應和實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計分組 實驗共分8組：1）對照組（A組）；2）50 ng·m L-1BMP-2（B組）；3）10 μmol·L-1NAR（C組）；4）10 μmol·L-1NAR+50 ng·m L-1BMP-2（D組）；5）100 μmol·L-1NAR（E組）；6）100 μmol·L-1NAR+50 ng·m L-1BMP-2（F組）；7）1 000 μmol·L-1NAR（G組）；8）1 000 μmol·L-1NAR+50 ng·m L-1BMP-2（H組），每組均設6個復孔。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 成骨前體細胞MC3T3-E1培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的α-MEM培養(yǎng)基中，每3 d更換培養(yǎng)基。處于指數(shù)生長期的細胞接種24 h后予以1%FBS-α-MEM饑餓培養(yǎng)24 h，使細胞狀態(tài)基本一致，然后分別在各培養(yǎng)孔中加入不同濃度的NAR單體和rhBMPs進行誘導刺激，每3 d更新培養(yǎng)基以及細胞因子，用于細胞增殖、ALP活性及成骨相關基因檢測。

1.2.3 細胞增殖檢測 采用Alamar blue方法檢測不同濃度NAR單體和rhBMP-2對MC3T3-E1細胞增殖的影響，細胞以每孔1×104個接種于24孔板，收取各組經(jīng)刺激培養(yǎng)1、4和7 d后的細胞裂解液，根據(jù)Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Reagent and kits試劑盒使用說明配制反應體系，Ex480 nm/Em520 nm讀取熒光密度，測得各組細胞DNA含量，用來反映細胞增殖數(shù)量。

1.2.4 ALP活性檢測 細胞以每孔2×105個接種于6孔板，收取各組經(jīng)刺激培養(yǎng)4 d和7 d后的細胞裂解液，采用LabAssayTMALP檢測試劑盒檢測細胞裂解液中的ALP活性，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測細胞總蛋白濃度。各組細胞裂解液的ALP活性值均用相應的細胞總蛋白濃度予以校準，求得各組相對ALP活性值。

1.2.5 qRT-PCR檢測成骨相關基因的表達 細胞以每孔2×105個接種于6孔板，各組經(jīng)刺激培養(yǎng)4 d和7 d后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，采用RNeasy M ini Kit和RNase-Free DNase Set試劑盒抽提細胞總RNA，檢測基因濃度及完整性，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應合成相應cDNA，以β-actin為管家基因。配制real-time PCR 20 μL反應體系，進行qRT-PCR檢測（反應參數(shù)均根據(jù)試劑盒使用說明），反應完成后進行擴增曲線和熔解曲線分析?；虮磉_量以檢測基因的初始模板量表示（2-ΔΔCt）。全部引物序列由上海皓嘉科技發(fā)展有限公司合成，引物序列見表1。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行分析，行單因素方差分析，以LSD法進行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖效應

A lamar blue法結果表明：單純NAR刺激1 d和4 d時均能促進細胞增殖（P<0.05），表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，NAR濃度為100 μmol·L-1時達到高峰。然而在培養(yǎng)7 d后，10~100 μmol·L-1的NAR均能夠促進細胞增殖（P<0.05），而1 000 μmol·L-1的NAR對細胞增殖有抑制作用，且有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。不同濃度NAR與BMP-2聯(lián)合作用時較NAR單獨作用更能促進細胞增殖，100 μmol·L-1的NAR與BMP-2聯(lián)合作用時增殖效果最明顯（P<0.05）（圖1）。

2.2 細胞ALP活性檢測結果

ALP活性是評價細胞成骨分化的早期指標。ALP活性檢測中，NAR單獨及聯(lián)合BMP-2作用時，ALP活性的表達隨著NAR濃度呈先上升后下降趨勢，在NAR濃度為100 μmol·L-1時達到了峰值(P<0.05)。100 μmol·L-1的NAR與BMP-2聯(lián)合作用時ALP活性上調(diào)最明顯，顯著高于其他組（圖2）。

圖 1 NAR單獨及聯(lián)合BMP-2刺激成骨前體細胞MC3T3-E1后細胞DNA含量Fig 1 DNA content of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cells) after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

圖 2 NAR單獨及聯(lián)合BMP-2刺激成骨前體細胞MC3T3-E1后細胞ALP活性情況Fig 2 The ALP activity of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cells) after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

2.3 成骨相關基因的表達結果

根據(jù)上述ALP活性檢測結果，NAR單體在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴效應曲線，故后期用于基因表達水平比較研究的NAR濃度范圍為10~1 000 μmol·L-1。

從熒光定量PCR顯示的結果可見：NAR在100~ 1 000 μmol·L-1時能促進Runx2表達，100 μmol·L-1濃度的NAR與BMP-2有協(xié)同促進作用，尤其是4 d時聯(lián)合使用的效果遠大于兩者單獨使用（P<0.05）。在10~ 1 000 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，NAR上調(diào)細胞ALP基因表達的濃度效應關系呈現(xiàn)直線型，4 d時1 000 μmol·L-1對ALP基因的表達效果最明顯（P<0.05）。單純NAR刺激及NAR聯(lián)合BMP-2刺激4 d和7 d時均能促進細胞ColⅠ mRNA的表達。4 d時10 μmol·L-1的NAR聯(lián)合BMP-2能明顯促進ColⅠ mRNA的表達（P<0.05），7 d時100 μmol·L-1的NAR單獨使用及與BMP-2聯(lián)合均有顯著促進作用（P<0.05）。單純NAR刺激及NAR聯(lián)合BMP-2刺激4 d和7 d均能夠明顯促進細胞OCN mRNA的表達，呈濃度依賴型。隨著濃度的增大，優(yōu)勢更明顯，尤其在第7天時，100~1 000 μmol·L-1的NAR單獨刺激與聯(lián)合BMP-2均有顯著作用（P<0.05）（圖3）。

圖 3 NAR單獨及聯(lián)合BMP-2刺激成骨前體細胞MC3T3-E1后成骨相關基因表達情況Fig 3 The relative expression of osteogenic genes after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

3 討論

隨著口腔種植修復技術的快速發(fā)展，種植也成為了更多臨床醫(yī)生及患者修復牙列缺損及缺失的選擇，然而骨缺損、骨質(zhì)疏松等嚴重影響種植體的骨結合及初期穩(wěn)定性，甚至導致修復失敗。臨床上采用了不同的骨增量方法和植骨材料，促進種植體周圍缺損區(qū)的骨形成。骨碎補是治療骨相關性疾病常用的中藥，NAR是其主要活性成分，普遍存在于柑橘類水果和許多中藥中。Wong等[13]通過向兔顱骨缺損區(qū)域移植不同材料，發(fā)現(xiàn)NAR聯(lián)合膠原基質(zhì)能有效地促進新骨組織生成，且成骨作用優(yōu)于自體骨移植，從而說明NAR可被作為骨移植材料使用。NAR可以明顯地提高骨鈣素、骨橋蛋白和BMP-2的分泌量，促進與成骨相關因子：堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast grow th factor，bFGF）、胰島素樣生長因子-1（insulin-like grow th factor-1，IGF-1）、Runx2、成骨細胞特異基因（Osterix）和雌激素受體（estrogen receptor，ER）α及ERβ mRNA的表達，同時也可以增強ERα、ERβ和ColⅠ的分泌，通過雌激素信號通路來發(fā)揮其成骨作用[14]。另一方面NAR可以通過抑制核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）誘導的核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulatedkinas，ERK）的活性來阻止破骨細胞的形成以減少骨吸收的發(fā)生[15]。NAR可以通過調(diào)節(jié)成骨細胞及破骨細胞之間的平衡來調(diào)節(jié)骨代謝，促進骨形成，從而修復骨缺損。

BMP-2通路是最主要的成骨信號通路之一，可通過上調(diào)Msx2基因刺激Wnt信號通路促進骨祖細胞成骨性分化，還可激活誘導信號轉(zhuǎn)導蛋白Smads調(diào)控基因和Osterix基因，并調(diào)節(jié)ALP、ColⅠ、OCN、骨橋蛋白（osteoprontin，OPN）等多種細胞因子的表達促進成骨[16]。然而BMP-2的臨床有效使用劑量非常高，達到毫克級別[8]，這對患者來說是個巨大的經(jīng)濟負擔，且大劑量使用BMP會有一定的不良反應，如刺激破骨細胞活性、異位骨生成。因此其臨床應用較為局限。

MC3T3-E1細胞株具有體外培養(yǎng)成骨細胞的各種生物學特性，是良好的體外培養(yǎng)成骨細胞株，已經(jīng)成為了研究藥物對成骨細胞影響的有價值的體外細胞模型[17]。本研究結果發(fā)現(xiàn)在第1天和第4天時，10~1 000 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，NAR單獨作用和NAR與BMP-2聯(lián)合作用均能夠顯著地促進成骨細胞增殖，且在100 μmol·L-1時達到峰值，可見NAR對細胞增殖的促進作用有一定的濃度依賴性。然而在第7天時，1 000 μmol·L-1的NAR對細胞的增殖有抑制作用，可能提示在第7天時高濃度的NAR以促進細胞分化為主。

ALP的活性是衡量成骨細胞早期分化的指標，本實驗中在第4、7天中隨著時間的延長ALP活性增強，表現(xiàn)出時間依賴性。ALP、OCN、Runx2、COlⅠ均是成骨細胞分化的指標。Runx2是骨形成最早的標志基因，是成骨細胞開始分化的標志，能夠激活骨鈣蛋白、骨橋素、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和COlⅠ基因的轉(zhuǎn)錄和表達[18]。ColⅠ則由成熟成骨細胞分泌[19]。實驗中Runx2與COlⅠ表現(xiàn)出相同的趨勢提示Runx2與COlⅠ為2個相關聯(lián)指標，存在級聯(lián)反應，這也跟文獻研究[20]一致。ALP是成骨細胞早期分化標志。OCN是由分化期成骨細胞分泌的蛋白，可反映成骨細胞的活躍程度[21]，是成骨細胞成熟的標志[22]。實驗中發(fā)現(xiàn)總體上而言隨著藥物濃度升高，刺激細胞分化的能力也相應增加。然而NAR和BMP-2在促進ALP、Runx2、ColⅠ、OCN均表現(xiàn)出不同作用，提示適宜濃度的NAR單獨及聯(lián)合BMP-2能夠從早期到晚期提高MC3T3-E1細胞分化。并且在實驗中，100 μmol·L-1的NAR聯(lián)合BMP-2聯(lián)合刺激成骨細胞，增殖活性，ALP活性以及分化能力明顯高于單純100 μmol·L-1的NAR刺激和單純的BMP-2刺激，提示該濃度的NAR與BMP-2對成骨細胞具有協(xié)同作用，可能兩者共同促進激活某一信號通路有關，其具體機制有待進一步研究。

本實驗初步研究了NAR與BMP-2的聯(lián)合誘導作用，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的NAR與BMP-2具有協(xié)同作用，可促進成骨細胞的增殖、分化和成熟。中藥NAR來源廣泛，不良反應小，而BMP-2被認為是活性最強的誘導成骨因子之一。兩者的聯(lián)合誘導作用，不但能有效促進骨形成，而且也大大降低了臨床治療骨缺損的成本，縮短了治療的時間，擴大治療骨缺損的適應證，為臨床治療骨缺損提供新的思路和研究方向。

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（本文編輯 杜冰）

ObjectiveThis study evaluates the biological effects of naringin (NAR) joint bone morphogenetic protein (BMP)-2 on the proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, and expression of osteoblastogenic genes, such as Runtrelated transcription factor 2 (Runx2), collagen Ⅰ (ColⅠ), ALP, and osteocalcin (OCN) of pre-osteoblasts.MethodsThree different NAR concentrations (10, 100, and 1 000 μmol·L-1) were applied, alone or combined with BMP-2(50 ng·m L-1), to restore the osteoblastogenesis of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cell line). Cell numbers (proliferation) were evaluated at first, fourth, and seventh days by Alamar blue assay. ALP activity and the expression of osteoblastogenic genes, such as Runx2, ColⅠ, ALP, and OCN were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) at fourth and seventh day.ResultsStimulation by NAR alone and in combination with BMP-2 for 1 day and 4 days could promote cell proliferation, which peaked at a concentration of 100 μmol·L-1NAR combined with BMP-2 could promote cell proliferation significantly (P<0.05). Stimulation by NAR alone and in combination with BMP-2 for 4 and 7 days could promote ALP activity and bone-related gene(ALP, OCN, Runx2, ColⅠ) expression. ALP expression was significantly promoted after stimulation of 100 μmol·L-1NAR and BMP-2 (P<0.05).ConclusionNAR exhibits prom ising potential for improving MC3T3-E1proliferation and differentiation, and appropriate concentrations of NAR and BMP-2 show synergistic effect.

osteoblast; naringin; bone morphogenetic protein-2; proliferation; differentiation

Q 26

A

10.7518/hxkq.2017.03.009

2016-03-04；

2017-03-10

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2014ZB028）

徐高麗，碩士，E-mail：852819264@qq.com

霍光，講師，碩士，E-mail：495974415@qq.com

Effect of naringin combined with bone morphogenetic protein-2 on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1cells G

aoli1,2, Liu Yi1,3, Wu Lili1, Shi Qiutao1, Huo Guang1, Gu Zhiyuan1. (1. School of Stomatology, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Dept. of Stomatology, Zhejiang Hospital, Hangzhou 310053, China; 3. Dept. of Dental Implant and Prosthetics, University of Amsterdam, Amsterdam 1011-1109, Holland) Supported by: Zhejiang Medical Science and Technology Plan Project (2014ZB028) . Correspondence: Huo Guang, E-mail: 495974415@qq.com.