利用SSR標(biāo)記分析西瓜自交系的遺傳關(guān)系

許彥賓，王艷玲，溫新惠，胡建斌，李 瓊，孫守如，馬長生

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 鄭州 450002； 2.平羅縣種子管理站 寧夏平羅 753400）

利用SSR標(biāo)記分析西瓜自交系的遺傳關(guān)系

許彥賓1，王艷玲1，溫新惠2，胡建斌1，李 瓊1，孫守如1，馬長生1

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 鄭州 450002； 2.平羅縣種子管理站 寧夏平羅 753400）

為了明確西瓜自交系間的遺傳關(guān)系，采用SSR和EST-SSR標(biāo)記分析34份高代自交系的基因型，計算各材料間的相似系數(shù)，并進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，9個基因組SSR和8個EST-SSR標(biāo)記共檢測到83個等位基因，平均4.88個，PIC值變幅為0.112～0.686，平均0.425，基因組SSR的多態(tài)性明顯高于EST-SSR。所有材料聚為A、B、C 3類，B、C 2類包含多態(tài)性較高的4份自交系（X36、X48、X84和X89），均為來自西北地區(qū)的小果型材料，可以用來豐富栽培西瓜的多樣性；A類包含剩余的30份自交系，主要是國內(nèi)外的單果質(zhì)量大于或等于1.5 kg的材料（除X38、X80外），其遺傳多樣性較低，遺傳背景需要進(jìn)一步拓展。A類可分為3個亞類，每個亞類材料的植物學(xué)性狀和來源地大不相同。研究結(jié)果將為西瓜雜交親本選配和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

西瓜；自交系；SSR；遺傳關(guān)系

雜交育種是目前大多數(shù)園藝作物培育新品種的主要方法，其首要條件是具備一定遺傳差異的親本材料[1]。西瓜是我國主要園藝作物，種植面積和產(chǎn)量位居世界前列[2]。但我國不是西瓜的發(fā)源地，種質(zhì)資源相對匱乏。20世紀(jì)60年代，我國從美國、日本、前蘇聯(lián)等國家引入了許多優(yōu)良西瓜品種，促進(jìn)了西瓜主要農(nóng)藝性狀的遺傳改良，也極大地推動了我國西瓜品種的更新?lián)Q代[3]。有研究表明，栽培西瓜的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，特別是品種之間DNA水平的差異較小[4-5]，限制了雜交親本的選擇。近年來，我國西瓜栽培面積穩(wěn)中有增，消費市場多元化發(fā)展趨勢愈加明顯，品種更新速度也愈來愈快。但由于大多數(shù)西瓜育種者只重視雜交組合的配制而忽視育種材料遺傳關(guān)系評價，頻繁地利用少數(shù)親緣關(guān)系較近的骨干親本配制雜交組合，以致新育成品種的一些重要農(nóng)藝性狀未得到明顯改良，因而難以育成突破性的西瓜新品種。隨著西瓜全基因組測序的完成，利用分子標(biāo)記技術(shù)分析西瓜育種材料的遺傳關(guān)系，有助于育種者在DNA水平上選擇具有差異的育種材料，從而實現(xiàn)對西瓜重要農(nóng)藝性狀的有效改良[6]。

目前，RAPD、AFLP、SSR等多種分子標(biāo)記已用于西瓜的遺傳多樣性分析，其中SSR分子標(biāo)記因其穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、共顯性、多等位性等優(yōu)點而應(yīng)用更為廣泛[7-9]。筆者采用SSR標(biāo)記對34份西瓜自交系的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，以期選擇在DNA水平上具有差異的育種材料，為西瓜雜交親本的選配提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為34份西瓜自交系，由河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司提供（表1）。所有材料均是從國內(nèi)外多個西瓜商業(yè)品種中自交分離而得，自交7代以上，主要農(nóng)藝性狀已經(jīng)穩(wěn)定，但自交系的含糖量與雜交種相比普遍偏低。2010—2015年在鄭州滎陽田間連續(xù)種植，性狀調(diào)查見表1（5 a平均值），各材料在果實性狀方面存在較大的差異，可溶性固形物含量取果實中心至邊緣1/2處的果肉測定。

表1 2010—2015年34份西瓜材料及果實性狀調(diào)查

1.2 SSR-PCR擴增

采用CTAB小量法[10]從西瓜幼嫩葉片中提取基因組DNA，利用紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度，將其稀釋到終濃度20 ng·μL-1。試驗采用基因組SSR和EST-SSR進(jìn)行基因型鑒定，基因組SSR引物選自Joobeur等[11]的報道，EST-SSR引物選自Guerra-Sanz[12]和Verma等[13]的報道，篩選多態(tài)性好的SSR引物。PCR反應(yīng)體系15 μL，其中包括：1×Buffer，1.5 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1dNTPs，0.4 μmol·L-1引物，1 UTaq酶，50 ng DNA模板。PCR反應(yīng)在PTC-200型PCR擴增儀（MJ Reserch，Inc.）上進(jìn)行。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸6 min。擴增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，進(jìn)行銀染、顯帶。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以PCR條帶在凝膠中相對遷移位置的有無賦值為“1”或“0”，生成分子數(shù)據(jù)矩陣。采用Jaccard[14]的方法計算各材料間的遺傳距離和相似系數(shù)，利用NTSYS-pc 2.10軟件中的不加權(quán)成對算術(shù)平均法（UPGMA）對34份自交系進(jìn)行聚類，繪制樹狀聚類圖。根據(jù)Botstein等[15]報道的方法計算SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information con?tent）值，即PIC=1-∑Xi2，其中Xi表示第i種基因型出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性

根據(jù)文獻(xiàn)報道共合成了35對SSR引物，從中篩選出帶譜清晰、多態(tài)性好的17對。其中，基因組SSR引物9對，EST-SSR引物8對。17對引物對34份西瓜自交系的擴增結(jié)果見表2。所有引物共檢測到83個等位基因，平均每對引物檢測到4.88個，MCPI05檢測到的等位基因數(shù)最多（10個），EST00667檢測到的等位基因數(shù)最少（2個）；PIC值變幅 0.112（EST00667）～0.686（MCPI11），平均0.425，圖1為MCPI11電泳圖。基因組SSR的平均等位基因數(shù)和 PIC值分別為 5.89和 0.514，EST-SSR的平均等位基因數(shù)和PIC值分別為3.75和0.326，基因組SSR的多態(tài)性明顯高于EST-SSR。

圖1 MCPI11非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

表2 17對SSR引物的特征及其多態(tài)性

2.2 西瓜自交系的遺傳多樣性

為了明確西瓜各自交系之間的遺傳關(guān)系，采用SSR基因型數(shù)據(jù)計算各材料之間的相似系數(shù)，獲得34份自交系的相似系數(shù)矩陣。結(jié)果表明，所有材料的相似系數(shù)變幅為 0.24～0.93，平均相似系數(shù)為0.56，X66與X61的相似系數(shù)最大，X82或X85與X36之間的相似系數(shù)最小。如果排除自交系X36，所有材料的平均相似系數(shù)為0.65。上述結(jié)果說明，西瓜自交系之間的遺傳分化較小，遺傳背景較為狹窄。

2.3 西瓜自交系的聚類分析

根據(jù)各材料間的相似系數(shù)對所有自交系進(jìn)行聚類作圖，以明確其遺傳關(guān)系。圖2表明，34份材料在相似系數(shù)為0.48的水平上可聚為A、B、C共3類。其中，X36單獨成一類（C類），說明其遺傳背景較為獨特。B類也僅包括3份自交系，即X48、X84和X89。這2類所包含的4份材料均為小果型自交系（單果質(zhì)量小于1.2 kg），是從中國西北地區(qū)的西瓜品種中分離所得，具有較高的遺傳多樣性。

圖2 34份西瓜自交系的聚類結(jié)果

除B、C類之外的30份自交系全部聚集在A類，其平均相似系數(shù)高達(dá)0.78，說明該類材料遺傳多樣性不足，遺傳背景十分狹窄。A類中，X38可單獨作為一個亞類，其他29份材料分別可劃分為3個亞類，第1個亞類有9份材料（X2、X61、X66、X63、X81、X78、X57、X50、X64），第2個亞類有11份材料（X55、X49、X35、X90、X101、X95、X93、X59、X70、X39、X40），第3個亞類有9份材料（X1、X68、X91、X82、X85、X43、X67、X80、X75），每個亞類材料的來源地并不一致，其果實性狀也有一定的差異。A類中，除X38、X80外，其他單果質(zhì)量都大于或等于1.50 kg

3 討 論

本研究中自交系的可溶性固形物含量普遍比雜交種偏低，原因可能有幾點：1）自交系果實含糖量一般會低于雜交種；2）自交系果實中心至邊緣可溶性固形物含量梯度差異較大，其中間部位含量偏低；3）2010—2015年自交系材料均是露地種植，管理相對粗放，采收期為6月下旬至7月上旬，此時正是多雨季節(jié)，土壤水分過高則降低了果實的可溶性固形物含量。

SSR標(biāo)記可分為基因組SSR和EST-SSR，前者來源于基因組的重復(fù)序列，一般通過構(gòu)建文庫、篩選、測序等步驟開發(fā)，后者是基于cDNA文庫克?。‥ST序列）的重復(fù)序列開發(fā)所得[16]。由于EST-SSR來源于轉(zhuǎn)錄組序列，其多態(tài)性很有可能與該物種的性狀有關(guān)，因而被認(rèn)為是“絕對”的遺傳標(biāo)記，但其多態(tài)性一般低于基因組SSR。本研究結(jié)果表明，EST-SSR所檢測到的等位基因數(shù)和PIC值均低于SSR，與Fernandez-Silva等[17]的報道一致。Mondini等[18]認(rèn)為利用2種或2種以上的分子標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，可提高基因組覆蓋率，檢測更多的基因組變異。

基于2種分子標(biāo)記的研究結(jié)果表明，34份西瓜自交系的平均相似系數(shù)為0.56，大體可分為3類（A、B和C）。其中，B、C 2類包含4份自交系（X36、X48、X84和X89），其果實較小，均從中國新疆、甘肅等地的品種中自交分離所得，具有較高的遺傳多樣性。在主要植物學(xué)性狀上，這些小果型材料與當(dāng)?shù)氐牡胤狡贩N極為相似，可以作為育種材料增加栽培西瓜的遺傳多樣性，但其農(nóng)藝性狀（適應(yīng)性、抗病性等）有待進(jìn)一步考察。

A類包含30份自交系，除X38外均為大果型材料，平均相似系數(shù)高達(dá)0.78，其遺傳背景十分狹窄。盡管A類存在3個明顯的亞類，但并不能依據(jù)材料的性狀和來源歸類，說明不同地區(qū)的材料之間可能存在基因交換。仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，來自美國的5份自交系（X43、X63、X75、X81和X91）和日本的2份自交系（X49和X95）均歸在A類，與國內(nèi)西瓜品種的自交系聚在一起，說明國內(nèi)外西瓜材料間可能有一定的血緣關(guān)系。中國曾在20世紀(jì)60年代大規(guī)模引進(jìn)美國和日本的商業(yè)西瓜品種，如美國的‘Charleston Gray’‘Jubilee’‘Crimson Sweet’‘Sugar?lee’‘Sugar Baby’等，日本的主要是新大和、旭大和系列[3]，這些品種及其衍生系被反復(fù)用作雜交親本，在中國西瓜的育種歷史上發(fā)揮了重要作用，可以說中國的西瓜品種具有很深的美國、日本品種的烙印。雖然34份自交系的系譜無法全部考證，但這些引種事實可以部分解釋國內(nèi)外材料緊密聚類在一起的原因。Levi等[19]曾報道非洲野生西瓜的遺傳多樣性極為豐富，且具有較強的抗病性、適應(yīng)性，可以用來拓寬栽培西瓜的遺傳背景。但這些野生材料的抗病或抗逆基因一般與品質(zhì)不利基因（如苦味、澀味等）連鎖，因此在應(yīng)用過程中應(yīng)注意利用輻射、化學(xué)誘變、多代回交等方法打破遺傳連鎖，加快種質(zhì)資源的創(chuàng)新與性狀改良進(jìn)程。

[1]曹家樹，申書興．園藝植物育種學(xué)[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2001．

[2]馬躍．透過國際分析，看中國西瓜甜瓜的現(xiàn)狀與未來[J]．中國瓜菜，2011，24（2）：64-67.

[3]劉文革．我國西瓜品種選育研究進(jìn)展[J]．中國瓜菜，2016，29（1）：1-7.

[4]LEVI A，THOMAS C E，WEHNER T C，et al．Low genetic diversity indicates the need to broaden the genetic base of cultivated watermelon[J]．HortScience，2001，36（6）：1096-1101．

[5]LEVI A，THOMAS C E，KEINATH A P，et al．Genetic diversity among watermelon（Citrullus lanatusandCitrullus colocynthis）accessions[J]．Genetic Resources Crop Evoution，2001，48（6）：559-566.

[6]GUO S，ZHANG J，SUN H，et al．The draft genome of watermelon（Citrullus lanatus）and resequencing of 20 diverse accessions[J]．Nature Genetics，2013，45（1）：51-60．

[7]劉傳奇，高鵬，欒非時．西瓜遺傳陶譜構(gòu)建及果實相關(guān)性狀QTL分析[J]．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（14）：2814-2829．

[8]高磊，趙勝杰，路緒強，等．西瓜回交世代酸味株系基因型分析[J]．中國瓜菜，2016，29（4）：5-9.

[9]REDDY U K，NIMMAKAYALA P，LEVI A，et al．High-resolu?tion genetic map for understanding the effect of genome-wide recombination rate on nucleotide dilversity in watermelon[J]．G3：Genes|Genomes|Genetics，2014，4（11）：2219-2230.

[10]MURRAY M G，THOMPSON W F．Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]．Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4325.

[11]JOOBEUR T，GUSMINI G，ZHANG X，et al．Construction of a watermelon BAC library and identification of SSRs anchored to melon orArabidopsisgenomes[J]．Theoretical and Applied Genetics，2006，112（8）：1553-1562．

[12]GUERRA-SANZ J M．Citrullussimple sequence repeats markers from sequence databases[J]．Molecular Ecology Notes，2002，2（3）：223-225．

[13]VERMA M，ARYA L．Development of EST-SSRs in watermelon（Citrullus lanatusvar.lanatus）and their transferability toCucumisspp.[J]．Journal of Horticultural Science&Biotechnology，2008，83（6）：732-736．

[14]JACCARD P．Nouvelles recherches sur la distribution florale[J]．Bulletin De La Societe Vaudoise Des Sciences Naturelles，1908，44（163）：223-270．

[15]BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al．Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]．American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331．

[16]KALIA R K，RAI M K，KALIA S，et al．Microsatellite markers：an overview of the recent progress in plants[J]．Euphytica，2011，177（3）：309-334．

[17]FERNANDEZ-SILVA I，EDUARDO I，BLANCA J，et al．Bin mapping of genomic and EST-derived SSRs in melon（Cucumis meloL.）[J]．Theoretical and Applied Genetics，2008，118（1）：139-150.

[18]MONDINI L，NOORANI A，PAGNOTTA M A．Assessing plant genetic diversity by molecular tools[J]．Diversity，2009，1（1）：19-35.

[19]LEVI A，THOMAS C E，KEINATH A P，et al．Estimation of genetic diversity amongCitrullusaccessions using RAPD markers [J]．Hortscience，2000，35（3）：385-390．

The use of SSR markers for analyzing the genetic relationship among watermelon inbred lines

XU Yanbin1，WANG Yanling1，WEN Xinhui2，HU Jianbin1，LI Qiong1，SUN Shouru1，MA Changsheng1
(1.College of Horticulture，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，Henan，China;2.Seed Control Station of Pingluo Country，Pingluo 753400，Ningxia，China)

The present study aims to identify the relationship among the watermelon inbred lines by using SSR markers.Two markers，SSR and EST-SSR，were used to analyze the genotypes of the 34 inbred lines，which was adopted to calculate the similarity coefficient among the accessions and then cluster the accessions.The results showed that 9 genomic SSRs and 8 EST-SSRs detected 83 alleles totally，with a mean of 4.88.The PIC value ranged from 0.112 to 0.686，averaging 0.425.The polymorphism level of genomic SSR was higher than EST-SSR.All the materials were clustered into 3 groups(A，B and C). of the groups，B and C contained 4 accessions(X36，X48，X84，and X89)with high polymorphism，which were small fruit type accessions collected from northwest region.The 4 accessions could be used to increase the polymorphism of the cultivated watermelon.Group A contained the rest 30 domestic and foreign inbred lines which fruit weight no less than 1.5 kg with an exception of X38 and X80.These accessions had a low polymorphism and the genetic background need to be ex?panded further.Group A could be subdivided into 3 subgroups，each of which contained accessions with different origins and botanical characters.The results obtained here will offer theoretical basis for parent selection of watermelon cross breeding and new germplasm creation.

Watermelon;Inbred lines;SSR;Genetic relationship

2017-02-10；

：2017-03-14

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金項目（2014D00000103)

許彥賓，男，在讀碩士研究生，研究方向為西甜瓜遺傳育種。E-mail：xuyanb0514@163.com

胡建斌，男，教授，研究方向為西甜瓜遺傳育種。E-mail：jianbinhu@henau.edu.cn