制固態(tài)曲參數(shù)對(duì)醬油曲中Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

梁晉維，李斌，俞東陽(yáng)，萬(wàn)茵，劉成梅,3，付桂明,3*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，南昌 330031；3.南昌大學(xué)中德食品工程中心，南昌 330047)

制固態(tài)曲參數(shù)對(duì)醬油曲中Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

梁晉維1,2，李斌1,2，俞東陽(yáng)1,2，萬(wàn)茵1,2，劉成梅1,2,3，付桂明1,2,3*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，南昌 330031；3.南昌大學(xué)中德食品工程中心，南昌 330047)

以5種米曲霉為出發(fā)菌株，篩選獲得產(chǎn)蛋白酶活力最強(qiáng)的米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03，通過單因素試驗(yàn)研究麩皮豆粕比、加水量、接種量、時(shí)間和培養(yǎng)溫度等醬油固態(tài)制曲因素對(duì)AspergillusoryzaeNCFEC03產(chǎn)蛋白酶的影響。選取影響較大的3個(gè)因素：麩皮豆粕比、加水量和接種量進(jìn)行正交試驗(yàn)。經(jīng)極差和方差分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)醬油曲中蛋白酶活力影響的先后順序?yàn)椋蝴熎ざ蛊杀?加水量>接種量，其中麩皮豆粕比具有最顯著的影響。最佳制曲條件為麩皮豆粕比1∶1、加水量80%(V/W，干曲)、接種量0.8%、30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力為(1687.6±4.9) U/g干曲。

醬油；固態(tài)制曲參數(shù)；米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03；蛋白酶活力

我國(guó)是世界醬油產(chǎn)量大國(guó)。醬油是一種以大豆、小麥和食鹽等原料經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的色、香、味俱備的調(diào)味品[1]。醬油釀造涉及的微生物主要有米曲霉(Aspergillusoryzae)、醬油曲霉(Aspergillussojae)、酵母菌(Saccharomyces)和乳酸菌(Lactobacillus)等，其中米曲霉具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)酶能力強(qiáng)、酶活力高等特點(diǎn)，是醬油釀造的基礎(chǔ)和核心菌種[2-4]。米曲霉能分泌多種酶系，包括蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和酯酶等[5]，其制曲釀制的醬油香氣好。目前我國(guó)醬油釀造常用的米曲霉菌株有：Aspergillusoryzae3.863、滬釀3.042、UE336、UE328和渝3.811等，其中最常用的滬釀3.042來源于福建省永春縣醬園，經(jīng)上海釀造科學(xué)研究所誘變選育獲得[6]。

醬油的發(fā)酵是醬油曲中微生物代謝的一系列復(fù)雜的酶水解及美拉德反應(yīng)的過程。醬油曲中主要的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和谷氨酸脫氫酶等，其中蛋白酶活性的高低決定了醬油中可溶性含氮物的含量、風(fēng)味形成。研究表明：利用米曲霉所產(chǎn)蛋白酶的水解作用，將豆類中的蛋白質(zhì)降解成多肽、氨基酸，發(fā)酵醬油口味好、營(yíng)養(yǎng)豐富。

醬油釀造過程中原料比、發(fā)酵溫度、含水量等發(fā)酵工藝參數(shù)均對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力有較大影響[7,8]。因此，研究醬油固態(tài)釀造中制曲條件對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響，對(duì)提高醬油質(zhì)量和原料利用率具有重要意義[9]。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

5種米曲霉菌株：AspergillusoryzaeNCFEC01～AspergillusoryzaeNCFEC05，來自實(shí)驗(yàn)室保藏。土豆、麩皮、豆粕，均為市售；L-酪氨酸、酪蛋白，購(gòu)自Sigma公司；NaCl、Na2CO3、福林試劑、三氯乙酸、硫酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基

取200 g去皮去芽眼的馬鈴薯，切成細(xì)條，加入500 mL水，小火煮沸30 min后2層紗布過濾，馬鈴薯?xiàng)l用200 mL水再洗1次，過濾，混合2次濾液，加入蔗糖20 g、瓊脂20 g，定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 種曲培養(yǎng)基

在250 mL三角瓶中加入20 g過10目篩的麩皮豆粕混合物(麩皮∶豆粕為1∶1)，加入70%(V/W，干基)的水拌勻，121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 制曲培養(yǎng)基

取50 g不同比例麩皮豆粕混合物，加入500 mL三角瓶中，加入80%(V/W，干基)的水拌勻，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器

T6新世紀(jì)型號(hào)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE28型酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；JA5003型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SCV-4A1型超凈工作臺(tái) 廈門精藝興業(yè)科技有限公司；PH50型生物顯微鏡 江西鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蛋白酶活性的測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活性[10]：取5 g曲樣研磨成粉狀，用100 mL蒸餾水于40 ℃浸提1 h得粗酶液，取1 mL粗酶液于10 mL試管中，40 ℃預(yù)熱2 min，加預(yù)熱的2%酪蛋白溶液1 mL，保溫10 min，加2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，40 ℃繼續(xù)保溫20 min，離心去除蛋白沉淀，取1 mL上清液于試管中，加5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL福林試劑，搖勻，40 ℃水浴中保溫20 min，取出測(cè)OD660?？瞻讟蛹? mL 0.4 mol/L的三氯乙酸，保溫10 min，加預(yù)熱的2%酪蛋白溶液1 mL。

將40 ℃下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)單位蛋白酶活力(U)。

2.2 高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株的篩選

以PDA培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化米曲霉菌種，取20 g種曲培養(yǎng)基，接種各株米曲霉，于30 ℃培養(yǎng)72 h，采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活力，選取產(chǎn)蛋白酶活力高的菌株。

制曲工藝流程：

取一定量種曲到定量生理鹽水中，震蕩搖勻后，均勻加入曲料，30 ℃左右恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間，當(dāng)曲料表面著生黃綠色孢子，并散發(fā)曲香時(shí)出曲[11]，獲得無酸味、氨味等不良異味的成品曲。

2.4 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)研究麩皮豆粕比、加水量、接種量、時(shí)間和培養(yǎng)溫度等不同條件對(duì)醬油制曲過程中蛋白酶的影響。單因素試驗(yàn)的基本參數(shù)設(shè)定為：麩皮豆粕比例1∶1、加水量85%(V/W，干基)、接種量0.4%、30 ℃下培養(yǎng)48 h，以曲塊中蛋白酶活力為判斷依據(jù)，選取最優(yōu)單因素條件，每確定一項(xiàng)最優(yōu)條件后，以得出的最優(yōu)條件替換原有參數(shù)進(jìn)行下一個(gè)試驗(yàn)。

2.5 三因素三水平正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力影響較大的3個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，以曲塊中蛋白酶活力為指標(biāo)，研究對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力影響顯著的因素。

3 結(jié)果與分析

3.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，用以菌株產(chǎn)蛋白酶活力的測(cè)量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=2.1143x+0.0164，R2=0.9934。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 各米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力比較

2.3 不同分期的宮頸癌組織中Ki-67、p16及p53表達(dá)情況的比較 16例宮頸癌患者中，Ⅰ期10例，Ⅱ期6例。宮頸癌Ⅰ期與Ⅱ期患者Ki-67、p16及p53表達(dá)陽(yáng)性率的比較，存在明顯差異(P<0.05)。見表3。

圖2 各米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力

由圖2可知，在相同實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)的不同米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力相差較大，其中AspergillusoryzaeNCFEC03菌株產(chǎn)蛋白酶活力最高，可達(dá)(1603.6±8.2) U/g，AspergillusoryzaeNCFEC01菌株所產(chǎn)蛋白酶活力最低，僅為(824.2±6.1) U/g。選取AspergillusoryzaeNCFEC03進(jìn)行制曲條件優(yōu)化。

3.3 麩皮豆粕比對(duì)成品曲米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖3 麩皮豆粕比對(duì)Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

由圖3可知，培養(yǎng)基中麩皮、豆粕用量為1∶1時(shí)，所制曲蛋白酶活力最高，為(1427.8±7.6) U/g。培養(yǎng)基中豆粕含量高可促進(jìn)蛋白酶的分泌，但過高比例豆粕的曲塊的蛋白酶酶活降低，主要原因是曲料結(jié)構(gòu)緊密，阻礙了氧氣進(jìn)入曲塊內(nèi)部和抑制了菌絲生長(zhǎng)。制曲時(shí)添加適量的麩皮，可以使曲塊疏松并提供碳源，能促進(jìn)米曲霉菌絲的粗壯、濃厚生長(zhǎng)[12]，但過高比例的麥麩使菌絲體生長(zhǎng)過旺，蛋白酶產(chǎn)量反而降低。

3.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)成品曲米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

接種后米曲霉菌絲大量繁殖，由圖4可知，制曲12 h時(shí)，產(chǎn)蛋白酶活力仍然較低，24 h后分生孢子開始著生，產(chǎn)酶量顯著增大，到48 h達(dá)高峰期；制曲48 h后，米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力開始下降，這與米曲霉的生長(zhǎng)曲線相似，蛋白酶為初級(jí)代謝產(chǎn)物，與菌體生長(zhǎng)過程同步。

不同發(fā)酵時(shí)間的曲塊感官和產(chǎn)蛋白酶情況見表1。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間的曲塊感官和產(chǎn)蛋白酶情況

3.5 培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

米曲霉菌絲繁殖的最適溫度為30～35 ℃，產(chǎn)酶的最適溫度為(30±2) ℃。由圖5可知，30 ℃為AspergillusoryzaeNCFEC03的最適產(chǎn)蛋白酶溫度，蛋白酶活力最高為(1426.7±4.5) U/g。溫度過低，菌株生長(zhǎng)速度較慢，影響米曲霉菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子數(shù)，使蛋白酶產(chǎn)量降低；而溫度過高，米曲霉產(chǎn)孢子數(shù)減少，導(dǎo)致酶活力下降[13]。

3.6 不同加水量對(duì)成品曲米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖6 加水量對(duì)Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

由圖6可知，水分含量過高或過低對(duì)AspergillusoryzaeNCFEC03蛋白酶活力都有影響。在加入低水分(干料量70%)時(shí)，種曲培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解量下降，影響菌絲的生長(zhǎng)，產(chǎn)蛋白酶活力較低，僅為(980.8±4.7) U/g。水分適當(dāng)(80%)時(shí)，米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)蛋白酶活力最高可達(dá)(1569.5±3.7) U/g。之后，隨著加水量增加，蛋白酶活力逐漸降低。原因可能是高水分使種曲培養(yǎng)基多孔性降低、黏度增加、透氣性下降，使好氧的米曲霉生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)蛋白酶量也隨之下降[14]。

3.7 不同種曲接種量對(duì)成品曲米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖7 種曲接種量對(duì)Aspergillus oryzae NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響

由圖7可知，AspergillusoryzaeNCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力隨種曲接種量增加而增大，菌絲的生長(zhǎng)也越旺盛，接種量為0.6%時(shí)達(dá)到峰值，為(1628.3±3.6) U/g，但接種量過大，會(huì)引起供氧不足，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，影響米曲霉孢子成熟，導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，AspergillusoryzaeNCFEC03產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)條件為：麩皮豆粕比1∶1，加入80%(V/W，干料量)的水，接種量0.6%，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h。

3.8 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，固定發(fā)酵時(shí)間48 h、培養(yǎng)溫度30 ℃，選取對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力影響較大的3個(gè)因素(加水量、接種量、麩皮豆粕比)，研究它們對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力影響的顯著性。 正交試驗(yàn)因素水平表見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析表見表4。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

注：“*”表示影響顯著。

經(jīng)極差和方差分析，固態(tài)釀造醬油制曲過程中，對(duì)AspergillusoryzaeNCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力的影響順序?yàn)椋蝴熎ざ蛊杀?加水量>接種量。其中加水量和接種量在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)沒有顯著性影響，麩皮豆粕比具有顯著性影響。培養(yǎng)基中豆粕主要提供氮源——蛋白質(zhì)，可促進(jìn)米曲霉快速生長(zhǎng)、產(chǎn)蛋白酶，但過高豆粕比例的曲，結(jié)構(gòu)緊密，不利于氧氣的進(jìn)入，會(huì)抑制米曲霉生長(zhǎng)產(chǎn)酶。麥麩提供碳源——碳水化合物和疏松作用的纖維。適量比例的麩皮，可使曲塊疏松并提供碳源，促進(jìn)米曲霉菌絲生長(zhǎng)、分泌蛋白酶，但麥麩比例過高，培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量降低，使菌體產(chǎn)蛋白酶能力下降。根據(jù)單因素和正交優(yōu)化結(jié)果，麩皮豆粕比例1∶1為最佳。

4 結(jié)論

通過L9(33)正交優(yōu)化的固態(tài)制曲最優(yōu)條件為：麩皮豆粕比1∶1、加水量80%(V/W)、接種量0.8%、30 ℃培養(yǎng)48 h、米曲霉Aspergillusoryzae

NCFEC03產(chǎn)蛋白酶活力(1687.6±4.9)U/g干曲，是一株產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)的菌株，下一步以其為醬油發(fā)酵菌種進(jìn)行釀造工藝研究，可為其工業(yè)化菌株提供研究基礎(chǔ)。

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Effect of Solid-state Fermentation Parameters on Protease Activity ofAspergillusoryzaeNCFEC03 in Soy Sauce Koji

LIANG Jin-wei1,2, LI Bin1,2, YU Dong-yang1,2, WAN Yin1,2, LIU Cheng-mei1,2,3, FU Gui-ming1,2,3*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2.School of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 3.Sino-German Food Engineering Center, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

AspergillusoryzaeNCFEC03 with the strongest protease activity is selected from fiveAspergillusoryzaestrains. Single factor experiment is used to research the effect of solid-state soy sauce koji fermentation parameters such as ratio of bran and soybean meal,additive amount of water, inoculum dose, culture time and culture temperature on protease production ofAspergillusoryzaeNCFEC03, and then the three main factors such as the ratio of bran and soybean meal, the additive amount of water and the inoculum dose are selected for orthogonal experiment. With range and variance analysis, it is found that the sequence of influence factors for protease activity in soy sauce koji is: the ratio of bran and soybean meal>the additive amount of water>the inoculum dose, and the ratio of bran and soybean meal is the most significant factor affecting protease activity. The optimum koji-making conditions are as follows: the ratio of bran and soybean meal is 1∶1, the additive amount of water is 80% (dry koji), the inoculum dose is 0.8%, being fermented at 30 ℃ for 48 h, and the protease activity is (1687.6±4.9) U/g dry koji.

soy sauce;solid-state fermentation parameters;AspergillusoryzaeNCFEC03;protease activity

2016-12-14 *通訊作者

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(31169336)

付桂明(1972-)，男，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)、發(fā)酵工程。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.006

1000-9973(2017)06-0029-05