超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質譜聯用法快速測定食品中苯并[a]芘

張曉藝, 張秀堯, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預防控制中心, 浙江 溫州 325001)

研究論文

超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質譜聯用法快速測定食品中苯并[a]芘

張曉藝, 張秀堯*, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預防控制中心, 浙江 溫州 325001)

建立了快速檢測食品中苯并[a]芘的超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用(UPLC-MS/MS)分析方法。樣品用正己烷提取后,經分子印跡固相萃取柱凈化,以甲醇和水作為流動相進行梯度洗脫,在XBridge BEH C18柱上實現分離,大氣壓化學電離(APCI)-三重四極桿質譜正離子MRM方式檢測,以苯并[a]芘-d12作為內標的穩(wěn)定同位素稀釋法定量。方法的線性范圍為0.07～50 μg/kg,定量限為0.07 μg/kg。平均加標回收率為86%～104%,相對標準偏差為2.3%～14%。該方法靈敏、準確,適用于食品中苯并[a]芘的測定,已應用于實際樣品的檢查。

超高效液相色譜-串聯質譜;大氣壓化學電離;分子印跡固相萃取;苯并[a]芘;食品

苯并[a]芘(benzo[a]pyrene, BaP)又稱3,4-苯并芘,是一種5環(huán)的稠環(huán)芳烴,具有致癌、致畸、致突變性毒性。苯并[a]芘主要存在于生活與工業(yè)生產過程中的燃燒能源,比如煤、石油以及天然氣等不完全燃燒過程中所生成的廢氣中,這些廢氣通過水、大氣和土壤進入到糧食、蔬菜、水果、水產品以及肉制品等食品中;同時食品在煎炸和熏烤等加工過程中也會發(fā)生熱裂解形成大量稠環(huán)芳烴,其中苯并[a]芘的含量比較高,特別是在烘烤和煙熏過程中發(fā)生的糊焦現象時,苯并[a]芘的生成量將會比普通食品高20倍以上[1-4]。我國國標GB 2762-2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》規(guī)定谷物及其制品(稻谷、糙米、大米、小麥、小麥粉、玉米、玉米面(渣、片))、肉及肉制品(熏、燒、烤肉類)和水產動物及其制品(熏、烤水產品)中苯并[a]芘的不得超過5.0 μg/kg,油脂及其制品不得超過10 μg/kg。歐盟推薦食用油中苯并[a]芘的限量值為2 μg/kg (Regulation 208/2005, EC)。

目前,食品中苯并[a]芘的分析方法主要有高效液相色譜-熒光檢測法[5,6]、氣相色譜-質譜聯用法[7,8]和液相色譜-串聯質譜聯用法等[9,10]。高效液相色譜-熒光檢測法靈敏、重現性好,是較常用的方法[5,6],但與液相色譜-質譜聯用法相比定性能力不強、靈敏度不高;氣相色譜-質譜聯用法靈敏度不高,需對樣品進行多倍濃縮,樣品前處理常會耗費較多的有機溶劑,檢測周期長[8]。劉玉蘭等[9]采用液相色譜-光化學電離-質譜聯用法測定食用油脂中的苯并[a]芘,樣品稀釋后直接進樣,方法檢出限為1 μg/kg。雖然簡化了樣品前處理過程,但容易造成基線漂移,對色譜柱損害較大,整個系統易污染,且光化學電離源非儀器標配部件,通用性差,同時還需1臺溶劑輸送泵在柱后加入摻雜劑(dopant)甲苯,裝置復雜。王浩等[10]采用液相色譜-光化學電離-質譜聯用法測定植物油中的苯并[a]芘和4種黃曲霉毒素,樣品經凝膠滲透色譜凈化,在去除大分子雜質方面效果較好,但有機溶劑消耗量大、耗時,還存在一定的基質抑制效應,需用基質標準外標法定量。藍長波[11]采用液相色譜-電噴霧電離-質譜聯用法,但苯并[a]芘在電噴霧源中難以離子化,靈敏度極低。

分子印跡固相萃取技術是以分子印跡材料作為固相萃取填料制成分子印跡固相小柱,可選擇性吸附液體樣品中的目標化合物,使其與樣品的基體等干擾成分分離,最終達到凈化和富集的目的;分子印跡固相萃取技術具有良好的特異性,可以提高分析的準確度、精密度和靈敏度,已成為近年來樣品前處理領域的一個研究熱點[12]。本研究采用分子印跡固相萃取法進行樣品前處理,消除了基質效應,方法選擇性好,使用儀器標配的大氣壓化學電離源,通過對色譜和質譜條件的優(yōu)化,實現了超高效液相色譜-串聯質譜法的高靈敏檢測,以穩(wěn)定同位素稀釋法定量,建立了食品中苯并[a]芘的檢測方法,檢出限優(yōu)于新國標GB 5009.27-2016《食品安全國家標準 食品中苯并[a]芘的測定》10倍,方法簡便、快速、靈敏、準確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀由ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統和ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統組成,由Empower 3工作站控制(美國Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/復合線性離子阱串聯質譜儀(美國AB SCIEX公司),由Analyst 1.6.2軟件控制;2510超聲波清洗機(美國Branson公司); Multi Reax數顯型多管旋渦混合器(德國Heidolph公司); 3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司); N-EVAP氮吹儀(24孔,美國Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國Millipore公司)。

甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈為HPLC級(德國Merck公司);分子印跡柱固相萃取柱(500 mg/6 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司);苯并[a]芘標準物質(20 μg/mL,農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)、苯并[a]芘-d12標準物質(200 μg/mL,北京曼哈格生物科技有限公司),臨用時稀釋至所需濃度,避光保存。

1份花生油、2份玉米油、1份大豆油、1份茶油、2份烤雞翅、1份烤雞腿、1份烤豬肉、2份烤蝦、1份烤魷魚絲和3份大米均購自當地商場。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜分離條件

分析柱為XBridge BEH C18(75 mm×3.0 mm, 2.5 μm),配套保護柱VanGuard BEH C18(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相A為甲醇,B為水。梯度洗脫程序:0～3.00 min, 68%A～98%A; 3.00～4.50 min, 98%A; 4.50～4.60 min, 98%A～68%A; 4.60～6.00 min, 68%A。流速:1.000 mL/min;柱溫：55 ℃;進樣體積：5 μL;乙腈作為清洗溶劑(wash solvent), 50%(v/v)甲醇作為消除溶劑(purge solvent)。

1.2.2 質譜條件

大氣壓化學電離離子源,正離子掃描方式多離子反應監(jiān)測(MRM)。離子化電壓(IS): 5 500 V,離子源溫度(TEM): 600 ℃,放電電流(NC): 3 μA,氣簾氣(CUR): 277 kPa,噴霧氣(GS1): 345 kPa,碰撞氣(CAD): medium。苯并[a]芘定量離子對為m/z253.2>224.1,定性離子對為m/z253.2>226.1,去簇電壓(DP)均為120 V,碰撞能量(CE)分別為95和69 eV;苯并[a]芘-d12離子對為m/z263.2>232.1, DP為120 V, CE為95 eV;峰駐留時間均為80 ms。

1.3 樣品前處理

樣品前處理在避光條件下進行。

1.3.1 提取

油脂及其制品:準確稱取0.500 g試樣,加入25 μL 100 μg/L苯并[a]芘-d12內標溶液,混勻,再加入5 mL正己烷,旋渦混合溶解,待凈化。

其他食品:取可食部分,均質。準確稱取1.00 g,加入50 μL 100 μg/L苯并[a]芘-d12內標溶液,混勻,再加入5.0 mL正己烷,旋渦混合0.5 min, 40 ℃下超聲提取10 min, 10 000 r/min下離心5 min,移取上清液。殘渣中再加入5.0 mL正己烷重復提取一次。合并提取液,待凈化。

1.3.2 凈化

分子印跡柱固相萃取柱依次用5.0 mL二氯甲烷和5.0 mL正己烷活化,上樣,分別各用5.0 mL正己烷淋洗柱子2次,抽干,用5.0 mL二氯甲烷洗脫,洗脫液在40 ℃下氮氣吹干,油脂及其制品的殘渣中加入0.25 mL乙腈,其他類型食品的殘渣中加入0.50 mL乙腈,渦旋復溶0.5 min,過0.22 μm濾膜,待測。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

苯并[a]芘屬非極性化合物,易溶于苯、正己烷等非極性有機溶劑。目前,國內外廣泛采用正己烷作為苯并[a]芘的提取溶劑,我們也選擇正己烷作為提取劑。

食品中苯并[a]芘的樣品預處理方法主要有固相萃取法[13-16]、QuEChERS法[6]、基質分散固相萃取法[17]和凝膠色譜法[8-10,18]等。固相萃取法主要采用弗羅里硅土柱、氧化鋁柱等。國內已有商品化的苯并[a]芘專用固相萃取柱,這些專用柱分為兩類。一類是按照GB/T 22509-2008 《動植物油脂 苯并[a]芘的測定 反相高效液相色譜法》中規(guī)定的,將適當活度的22 g氧化鋁制成固相萃取柱(22 g/60 mL);另一類是苯并[a]芘分子印跡固相萃取柱(500 mg/6 mL)。這兩類柱都能起到較好的凈化效果,但第一類固相萃取柱消耗的溶劑較多,第二類固相萃取柱特異性更強,溶劑消耗少。戴廷燦等[6]采用QuEChERS法提取,自制乙二胺-N-丙基硅膠(PSA)+中性氧化鋁小柱凈化,測定蔬菜中的苯并[a]芘,在操作便利和凈化效果上并無明顯優(yōu)勢。基質分散固相萃取法需要手工裝柱,煩瑣、耗時,使用C18填料作為吸附分散劑,特異性不強,凈化效果不明顯[17]。離線的凝膠色譜法可以去除大分子雜質,但耗溶劑、耗時;在線的凝膠色譜法多與氣相色譜-質譜聯用儀聯用,需專門的儀器設備。所以我們最終選擇苯并[a]芘分子印跡固相萃取法作為樣品凈化方法,10 mL 0.1 μg/L苯并[a]芘的正己烷標準溶液上樣,用10 mL正己烷分2次淋洗,再用5.0 mL二氯甲烷洗脫,苯并[a]芘的絕對回收率≥95%。選擇玉米油、大米、烤雞腿分別作為油脂及其制品、谷物及其制品、肉及肉制品及水產動物及其制品的代表樣品,經本法處理后,以苯并[a]芘-d12配制基質標準與溶劑標準比較進行基質效應(matrix effect, ME)評估。結果表明以上3種樣品的ME均在90%～100%范圍內,基質效應不明顯[19]。為了克服樣品前處理和儀器檢測過程中可能存在的誤差,本法采用苯并[a]芘-d12穩(wěn)定同位素作為內標進行定量。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

由于苯并[a]芘極性小,在電噴霧離子(ESI)源中不能電離,可在大氣壓化學電離源中以正離子的方式電離。利用注射泵以7 μL/min的流速分別將2.0 μg/mL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12標準溶液通過三通匯合流動相(90%(v/v)甲醇水溶液,流速為0.700 mL/min)注入離子源中,在大氣壓化學電離正離子檢測方式下對質譜測定條件進行優(yōu)化。Q1掃描時可見[M+H]+峰,對準分子離子峰進行子離子掃描,得到碎片離子信息,然后再對離子源溫度、電暈針放電電流、去簇電壓、碰撞能量等參數進行優(yōu)化,使得分子離子對信號達到最佳。遵循國際慣例,確證分析需要4個識別點,故選擇兩對分子離子對,同時設定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數為15～20點,從而得到較好的定量重復性。優(yōu)化后的測定條件見1.2.2節(jié)。

圖 1 3種色譜柱對苯并[a]芘分離的比較Fig. 1 Comparison of three chromatographic columns on the separation of benzo[a]pyrene (BaP) a. Acquity UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); b. Acquity UPLC BEH C8 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); c. Acquity UPLC BEH Shield RP (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm).

2.3 超高效液相色譜條件的優(yōu)化

由于采用大氣壓化學電離法,流動相的流速要≥0.6 mL/min,考慮到柱壓的限制,選擇50 mm長的超高效液相色譜柱。試驗了50 mm×2.1 mm規(guī)格的BEH C18(1.7 μm)、Shield RP(1.7 μm)和BEH C8(1.7 μm)超高效液相色譜柱,結果見圖1。苯并[a]芘在BEH C18柱上的色譜峰形和響應值最佳,而在其他色譜柱上嚴重拖尾,響應值低。實際樣品處理液以乙腈為溶劑,進樣5 μL, 50 mm×2.1 mm的BEH C18色譜柱會有溶劑效應,導致色譜峰展寬,使苯并[a]芘不能與雜質干擾峰達到基線分離。最終選用75 mm×3.0 mm的BEH C18(2.5 μm)作為分析色譜柱,由于其柱容量較大,不會出現進樣溶劑效應。

比較甲醇-水、乙腈-水作為流動相的效果,并加入低濃度的甲酸和乙酸銨緩沖鹽等進行優(yōu)化。結果顯示苯并[a]芘在甲醇-水系統中的離子化效果最好,同時又對流動相梯度洗脫程序和柱溫等條件進行優(yōu)化,最終苯并[a]芘的色譜保留時間適當,最高柱壓約為55.2 MPa (8 000 psi),適合在超高效液相色譜儀上運行,色譜峰形好,能與雜質峰達到基線分離(見圖2)。優(yōu)化的色譜條件見1.2.1節(jié)。

圖 2 玉米油樣品中苯并[a]芘的UPLC-MS/MS MRM色譜圖(0.98 μg/kg)Fig. 2 UPLC-MS/MS MRM chromatograms of benzo[a]pyrene in a corn oil sample (0.98 μg/kg)

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將苯并[a]芘標準品溶液分別用乙腈稀釋成0.1、0.5、1.0、5.0、20、100 μg/L(各含有5.0 μg/L苯并[a]芘-d12)的系列標準溶液進行測定,采用MultiQuant定量軟件進行數據處理,以定量離子對與內標物的峰面積比值(y)對系列標準溶液質量濃度(x, μg/L)進行回歸(權重取1/x),苯并[a]芘在0.1～100 μg/L范圍內的回歸方程為y=0.203 2x+0.000 613,相關系數優(yōu)于0.999,呈線性關系。

在空白樣本中加入低濃度的苯并[a]芘,按本法測定;倘若無法找到空白樣品,可加入低濃度的同位素內標苯并[a]芘-d12。以兩對分子離子對的信噪比均≥3時對應的樣品濃度作為檢出限(LOD),以信噪比≥10時的樣品濃度作為定量限(LOQ),測得檢出限為0.02 μg/kg,定量限為0.07 μg/kg,測定上限為50 μg/kg。本法測定范圍涵蓋了大部分樣品中的苯并[a]芘濃度水平,超過測定上限的樣品應稀釋后再行測定。

2.5 樣品的加標回收和精密度試驗

分別取玉米油、烤雞腿和大米樣品進行加標回收和精密度試驗。樣品中添加不同水平的標準溶液,混勻,放置過夜,使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡,再按樣品前處理方法進行操作,其回收率和精密度結果見表1。加標回收率在86%～104%之間,相對標準偏差在2.3%～14%之間,符合痕量分析的要求。

2.6 實際樣品的分析

檢測了5份植物油、4份烤肉類、2份烤蝦、1份烤魷魚絲和3份大米共15份市售樣品,均檢出了苯并[a]芘。5份植物油中苯并[a]芘的含量在0.27～1.65 μg/kg之間,3份大米為0.031～0.10 μg/kg,其余均在0.082～0.97 μg/kg范圍內,均符合國標限量要求。

表 1 食品中苯并[a]芘在不同添加水平下的回收率(n=6)

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3 結論

本文建立了檢測食品中苯并[a]芘的超高液相色譜-三重四極桿質譜聯用方法。通過對分子印跡固相萃取法的樣品凈化效果和基質效應的評估,證明了樣品凈化方法的有效性。通過對色譜分離和質譜檢測等條件的優(yōu)化,得到了較高的檢測靈敏度。方法學驗證結果表明本方法靈敏度高、選擇性好、定量準確和精密度好;應用于實際樣品的檢測取得滿意結果,適用于食品中苯并[a]芘的檢測。

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Rapid determination of benzo[a]pyrene in foods by ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization

ZHANG Xiaoyi, ZHANG Xiuyao*, CAI Xinxin, LI Ruifen

(WenzhouMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325001,China)

A method for the determination of benzo[a]pyrene in foods was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) based on isotope dilution and molecularly imprinted solid-phase extraction (MIP-SPE). The target analyte in samples was extracted withn-hexane after spiked with benzo[a]pyrene-d12, and purified using MIP-SPE to eliminate most of the coextracts. The separation of benzo[a]pyrene was carried out on an XBridge BEH C18column with gradient elution of methanol and water. An atmospheric pressure chemical ionization (APCI) interface was used as the ion source and the analysis was performed in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Benzo[a]pyrene levels in the range of 0.07-50 μg/kg were measured accurately by this method, and the limit of quantification (LOQ) was 0.07 μg/kg. The average recoveries were between 86% and 104% with the relative standard deviations within 2.3%-14%. The method was sensitive and accurate, and it has been successfully applied to the measurement of benzo[a]pyrene in food samples.

ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); atmospheric pressure chemical ionization (APCI); molecularly imprinted solid-phase extraction (MIP-SPE); benzo[a]pyrene; food

10.3724/SP.J.1123.2017.02021

2017-02-20

O658

A

1000-8713(2017)06-0608-05

* 通訊聯系人.Tel:(0577)56966951,E-mail:xyzwz123@126.com.