基于納米金Core—satellites等離子體耦合增強(qiáng)效應(yīng)的汞離子光纖傳感器的研究

賈朔+邊超+佟建華+孫楫舟+夏善紅

摘 要 以DNA雜交雙鏈為聯(lián)接， 構(gòu)建納米金顆粒Coresatellites結(jié)構(gòu)并激發(fā)等離子體耦合增強(qiáng)效應(yīng)，利用Hg2+可與DNA中胸腺嘧啶T形成THg2+T特異性結(jié)構(gòu)，研制了用于檢測(cè)水中Hg2+的局域等離子體共振（LSPR）光纖傳感器。待測(cè)溶液中的Hg2+能夠引起富含T的DNA單鏈折疊，抑制DNA雜交反應(yīng)，降低等離子體耦合強(qiáng)度，改變LSPR諧振波長(zhǎng)。通過(guò)檢測(cè)諧振波長(zhǎng)紅移變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+濃度的定量檢測(cè)。本方法檢測(cè)Hg2+的線性范圍為5～150 nmol/L， 檢出限為3.4 nmol/L （3σ）。 Zn2+、Mg2+、Pb2+等重金屬離子對(duì)Hg2+檢測(cè)無(wú)明顯干擾作用。實(shí)際水樣中Hg2+加樣回收率為94.2%～105.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<4.8%。

關(guān)鍵詞 局域等離子體共振； 納米金Coresatellites結(jié)構(gòu)； 脫氧核糖核酸； 汞離子； 光纖傳感器

1 引 言

汞離子（Hg2+）具有高毒性和污染性，在水質(zhì)檢測(cè)中備受關(guān)注[1，2]。Hg2+常規(guī)檢測(cè)方法主要包括冷原子熒光法、電感耦合等離子質(zhì)譜法、冷原子吸收光譜法等[3～6]，這些方法雖然比較準(zhǔn)確，但是存在設(shè)備昂貴、制樣過(guò)程復(fù)雜、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。近年來(lái)，陸續(xù)報(bào)道了利用金屬納米顆粒作為傳感元件，基于比色法、熒光法和表面增強(qiáng)拉曼光譜法用于Hg2+檢測(cè)的研究報(bào)道[7～10]。其中，比色法檢測(cè)靈敏度較低，熒光法需要標(biāo)記，容易受到環(huán)境因素的干擾[11，12]， 表面增強(qiáng)拉曼光譜法對(duì)儀器設(shè)備要求高。因此，研發(fā)體積小、無(wú)標(biāo)記、易于制備、靈敏度高的傳感器具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

納米貴金屬顆粒受光激發(fā)能夠產(chǎn)生局域等離子體共振效應(yīng)（LSPR），基于LSPR的生化傳感器無(wú)需標(biāo)記、檢測(cè)速度快、傳感區(qū)域小[13]，已被用于Hg2+檢測(cè)，但目前仍存在檢測(cè)靈敏度較低的缺點(diǎn)[14～16]。研究表明，受光激發(fā)的兩個(gè)貴金屬顆粒接近時(shí)，其表面電磁場(chǎng)耦合產(chǎn)生等離子體增強(qiáng)效應(yīng)[17，18]，并隨距離存在紅移和衰減特性[19]，該研究需要暗場(chǎng)顯微鏡和高精度光學(xué)系統(tǒng)，僅適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。Mucic等[20]提出了由一個(gè)核心納米顆粒 （Auc）和多個(gè)外圍納米顆粒 （Aus）構(gòu)成的Coresatellites 納米結(jié)構(gòu)，多個(gè)Aus使得耦合強(qiáng)度大幅提高，并適用于采用光譜儀檢測(cè)，提高了實(shí)際應(yīng)用能力。隨后，其他研究者對(duì)該結(jié)構(gòu)的材料組成、粒徑尺寸等進(jìn)行仿真優(yōu)化[21～23]，并初步實(shí)現(xiàn)DNA、抗原抗體等的增敏檢測(cè)[24，25]。

本研究以石英光纖纖芯為傳感基底，以富含胸腺嘧啶（T）的互補(bǔ)DNA雙鏈為聯(lián)接，構(gòu)建納米金顆粒Coresatllites結(jié)構(gòu)，并實(shí)現(xiàn)等離子體耦合增強(qiáng)效應(yīng)。利用Hg2+能夠形成THg2+T結(jié)構(gòu)使DNA單鏈折疊[26，27]，減弱互補(bǔ)DNA雜交強(qiáng)度，降低等離子體耦合增強(qiáng)效應(yīng)的特性，研制出一種體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記、特異性、靈敏的檢測(cè)Hg2+的光纖傳感器。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

S4800掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）； QE65PRO型光纖光譜儀和DTMINI2GS寬帶光源（美國(guó)Ocean Optics公司）； 傳感光纖（直徑600 μm，數(shù)值孔徑為0.37，美國(guó)Thorlabs公司）； HC3018高速離心機(jī)（中科中佳公司）。磷酸鹽緩沖液（PBS）、牛血清蛋白 （BSA）、聚烯丙基胺鹽酸鹽（PAH）、巰基己醇（MCH），三（2羧乙基）膦（TCEP），購(gòu)于SigmaAldrich公司。不同粒徑納米金溶液（Gold nanoparticles colloids，美國(guó)Ted Pella公司）。重金屬離子標(biāo)樣購(gòu)于環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所； 其它試劑購(gòu)自北京試劑廠。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。DNA序列由上海生物工程有限公司合成，如表1所示。

2.2 光纖傳感器的制備

光纖經(jīng)去除包層、端面拋光和清洗烘干后，浸入Piranha洗液（濃 H2SO4H2O2（30%），7∶3， V/V）中，65℃水浴1 h，使纖芯表面羥基化[28]； 浸入2 mg/mL

陽(yáng)離子聚電解質(zhì)PAH（1 mol/L NaCl）溶液中30 min，PAH通過(guò)靜電作用吸附在纖芯表面； 浸入表面帶負(fù)電的Auc溶液中1 h，Auc通過(guò)靜電吸附形成自組裝單層； 利用銀鏡反應(yīng)在光纖端面形成銀反光鏡[29]； 將光纖浸入DNAp溶液中12 h，使巰基化DNAp通過(guò)AuS鍵固定在Auc表面； 浸入1 mmol/L MCH溶液中自組裝2 h； 將光纖浸入BSA（2 mg/mL，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）溶液中，封閉PAH表面吸附位點(diǎn)，減少非特異性吸附。

2.3 DNAT在液相Aus表面的修飾

取粒徑20 nm 的Aus溶液，與DNAT以摩爾比1∶200混合，振蕩24 h。加入TAE和NaCl老化，繼續(xù)振蕩24 h， 9000 r/min離心15 min，將沉淀物分散到40 mmol/L TrisHCl （pH 6.8， 0.1 mol/L NaCl）溶液中，獲得DNAT修飾Aus（DNATAus）溶液。

2.4 Hg2+檢測(cè)

將Hg2+標(biāo)樣稀釋為0～1000 nmol/L待測(cè)溶液。按2.2節(jié)制備的光纖傳感器，浸入Hg2+的TrisHCl溶液中30 min，用TrisHCl 緩沖液和去離子水清洗，吹干，室溫下置于DNATAus溶液中1 h，并檢測(cè)LSPR光譜諧振波長(zhǎng)移動(dòng)量（Δλp），通過(guò)加權(quán)質(zhì)心算法（Weighted centroid algorithm）計(jì)算λp位置[30]。

3 結(jié)果和討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

如圖1所示，光纖光在纖芯中以全反射方式傳輸，并在纖芯和周圍媒介的固液界面產(chǎn)生倏逝波，倏逝波透過(guò)纖芯表面進(jìn)入周圍媒介激發(fā)Auc單層產(chǎn)生LSPR效應(yīng)并返回纖芯，經(jīng)光纖端面銀反光鏡反射，進(jìn)入光纖光譜儀獲得LSPR光譜。Auc表面DNAp與液相Aus表面DNAT發(fā)生雜交反應(yīng)，使Aus結(jié)合在Auc表面，形成Coresatellites結(jié)構(gòu)并激發(fā)等離子體耦合效應(yīng)，導(dǎo)致λp紅移。由于Hg2+能與T形成THg2+T結(jié)構(gòu)，Hg2+存在時(shí)，DNAp通過(guò)THg2+T形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，降低雜交反應(yīng)強(qiáng)度，造成Aus結(jié)合量減少，降低Δλp。通過(guò)計(jì)算Δλp，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+濃度的定量檢測(cè)。

3.2 Auc粒徑優(yōu)化

取粒徑40、60 和80 nm的金顆粒作為Auc，按2.2節(jié)制備由不同Auc修飾的光纖傳感器，并在表面固定DNAp，浸入DNATAus溶液檢測(cè)Δλp變化情況。如圖2A所示，80 nm Auc修飾光纖傳感器產(chǎn)生的Δλp最大，故選擇80 nm作為Auc。圖2B和2C分別是80 nm 單層Auc和結(jié)合Aus形成Coresatellites結(jié)構(gòu)后的SEM圖。

3.3 Auc表面DNAp的密度優(yōu)化

Auc表面DNAp的密度是影響檢測(cè)靈敏度的重要因素。采用不同濃度DNAp溶液對(duì)光纖表面Auc進(jìn)行修飾，測(cè)試了光纖在DNATAus溶液中Δλp及對(duì)Hg2+的響應(yīng)。如圖3A所示，曲線a為不同光纖的初始λp位置； 曲線b顯示不同濃度DNAp溶液修飾的光纖在DNATAus溶液中的λp隨DNAp濃度的增加而增大； 當(dāng)修飾DNAp濃度大于 150 nmol/L時(shí)，λp波長(zhǎng)位置趨于穩(wěn)定，表明此時(shí)Auc表面結(jié)合Aus已經(jīng)趨于飽和。不同濃度DNAp溶液修飾的光纖用于檢測(cè)50 nmol/L Hg2+，由曲線c可見(jiàn)，隨DNAp濃度增加，λp逐漸增大； 圖3B表明，Δλp先增大后減少； 在DNAp為200 nmol/L時(shí)Δλp達(dá)最大值，之后隨DNAp濃度的增加而減小。這可能是當(dāng)DNAp密度增加到一定量時(shí)，DNAp對(duì)Hg2+的結(jié)合能力達(dá)到最大； 繼續(xù)增大DNAp濃度，受空間位阻的影響，DNAp對(duì)Hg2+結(jié)合量下降，降低了Δλp。 因此本研究采用200 nmol/L DNAp進(jìn)行Auc表面修飾。

3.4 傳感器對(duì)Hg2+的檢測(cè)性能

采用本傳感器檢測(cè)不同濃度Hg2+的標(biāo)準(zhǔn)溶液。如圖4所示，LSPR光譜的Δλp隨著Hg2+濃度增高而降低，當(dāng)Hg2+濃度高于150 nmol/L時(shí)，Δλp趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)THg2+T作用形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針DNA開(kāi)始逐漸趨于飽和。采用本方法檢測(cè)Hg2+線性范圍為5～150 nmol/L，線性方程為y=0.372x+94.143， 檢出限為3.4 nmol/L （3σ）。

每次測(cè)量后，將本光纖傳感器浸入95℃去離子水中10 min，使DNAp和DNAT解鏈，實(shí)現(xiàn)傳感器的再生。以再生6次后的傳感器檢測(cè)100 nmol/L Hg2+，響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.9%，表明本傳感器具有良好的可重復(fù)使用性，至少可重復(fù)使用6次。取6支光纖傳感器檢測(cè)50 nmol/L Hg2+。每支傳感器重復(fù)測(cè)量3次的RSD為1.5%～3.1%； 6支傳感器測(cè)量平均值的RSD為4.9%，表明此傳感器具有良好的制備重現(xiàn)性。

本檢測(cè)方法與文獻(xiàn)報(bào)道的Hg2+檢測(cè)方法，如比色法、熒光法、拉曼光譜法、電化學(xué)、石英晶振微天平等方法[31～35]相比，具有無(wú)需標(biāo)記、體積小、易于集成的優(yōu)點(diǎn)。

3.5 實(shí)際水樣分析

取清華大學(xué)校內(nèi)荷塘水樣，靜置過(guò)濾后去除懸浮物，利用譜尼公司原子熒光法進(jìn)行水中Hg2+含量檢測(cè)，結(jié)果表明，水樣中未檢測(cè)出Hg2+。利用標(biāo)準(zhǔn)加入法在實(shí)際水樣中分別加入不同濃度Hg2+，測(cè)定加標(biāo)回收率。結(jié)果如表2所示，回收率為94.2%～105.4%，RSD<4.8%，表明本方法適用于環(huán)境水樣中Hg2+檢測(cè)。

4 結(jié) 論

基于石英光纖基底，以互補(bǔ)DNA雜交做聯(lián)接，構(gòu)建納米金Coresatellites結(jié)構(gòu)，利用Hg2+對(duì)雜交反應(yīng)的抑制作用構(gòu)建了一種新型Hg2+檢測(cè)的光纖傳感器，Hg2+檢測(cè)線性范圍5～150 nmol/L，檢出限3.4 nmol/L。此傳感器微型便攜， 具有良好的應(yīng)用潛力。

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Abstract Based on the plasmon coupling effect in gold nanoparticles coresatellite nanostructures linked by thymine（T）rich DNA hybridization and the specific Hg2+mediated THg2+T base pair， a novel localized surface plasmon resonance （LSPR） optical fiber sensor was proposed and developed for Hg2+ detection in water. The Hg2+induced conformational change in Trich DNA sequence inhibited the DNA hybridization reaction， weakened the plasmon coupling effect and leaded to the change of LSPR resonance wavelength. The concentration of Hg2+ was quantitatively determined by the resonance wavelength redshift. The linear range of Hg2+ detection was about 5-150 nmol/L with LOD about 3.4 nmol/L. The specificity of the sensor was proved great by evaluating the response to other heavy metal ions such as Zn2+， Mg2+， Pb2+ and so on. This sensor was applied in environmental water detection by standard addition method，with the RSD less than 4.8% and recoveries of 94.2%-105.4%.

Keywords Localized surface plasmon resonance； Gold nanoparticles coresatellites structure； Deoxyribonucleic acid； Mercury ion ； Optical fiber sensor

（Received 25 October 2016； accepted 12 February 2017）

This work was supported by the Major State Basic Research Development Program （No.2015CB352100） and the National Natural Science Foundation of China （No.61501100）.