利用亞臨界丁烷分離茶樹鮮葉中的阿維菌素

張婭婷+秦廣雍+孔令軍+張書勝

摘 要 以茶樹鮮葉為原料，利用亞臨界丁烷流體分離鮮葉表面殘留的阿維菌素。在料溶比為1∶10（m/V）的條件下，利用響應(yīng)面法（RSM）的BoxBenhnken Design（BBD）設(shè)計實驗，考察不同溫度、時間、分離次數(shù)等條件對多酚氧化酶活性的影響，同時分析亞臨界丁烷處理對茶樹鮮葉生理特性的影響。結(jié)果表明，亞臨界丁烷流體在保持茶葉物理結(jié)構(gòu)和多酚氧化酶活性基本不變的情況下，可有效分離茶葉中的阿維菌素；通過Design Expert軟件分析，得出分離阿維菌素的最優(yōu)工藝參數(shù)為溫度45℃，時間30 min，分離次數(shù)1次，料液比為1∶10（m/V），分離效率大于91%，多酚氧化酶相對活性為25.73%。通過掃描電鏡觀察，茶樹鮮葉結(jié)構(gòu)在丁烷處理前后無明顯變化。本研究結(jié)果表明，亞臨界丁烷流體可有效分離茶葉中的農(nóng)藥殘留，為亞臨界流體在去除天然植物農(nóng)殘的應(yīng)用中提供了實驗依據(jù)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 亞臨界丁烷； 阿維菌素； 分離； 茶葉； 多酚氧化酶

1 引 言

茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、氨基酸等多種營養(yǎng)成分和藥效成分，具有降脂降壓、抗衰老等保健功效。近年來，我國茶葉產(chǎn)量一直居世界首位，帶動了全球茶葉產(chǎn)量持續(xù)增長[1]。然而由于不科學(xué)使用以及濫用農(nóng)藥，茶葉中農(nóng)藥殘留問題依然比較普遍，發(fā)達國家對茶葉農(nóng)殘設(shè)置了限量標(biāo)準(zhǔn)，引起了茶葉生產(chǎn)國的高度關(guān)注[2，3]。

茶葉中農(nóng)殘的檢測技術(shù)有很多文獻報道[4，5]，但農(nóng)殘分離的研究相對較少。目前，主要采用超臨界流體萃?。⊿FE）技術(shù)[6]、加速溶劑萃取（ASE）技術(shù)[7，8]等分離茶葉樣品中農(nóng)藥殘留。這些方法對樣品都有不同程度的破壞，無法在保持樣品原形的情況下分離農(nóng)殘，而且所需工作壓力較大（7～50 MPa），處理樣品量少，不適于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[9，10]。

亞臨界萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用分離在特種油脂、香精香料等領(lǐng)域[11～13]，具有萃取壓力低、溫度低、效率高、無有害溶劑殘留、綠色環(huán)保等優(yōu)點[14]，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織指出丁烷可廣泛用于食品加工[15]，而美國、日本及歐洲等國沒有對丁烷殘留的限量要求[16]。

阿維菌素（Avermectin）是由鏈霉菌生產(chǎn)的具有高效殺蟲殺螨效果的抗生素[17]，在我國被廣泛用于茶葉等農(nóng)作物的蟲害防治。目前，使用亞臨界流體技術(shù)分離農(nóng)殘的研究報道還很少[18，19]。本研究用亞臨界流體丁烷分離茶樹鮮葉中殘留的阿維菌素；利用響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）的BoxBenhnken Design（BBD）原理，使用DesignExpert. V8.0.6.1軟件進行分析，優(yōu)化篩選亞臨界流體丁烷分離茶樹鮮葉中阿維菌素的最佳工藝；通過對茶葉品質(zhì)指標(biāo)多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的檢測和分析，探討此技術(shù)的可行性。本研究旨在不破壞茶葉外形的前提下， 實現(xiàn)茶葉表面的農(nóng)藥殘留的高效分離，為天然植物表面農(nóng)殘的去除提供理論和技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CBE5L亞臨界流體裝置（河南亞臨界公司）；API4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國ABI公司）；1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DJ04B中藥粉碎機（中國上海淀久公司）；FA1104分析天平（上海舜宇恒平公司）；VX200振蕩器（美國Labnet公司；3k15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；JSM6700F掃描電子顯微鏡（日本電子產(chǎn)業(yè)株式會社）；DU800核酸蛋白分析儀（美國Beckman公司）。

多酚氧化酶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、偏磷酸、檸檬酸、NaH2PO4（分析純）； L脯氨酸（層析純）、鄰苯二酚（化學(xué)純）均購于上海阿拉丁公司。乙腈、甲醇、丙酮、正己烷（色譜純，美國Baker公司）；N丙基乙二胺吸附劑（PSA，美國Supelco公司）；牛血清蛋白（BSA，美國Roche公司）；丁烷（純度≥95%，河南亞臨界公司）。實驗用水為超純水（18 MΩ.cm）。阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（Avermectin）、氯唑磷標(biāo)準(zhǔn)品（Isazofos）（純度≥95%，德國Dr. Ehrenstorfer公司），用乙腈配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 選擇信陽地區(qū)某茶園主栽的福鼎大白茶為原料。噴灑正常濃度兩倍的阿維菌素（0.5%乳油），3天后采摘茶樹枝條頂端的第1～3片葉（由上至下計），低溫保存、運輸。取茶樹鮮葉100 g，在保證茶葉外形的條件下裝入200目過濾袋，置于密閉萃取罐中；定量注入丁烷液體，控制亞臨界萃取裝置的溫度和壓力；樣品處理完畢后，30℃保存，待檢；每個樣品重復(fù)處理3次。

2.2.2 BoxBehnken的響應(yīng)面設(shè)計 在單因素預(yù)實驗中，設(shè)置溫度（15、25、35和45℃）、時間（10、20、30和40 min）、分離次數(shù)（1、2、3次）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15， m/V）4個變量因子，以樣品處理前后阿維菌素的減少量為分離量，計算農(nóng)殘的分離效率。由于茶樹鮮葉要經(jīng)過發(fā)酵、殺青等不同制茶工藝處理[21]，為了避免高溫導(dǎo)致多酚氧化酶失活[22]，設(shè)置溫度上限為45℃。

預(yù)實驗結(jié)果表明，料液比對實驗結(jié)果無顯著影響，可能是因為所用的丁烷相對于茶葉表面的農(nóng)殘是過量的。以BoxBehnken中心組合設(shè)計為原理，以溫度、時間、分離次數(shù)3個因子為自變量（分別以A，B，C表示），以阿維菌素分離量為響應(yīng)值（以y表示），設(shè)計了3因子3水平共17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，實驗所用料液比為1∶10，每個實驗點樣品重復(fù)處理3次。響應(yīng)面設(shè)計的參數(shù)詳見表1。

2.2.3 農(nóng)殘檢測方法 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取氯唑磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈稀溶解并配制成20 μg/mL內(nèi)標(biāo)使用液[22]。