一株雙酚A降解菌的篩選、鑒定及其生長、降解條件

王 迪，馬溪平，孟雪蓮，董文靈，董 興，徐成斌

（1. 遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2. 遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036）

一株雙酚A降解菌的篩選、鑒定及其生長、降解條件

王 迪1，馬溪平1，孟雪蓮2，董文靈1，董 興1，徐成斌1

（1. 遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2. 遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036）

從沈陽北部污水處理廠曝氣池活性污泥中馴化、分離及篩選得到一株以雙酚A為唯一碳源的高效降解菌株D-17，通過菌體形態(tài)、生理生化反應(yīng)特性及16S rDNA基因測序分析對其進行了鑒定，并研究了該菌株的生長及雙酚A降解條件。菌種鑒定結(jié)果表明，該菌為乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。實驗結(jié)果表明：該菌株的生長及降解雙酚A的最適條件為溶液pH 7.0，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，降解溫度30 ℃，降解時間5 d；當(dāng)雙酚A初始質(zhì)量濃度為60 mg/ L時，雙酚A降解率達52.62%；投加蛋白胨后，雙酚A降解率提高至57.15%。

乙酸鈣不動桿菌；雙酚A；菌種鑒定；降解條件

雙酚A遍及人們生活的諸多領(lǐng)域，是環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯等很多聚合型化工產(chǎn)品的原料［1-2］。近年來，在全球范圍內(nèi)，特別是發(fā)達地區(qū)的水環(huán)境中，都檢測到了雙酚A的存在［3-6］。在我國遼寧省等區(qū)域的地表水中也曾發(fā)現(xiàn)存在較高濃度的雙酚A［7-8］。雙酚A具有的高毒性及持久性會對人類健康及環(huán)境造成嚴重威脅，目前該物質(zhì)已被美國環(huán)境保護署認定為內(nèi)分泌干擾物（EDCs）［9-11］。

水環(huán)境中雙酚A的去除方法有很多，但相比于物理方法和化學(xué)方法，生物降解雙酚A的優(yōu)勢是低成本、高去除率和長降解持續(xù)周期，利用好氧微生物去除雙酚A的效果更為顯著［12-13］。目前，假單胞菌、新鞘氨醇桿菌、芽孢桿菌及少動鞘氨醇單胞菌等雙酚A降解菌，均被人們分離得到［11，14-20］。2006年Kwon等［21］進行了乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）作為雙酚A降解菌的相關(guān)研究，結(jié)果顯示該菌株對雙酚A的最大耐受濃度為1 140 μg/ mL，影響其降解效果的兩個因素的最佳值為：降解溫度30 ℃，降解pH 7.0。

本工作從沈陽北部污水處理廠馴化獲得一株以雙酚A為碳源的雙酚A降解菌，進行了菌種鑒定，并對該菌株進行了生長及雙酚A降解條件的研究，以期為乙酸鈣不動桿菌作為雙酚A高效降解菌的生物降解研究提供理論依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

富集培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏4，NaCl 5，pH 7.0；無機鹽培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 1，MgSO40.2，NH4Cl 0.1，KH2PO41，Na2HPO4·12H2O 3.8，pH 7.0；分離培養(yǎng)基（g/ L）：蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏4，瓊脂20%（w），pH 7.0。以上培養(yǎng)基皆添加雙酚A溶液（經(jīng)少量無水乙醇助溶），使雙酚A 質(zhì)量濃度為60 mg/L，在121 ℃的條件下滅菌處理30 min。

活性污泥：取自沈陽北部污水處理廠曝氣池。

1.2 菌株的馴化、分離和篩選

在富集培養(yǎng)基中富集耐雙酚A菌株后，再用含雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基對菌株進行不斷地馴化，每隔6 d按10 mg/L的梯度增加雙酚A質(zhì)量濃度至60 mg/L。經(jīng)在分離培養(yǎng)基上多次平板劃線后，從25個菌落中通過鏡檢及降解能力實驗，最后獲得一株以雙酚A為碳源且降解能力相對較強的純菌菌株D-17。

1.3 菌種鑒定

以革蘭氏染色結(jié)果、菌落特征和生理生化特性為菌株的初步鑒定依據(jù)。委托哈爾濱博仕技術(shù)有限公司進行16S rDNA序列分析，應(yīng)用CLUSTALX 2.0及MEGA 5.10軟件構(gòu)建NJ（Neighbor-joining）進化樹。

1.4 生長及降解條件的優(yōu)化

將處于對數(shù)生長期的菌株D-17接種于含60 mg/L雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基中，以不同的溶液pH、接種量、降解溫度、搖床轉(zhuǎn)速、外加有機物為考察條件，振蕩搖床培養(yǎng)5 d，測定菌株的生長情況及雙酚A降解效果。

1.5 分析方法

雙酚A質(zhì)量濃度的測定：將待測菌液置于離心機中離心（12 000 r/min，1 min），采用美國Varian公司Cary 50型紫外分光光度計測定上清液在波長275 nm處的吸光度，以未接菌無機鹽培養(yǎng)基為空白對照，計算雙酚A質(zhì)量濃度。

菌體濃度的測定：采用同上紫外分光光度計，測定待測菌液在 600 nm波長處的光密度值（OD600），以此表征菌體濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株D-17的鑒定

菌株D-17菌落呈邊緣規(guī)則、淡黃色、不透明的圓形，表面凸起、濕潤、光滑而有光澤，菌體無鞭毛，無芽孢，桿狀，靜止期呈圓形，大小為（0.7～1.3）μm×（0.3～2.1）μm；革蘭氏染色呈陰性。菌株D-17的生理生化試驗結(jié)果見表1。

表1 菌株D-17的生理生化試驗結(jié)果

根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果，鑒定該菌株為乙酸鈣不動桿菌，在Genbank中登錄號為AJ888983。菌株D-17的系統(tǒng)進化樹見圖1。

2.2 菌株D-17的生長曲線

在溶液pH為7.0、接種量為10%、降解溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，菌株D-17的生長曲線和雙酚A降解率見圖2。由圖2可見：0～2 d時為菌株D-17的生長停滯期，菌體濃度和雙酚A降解率都增長緩慢；2～4 d時為菌株D-17的對數(shù)增長期，大量繁殖的菌株細胞使雙酚A的降解率迅猛增加；4～5 d時為菌株D-17的生長穩(wěn)定期，生長曲線走勢較為平穩(wěn)，菌體濃度和雙酚A降解率變化不大，5 d時雙酚A降解率達到了最大值52.62%。因此，選定5 d為最佳降解時間。

圖1 菌株D-17的系統(tǒng)進化樹

2.3 菌株D-17生長與降解條件的確定

2.3.1 溶液pH對菌株D-17生長和降解性能的影響在接種量為10%、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解溫度為30 ℃、降解時間為5 d的條件下，溶液pH對雙酚A降解率和OD600的影響見圖3。

圖3 溶液pH對雙酚A降解率和OD600的影響

由圖3可見：過酸和過堿的環(huán)境皆會對雙酚A的降解產(chǎn)生負面作用；溶液pH在6.0～8.0時，菌株D-17的生長情況和雙酚A的降解情況均較佳，弱堿環(huán)境（pH=8.0）下略好于弱堿環(huán)境（pH=6.0）；溶液pH為7.0時，菌株的生長狀態(tài)及雙酚A降解狀況最優(yōu)。有報道稱生物降解雙酚A過程中能產(chǎn)生一種中間產(chǎn)物4-丙烯酸羥丁酯，營造出弱酸性的菌株生長環(huán)境［21-23］。因此，將7.0選為菌株D-17的最適溶液pH。

2.3.2 接種量對菌株D-17生長和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解溫度為30 ℃、降解時間為5 d的條件下，接種量對對雙酚A降解率和OD600的影響見圖4。由圖4可見：接種量為1%～10%時，對菌株D-17生長及雙酚A降解效果的影響非常明顯，菌體濃度逐漸增大，雙酚A降解率明顯提高，說明貧營養(yǎng)環(huán)境會抑制好氧菌株細胞生長和降解率提高［24］；接種量為10%時，菌株D-17生長狀態(tài)及雙酚A降解效果都達到最佳；當(dāng)接種量超過10%時，接種量變化對菌株D-17生長狀況的影響不再明顯，此時菌株D-17數(shù)量過多，造成生長所需雙酚A的量嚴重不足。故將10%作為培養(yǎng)菌株D-17的最佳接種量。

圖4 接種量對雙酚A降解率和OD600的影響

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株D-17生長和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、接種量為10%、降解溫度為30 ℃、降解時間為5 d的條件下，搖床轉(zhuǎn)速對雙酚A降解率和OD600的影響見圖5。由圖5可見：在搖床轉(zhuǎn)速不足150 r/min時，菌株D-17的生長曲線及雙酚A降解曲線隨搖床轉(zhuǎn)速的增加而呈上升趨勢，這可能是由于菌株D-17是好氧菌，而搖床轉(zhuǎn)速的加快增加了溶液的含氧量，進而促進菌株D-17的生長及雙酚A的降解；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過高（大于150 r/min）時，菌株D-17菌體濃度及雙酚A降解率的增長開始變得遲緩。從能量和效率兩方面進行思考，選擇150 r/min為菌株D-17降解雙酚A所用搖床轉(zhuǎn)速的最適值。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對雙酚A降解率和OD600的影響

2.3.4 降解溫度對菌株D-17生長和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、接種量為10%、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解時間為5 d的條件下，降解溫度對雙酚A降解率和OD600的影響見圖6。

圖6 降解溫度對雙酚A降解率和OD600的影響雙酚A降解率：● 菌株D-17；■ 空白對照；

由圖6可見：降解溫度為30～35 ℃時，菌體濃度較高，雙酚A降解率較高；降解溫度低于30 ℃時，溫度的逐步增高導(dǎo)致菌體濃度和雙酚A降解率呈上升趨勢；當(dāng)降解溫度超過35 ℃時，菌株D-17的生長與代謝受到抑制，雙酚A降解率隨降解溫度的提高而逐漸變小。因此，將30 ℃設(shè)定為菌株D-17降解雙酚A所需降解溫度的最適值。

2.3.5 外加有機物種類對菌株D-17生長和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、接種量為10%、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解溫度為30 ℃、降解時間為5 d、外加有機物加入量為0.1%（w）的條件下，外加有機物種類對雙酚A降解率和OD600的影響見圖7。由圖7可見：葡萄糖、乳糖和蔗糖均可不同程度地抑制雙酚A的降解，尤其是葡萄糖使雙酚A降解率由原來（無外加有機物）的52.18%降低到40.37%；而蛋白胨和尿素對雙酚A的降解起到促進效應(yīng)。相比雙酚A，葡萄糖、乳糖和蔗糖的結(jié)構(gòu)相對簡單，菌株會優(yōu)先利用更易于被降解的外加有機物；而蛋白胨和尿素皆為微生物的生長提供氮源，而且并不會與雙酚A產(chǎn)生競爭性抑制，不造成有毒有害的影響；特別是蛋白胨的加入對菌株D-17的生長及雙酚A降解的促進效果尤佳，可使雙酚A降解率增加到57.15%。由此可見，對比其他4種外加有機物，蛋白胨是菌株D-17生長所需營養(yǎng)物質(zhì)中最佳的一個。

圖7 外加有機物種類對雙酚A降解率和OD600的影響

3 結(jié)論

a）從沈陽北部污水處理廠曝氣池活性污泥中馴化、分離及篩選得到一株以雙酚A為碳源的高效菌株D-17，經(jīng)鑒定為乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。

b）菌株D-17的生長和降解雙酚A的最適條件為：溶液pH 7.0、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、降解溫度30 ℃、降解時間5 d。在最適條件下，雙酚A（初始質(zhì)量濃度60 mg/L）的降解率達到52.62%。投加0.1%（w）葡萄糖、乳糖和蔗糖可抑制菌株D-17降解雙酚A，而當(dāng)添加0.1%（w）蛋白胨和尿素時，菌株D-17的生長和雙酚A的降解均得到了一定程度的促進，當(dāng)?shù)鞍纂思尤肓繛?.1%（w）時，雙酚A降解率可增加至57.15%。

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（編輯 葉晶菁）

Screening，identification of a bisphenol A-degrading strain and its growth and degradation conditions

Wang Di1，Ma Xiping1，Meng Xuelian2，Dong Wenling1，Dong Xing1，Xu Chengbin1
（1. School of Environmental Science，Liaoning University，Shenyang Liaoning 110036，China；2. School of Pharmacy，Liaoning University，Shenyang Liaoning 110036，China）

A high-effi ciency degradating strain D-17，which could use bisphenol A（BPA）as sole carbon source，was obtained by acclimation，isolation and screening from activated sludge in a aeration tank of Shenyang northern sewage treatment plant. The strain was identified by morphological，physiological and biochemical analysis and 16S rDNA gene sequence analysis，and its growth and degradation conditions were studied. The identifi cation results showed that D-17 was an Acinetobacter calcoaceticus strain. The optimum conditions for D-17growth and BPA degradation were as follows：solution pH 7.0，inoculation amount 10%，rotary speed 150 r/min，degradation temperature 30 ℃ and degradation time 5 d. When the initial mass concentration of BPA was 60 mg/L，the BPA degradation rate was 52.62%；With the addition of peptone，the BPA degradation rate was increased to 57.15%.

Acinetobacter calcoaceticus；bisphenol A；strain identifi cation of；degradation condition

X172

A

1006-1878（2017）02-0189-05

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.02.011

2016 - 08 - 04；

2016 - 12 - 19。

王迪（1991—），女，遼寧省本溪市人，碩士生，電話 13840401260，電郵 13840401260@163.com。聯(lián)系人：徐成斌，電話 13840149575，電郵 xuchengbin80@163.com。

國家“十二五”科技重大專項子課題（2012ZX072020 03-05）；遼寧省教育廳一般項目（L2015202）；2016年遼寧省級本科教改立項項目。