復方接骨中藥介導MAPK信號通路促進骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化

梁 軍 劉安民 葛洪醒 周 峰 金 濤 羅 丹

(荊門市第二人民醫(yī)院骨科，湖北 荊門 448000)

復方接骨中藥介導MAPK信號通路促進骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化

梁 軍 劉安民 葛洪醒 周 峰 金 濤 羅 丹

(荊門市第二人民醫(yī)院骨科，湖北 荊門 448000)

目的 探討復方接骨中藥介導MAPK信號通路對骨髓間充質干細胞(BMSCs)增殖及成骨分化的促進作用。方法 取健康雄性SD大鼠60只，隨機平均分為實驗組和對照組，實驗組灌喂復方接骨中藥煎劑，對照組灌喂等體積自來水，處理10 d后提取各組大鼠血清。分離BMSCs，利用體積分數為0.1的含藥血清及非含藥血清單獨處理BMSCs 24、48、72 h及聯(lián)合10 μmol/L p38MAPK抑制劑SB203580處理BMSCs 72 h后，MTT檢測細胞增殖；RT-PCR及Western印跡檢測兩組血清單獨處理及聯(lián)合SB203580處理BMSCs 72 h后成骨細胞分化標記基因ALP、BGP、BMP-2的表達；Western印跡檢測兩組血清處理BMSCs 72 h p38蛋白表達及磷酸化。結果 含藥血清處理24、48 h，細胞OD值與非含藥血清組及對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，第72小時含藥血清組細胞OD值顯著高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)，非含藥血清組細胞OD值與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組血清處理72 h后，含藥血清處理組ALP、BGP、BMP-2表達及p38磷酸化明顯高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)，非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2表達及p38磷酸化與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，p38總蛋白表達三組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SB203580聯(lián)合兩組血清處理72 h后，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，明顯低于對照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表達顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 復方接骨中藥可能通過促進MAPK信號通路促進BMSCs的增殖及成骨分化。

復方接骨中藥；骨髓間充質干細胞

間充質干細胞(MSCs)是存在于發(fā)育早期中胚層和外胚層的干細胞，骨髓MSCs(BMSCs)則是存在于骨髓的MSCs〔1〕。BMSCs具有多分化潛能，在個體發(fā)育成熟及組織修復過程中發(fā)揮重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，中藥許多組分體外對于BMSCs的增殖及分化具有促進作用〔3〕。本實驗所用藥方參照范紅旗等〔4〕的藥方成藥，具有補肝腎、強筋骨、活血止痛等作用，對骨折愈合具有促進作用。目前復方接骨中藥促進BMSCs增殖、分化的研究較少且機制不清。本研究通過中藥藥理學〔5〕方法獲得含藥血清作為藥物源，體外獲得BMSCs，研究復方接骨中藥對BMSCs增殖及成骨分化的影響，探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠由武漢大學動物實驗中心提供。接骨中藥組方：厚樸10 g，大黃10 g，枳殼10 g，桃仁10 g，蘇木10 g，當歸10 g，紅花5 g，骨碎補15 g，川斷15 g，熟地15 g，自然銅10 g，龜板10 g，枸杞15 g，杜仲15 g。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；蛋白酶裂解液、青鏈霉素雙抗購自上海碧云天生物技術有限公司；p38MAPK抑制劑SB203580購自美國Gene Operation；堿性磷酸酶(ALP)單抗、骨鈣素(BGP)單抗、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2單抗、p38單抗、p-p38單抗、β-actin單抗、過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz Biotech；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海奧迪生物制品有限公司；PrimerScript反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；酶標儀購自美國Thermo；倒置顯微鏡購自德國Leica。

1.2 含藥血清的制備 選取60只3月齡、體重300～350 g的SD健康大鼠，隨機分為對照組和實驗組。復方中藥每天煎制后，按2.5 ml/只的量灌喂實驗組大鼠，對照組每天灌喂等量的自來水，連續(xù)灌喂10 d。末次灌喂前1 d大鼠禁食水，對大鼠進行麻醉后進行腹腔取血。大鼠腹部消毒后，打開腹腔，找到腹主動脈后進行穿刺取血，每只大鼠約取7～8 ml血，2 500 r/min離心30 min取上清。上清置于56℃水浴鍋中30 min使補體失活，過濾除菌后置于4℃保存。

1.3 BMSCs的分離及鑒定 取1只3月齡健康雄性SD大鼠，處死后置于75%乙醇中消毒15 min，超凈臺中取出大鼠的雙側股骨和脛骨，剪掉骨兩端使骨髓腔暴露出來，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓直至骨為白色，收集流出液到離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，使用5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，細胞懸液加到5 ml 1.073 g/ml的Percoll梯度液中，4℃、500 r/min離心30 min，取中間細胞層重懸于細胞培養(yǎng)液中，細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度約達到80%時，0.25%胰酶消化后收集細胞，按1∶2接種至新鮮培養(yǎng)基中。取第4代細胞，胰酶消化后收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，并調整細胞濃度為1×106個/ml，分別加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90抗體置于4℃避光孵育30 min，收集細胞，PBS清洗后，向沉淀中加入0.3 ml PBS重懸，流式細胞儀檢測。

1.4 MTT比色法檢測BMSCs增殖 取第4代對數生長期的BMSCs，胰酶消化后收集細胞，并調整細胞濃度為2×104個/ml，以每孔200 μl接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向含藥血清孔中加入體積分數為0.1含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，非含藥血清孔加入體積分數為0.1的非含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，含藥血清+SB203580組及非含藥血清+SB203580組預先加入10 μmol/L SB203580干預1 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入體積分數為0.1的非含藥血清及0.1的含藥血清處理72 h，SB203580組加入10 μmol/L SB203580干預1 h后加入等體積PBS處理72 h，對照組不作處理，每個梯度設置6個復孔，同時設置空白對照組，培養(yǎng)完成后取出細胞，加入150 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩培養(yǎng)10 min，晶體完全溶解后，酶標儀檢測490 nm處吸光值。

1.5 RT-PCR檢測ALP、BGP、BMP-2的表達 取處理后各組細胞，向細胞中加入1 ml Trizol，冰上靜置30 min，細胞中加入200 μl氯仿，震蕩15s后冰上靜置3 min，離心取上清液至新離心管中，加入等體積異丙醇，震蕩30 s后-20℃放置30 min，離心取沉淀，加入1 ml無水乙醇漂洗2次，待沉淀晾干后加入20 μl無酶水溶解，微量核酸儀檢測RNA濃度。利用PrimerScript反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明配制反應體系，置于定量PCR儀檢測，并分析mRNA的相對表達水平。

1.6 Western印跡檢測細胞中蛋白表達 取處理72 h的各組細胞，離心收集沉淀，加入細胞裂解液冰上孵育30 min，離心收集上清轉移至新的離心管中，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品，樣品蛋白含量一致。配制蛋白膠，蛋白膠凝固后上樣，電壓80 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳直至溴酚藍跑出蛋白膠。取出蛋白膠冰浴轉膜，取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜加入5%脫脂奶粉室溫孵育3 h，分別加入ALP單抗、BGP單抗、BMP-2單抗、p38單抗、p-p38單抗作為一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后加入二抗室溫孵育1 h，TBST清洗，加入化學增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影5 min后利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0軟件行t檢驗，使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件繪圖。

2 結 果

2.1 含藥血清對BMSCs增殖的影響 非含藥血清組與對照組細胞OD值差異不大(P>0.05)，第24小時和第48小時含藥血清組OD值與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，72 h時含藥血清組細胞OD值明顯高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)。說明復方接骨中藥促進BMSCs增殖。見圖1。

2.2 含藥血清對成骨分化的影響 mRNA表達統(tǒng)計時將對照組ALP、BGP、BMP-2 mRNA的表達均設為1，蛋白表達統(tǒng)計時設內參蛋白β-actin的表達為1。非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2的mRNA表達分別為(1.052±0.123)、(1.074±0.123)、(1.101±0.172)，含藥血清組分別為(1.825±0.112)、(2.362±0.153)、(1.413±0.135);對照組ALP、BGP、BMP-2的蛋白表達分別為(0.223±0.015)、(0.329±0.021)、(0.162±0.008)，非含藥血清組分別為(0.227±0.016)、(0.334±0.022)、(0.169±0.009)，含藥血清組分別為(0.398±0.019)、(0.683±0.024)、(0.262±0.016)，非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，含藥血清組三者mRNA及蛋白的表達均明顯升高，與對照組及非含藥血清組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 含藥血清對p38蛋白磷酸化的影響 將內參蛋白β-actin的表達設為1。對照組p38、p-p38蛋白表達分別為(0.524±0.023)、(0.167±0.014)，非含藥血清組分別為(0.527±0.025)、(0.170±0.016)，含藥血清組分別為(0.529±0.026)、(0.318±0.017)，非含藥血清組與對照組相比未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)，含藥血清組p38總蛋白表達與對照組相比無明顯變化(P>0.05)；p-p38蛋白表達明顯升高，顯著高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)。見圖3。

2.4 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對p38蛋白表達及磷酸化的影響 設內參蛋白β-actin的表達為1，對照組p38、p-p38蛋白表達分別為(0.518±0.028)、(0.182±0.026)，SB203580組為(0.516±0.027)、(0.104±0.018)，非含藥血清組+SB203580組分別為(0.520±0.029)、(0.108±0.016)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.521±0.031)、(0.175±0.014)，4組細胞中p38總蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；非含藥血清+SB203580組和SB203580組p-p38的表達未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，與對照組相比顯著降低(P<0.01)，含藥血清組p-p38的表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯著高于SB203580組(P<0.01)。見圖4。

與對照組相比：1)P<0.01；與非含藥血清組相比：2)P<0.01圖1 兩組血清對BMSCs增殖的影響

圖2 兩組血清對ALP、BGP、BMP-2表達的影響

圖3 兩組血清對p38蛋白表達及磷酸化的影響

2.5 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對BMSCs增殖的影響 對照組、SB203580組、非含藥血清組+SB203580組、含藥血清組+SB203580組OD值分別為(0.118±0.014)、(0.061±0.012)、(0.069±0.011)、(0.102±0.009)，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，明顯低于對照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細胞OD值顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對成骨分化的影響 SB203580組ALP、BGP、BMP-2 的mRNA表分別為(0.428±0.032)、(0.397±0.027)、(0.221±0.018)，非含藥血清組+SB203580組ALP、BGP、BMP-2 mRNA分別為(0.436±0.033)、(0.408±0.026)、(0.230±0.017)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.973±0.054)、(0.962±0.048)、(0.592±0.037)；對照組ALP、BGP、BMP-2 的蛋白表達分別為(0.322±0.021)、(0.454±0.032)、(0.215±0.020)，SB203580組分別為( 0.218±0.019)、( 0.234±0.026)、(0.112±0.015)，非含藥血清組+SB203580組分別為(0.220±0.021)、(0.239±0.028)、(0.115±0.016)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.317±0.023)、(0.441±0.035)、(0.210±0.020)，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細胞ALP、BGP、BMP-2 mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，明顯低于對照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細胞三種基因表達顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

1：對照組；2：SB203580組；3：非含藥血清+SB203580組；4：含藥血清+SB203580組；下圖同圖4 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對p38蛋白表達及磷酸化的影響

圖5 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對成骨分化的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)成人MBSCs仍具有分化能力，在適宜的條件下能分化成骨相關的結締組織，證實MBSCs具有成骨能力〔6〕。ALP是成骨細胞分化所必需的酶，是成骨細胞分化的早期標志物〔7〕。ALP通過水解有機酸酯為游離的磷酸根，而且能通過破壞鈣化抑制劑啟動鈣化的發(fā)生〔8〕。ALP的活性標志著成骨細胞的分化程度。BGP是由成熟的成骨細胞分泌的一種多肽，是成骨細胞分化的中期標志物〔9〕。BGP含量的高低與成骨細胞的分化程度正相關。大量研究證實，BGP含量增高促進成骨細胞分化。BMP-2也是成骨細胞分化的檢測指標，其含量的高低與成骨細胞的分化程度密切相關〔10〕。BMP-2的表達對成骨細胞的增殖以及分化具有促進作用〔11〕。本研究結果說明復方接骨中藥能促進MBSCs向成骨細胞分化。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞的生長、分化、炎癥反應等具有調節(jié)作用〔12〕。MAPK信號通路包括ERK1/2、p38等，活化的MAPK通過級聯(lián)反應將外界信號傳遞給細胞核，通過作用于AIF-2、c-Myc等轉錄因子，調節(jié)與細胞增殖、分化相關的基因表達〔13〕。有報道稱p38MAPK信號通路對成骨細胞的分化具有促進作用，p38蛋白的磷酸化是該通路被激活的重要過程〔14〕。本研究結果顯示，復方接骨中藥血清對p38的磷酸化具有促進作用，提示該中藥可能通過活化p38MAPK信號通路促進MBSCs的增殖及成骨分化。蛋白酶抑制劑具有抑制蛋白激酶活性的能力，SB203580是p38MAPK的常用抑制劑，能夠透過細胞抑制p38蛋白磷酸化，進而抑制后續(xù)的級聯(lián)反應，研究發(fā)現(xiàn)SB203580可以有效抑制細胞中一些炎癥因子誘導的信號轉導途徑〔15〕。本研究證實復方接骨中藥通過作用于p38MAPK信號通路，使p38蛋白磷酸化增強，進而促進該信號通路的活化，促進MBSCs的增殖及成骨分化。

1 林思文,王麗麗,施劍明,等.骨髓間充質干細胞成骨分化中信號轉導途徑與雌激素受體的關系〔J〕.中國老年學雜志,2016；36(5):1267-70.

2 Chowdhury R,Webber JP,Gurney M,etal.Cancer exosomes trigger mesenchymal stem cell differentiation into pro-angiogenic and pro-invasive myofibroblasts〔J〕.Oncotarget,2015;6(2):715-31.

3 華 臻,楊俊鋒,潘婭嵐,等.補腎中藥促進骨髓間充質干細胞成骨分化的研究進展〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2015;30(9):3222-6.

4 范紅旗,孫輝生,劉振旗,等.復方接骨中藥對骨髓間充質干細胞體外增殖及向成骨細胞分化的影響〔J〕.中國組織工程研究,2007;11(10):1818-21.

5 張靈娜,林 兵,宋洪濤.中藥血清藥理學、血清藥物化學的研究概況及展望〔J〕.中草藥,2015;46(17):2662-5.

6 Baker N,Sohn J,Tuan RS.Promotion of human mesenchymal stem cell osteogenesis by PI3-kinase/Akt signaling,and the influence of caveolin-1/cholesterol homeostasis〔J〕.Stem Cell Res Ther,2015;6:238.

7 彭 莉,李雙慶.β2 腎上腺素能受體激動劑/拮抗劑對大鼠成骨細胞骨堿性磷酸酶比活性的影響〔J〕.山東醫(yī)藥,2014;54(17):26-7.

8 Morthorst JE,Holbech H,Jeppen M,etal.Evaluation of yolk protein levels as estrogenic biomarker in bivalves;comparison of the alkali-labile phosphate method(ALP)and a species-specific immunoassay(ELISA)〔J〕.Comp Biochem Physiol Toxicol Pharmacol,2014;166(1):88-95.

9 Li J,Zhang H,Yang C,etal.An overview of osteocalcin progress〔J〕.J Bone Miner Metab,2016;34(4):367-79.

10 Qian X,Zhang C,Chen G,etal.Effects of BMP-2 and FGF2 on the osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hindlimb-unloaded rats〔J〕.Cell Biochem Biophys,2014;70(2):1127-36.

11 Shen J,James AW,Zhang X,etal.Novel Wnt regulator NEL-like molecule-1 antagonizes adipogenesis and augments osteogenesis induced by bone morphogenetic protein 2〔J〕.Am J Pathol,2016;186(2):419-34.

12 Im NK,Jang WJ,Jeong CH,etal.Delphinidin suppresses PMA-induced MMP-9 expression by blocking the NF-κB activation through MAPK signaling pathways in MCF-7 human breast carcinoma cells〔J〕.J Med Food,2014;17(8):855-61.

13 Zhen Y,Zhang W,Liu C,etal.Exogenous hydrogen sulfide promotes C6 glioma cell growth through activation of the p38 MAPK/ERK1/2-COX-2 pathways〔J〕.Oncol Rep,2015;34(5):2413-22.

14 聶 嘉,張 博,顧 斌,等.p38絲裂原活化蛋白激酶在炎癥微環(huán)境作用下對牙周膜干細胞成骨分化的影響〔J〕.中國醫(yī)學科學院學報,2015;37(1):1-7.

15 Meng A,Wang B,Zhang XP,etal.Additive suppression of LPS-induced IL-10 and TNF-α by pre-treatment of dexamethasone and SB203580 in a murine alveolar macrophage cell line(MH-S)〔J〕.Inflammation,2015;38(3):1260-6.

〔2016-10-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

湖北省自然科學基金項目(No.2004ABA208)

羅 丹(1978-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事骨疾病研究。

梁 軍(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事骨疾病研究。

R681

A

1005-9202(2017)10-2360-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.007