人參皂苷Rb1對H9c2細胞缺氧復氧的作用

左長鵬 王 芳 縱 靜 李芳芳 雍 輝 梁 凱 徐路紅 劉加立 錢文浩

(徐州醫(yī)科大學心血管病研究所，江蘇 徐州 221000)

·基礎(chǔ)研究·

人參皂苷Rb1對H9c2細胞缺氧復氧的作用

左長鵬 王 芳 縱 靜1李芳芳1雍 輝 梁 凱 徐路紅1劉加立1錢文浩1

(徐州醫(yī)科大學心血管病研究所，江蘇 徐州 221000)

目的 觀察人參皂苷Rb1對H9c2細胞缺氧復氧的作用。方法 采用人參皂苷Rb1對H9c2細胞缺氧復氧進行預處理，通過檢測氧化應激、凋亡指標觀察人參皂苷Rb1的作用。將細胞隨機分為對照組、缺氧復氧組、缺氧復氧加人參皂苷Rb1(50、100、200 μmol/L)，按實驗設(shè)計因素處理后，通過蛋白電泳檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，檢測氧化應激指標丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)，TUNEL法檢測細胞凋亡。結(jié)果 缺氧復氧處理可使H9c2心肌細胞的ROS 和MDA 水平顯著增加，SOD 活性顯著下降，上調(diào)caspase-3的表達，增加H9c2心肌細胞的凋亡。人參皂苷Rb1預處理可減少缺氧復氧H9c2細胞MDA表達量，增加SOD活性，降低ROS水平，且人參皂苷Rb1預處理可減少缺氧復氧H9c2細胞caspase-3的表達量及凋亡細胞數(shù)量。結(jié)論 人參皂苷Rb1可降低缺氧復氧對H9c2心肌細胞的氧化應激損傷及凋亡，從而對缺氧復氧H9c2心肌細胞起保護作用。

人參皂苷Rb1；缺氧復氧；氧化應激；凋亡

目前，降低心肌缺血患者死亡率最有效的方法是通過溶栓或者機械打通閉塞血管實現(xiàn)快速灌注。然而，再灌注本身也可以損害心肌，這一過程稱為“再灌注損傷”，長時間心肌缺血以后，再灌注會引起心肌細胞凋亡、壞死以及存活心肌細胞可逆的收縮功能障礙〔1，2〕。人參皂苷Rb1主要存在于人參、三七、西洋參等植物中，是其主要活性成分〔3〕。人參皂苷Rb1可清除氧自由基、抑制鈣過度內(nèi)流、改善能量代謝等，人參皂苷Rb1預處理具有抗心肌缺血/再灌注損傷的保護作用〔4，5〕。本實驗在體外建立心肌細胞缺氧復氧(I/R)模型，觀察I/R對H9c2心肌細胞凋亡的影響，以及人參皂苷Rb1的干預效應。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 人參皂苷Rb1(Vicmed，純度>95%)，胎牛血清、培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶青霉素鏈霉素雙抗溶液(Sigma公司)，CCK8試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，Annexin Ⅴ-APC 凋亡檢測試劑盒(eBioscience公司)，牛血清白蛋白(Amresco公司)，TUNEL試劑盒(Chemicon，Temecula，CA公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Amersham公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，三氣培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標儀(美國伯樂公司)，蛋白電泳及電轉(zhuǎn)裝置(Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素雙抗溶液的DEME培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。傳3～5代，待狀態(tài)穩(wěn)定后用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，每次傳代時細胞密度控制在1×105/ml，進行分組實驗。

1.3 實驗分組 ①空白對照(CON)組：細胞于二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2、37℃)培養(yǎng)48 h。②缺氧復氧(H/R)組：細胞于二氧化碳培養(yǎng)箱預培養(yǎng)32 h后，三氣培養(yǎng)箱(N294%、CO25%、O21%，37℃)經(jīng)歷4 h缺氧培養(yǎng)，然后在二氧化碳培養(yǎng)箱復氧12 h。③人參皂苷Rb1 低、中、高(L、M、H)組：細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱預培養(yǎng)32 h后，分別加入50、100、200 μmol/L人參皂苷Rb1預處理1 h，然后在三氣培養(yǎng)箱經(jīng)歷4 h缺氧，再在二氧化碳培養(yǎng)箱復氧12 h。

1.4 CCK8檢測 將100 μl的H9c2單細胞懸液加入96孔板中，二氧化碳培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)板中分別加入50、100、200、400 μmol/L不同濃度的人參皂苷Rb1，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后向培養(yǎng)板中加入10 μl CCK8溶液，再孵育2 h，最后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.5 酶標儀檢測活性氧(ROS) 將細胞等密度接種于96孔板中，每孔約2×105/ml，用各組實驗因素處理2 h后加入DCFA-DA探針，在37℃孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍后，檢測DCF熒光強度(激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長525 nm)，以每次實驗組熒光強度作為100%計算ROS含量。

1.6 MDA含量和SOD活性檢測 MDA含量測定取100 μl細胞勻漿；SOD活性檢測取20 μl細胞勻漿。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。分別按照試劑盒說明進行MDA含量及SOD活性檢測。

1.7 TUNEL檢測 將H9c2細胞傳代于24孔板，培養(yǎng)12 h后，按照上述分組進行加藥，12 h后PBS洗滌3遍，用1%多聚甲醛進行固定，按照TUNEL試劑盒說明進行染色，用DAPI進行染核并封片。倒置顯微鏡拍照，用IPP6.0軟件進行合并(Merge)，并進行數(shù)量統(tǒng)計分析。

1.8 Western印跡檢測Procaspase-3、酶切caspase-3表達 使用Bradford法測定蛋白后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)封閉、一抗二抗孵育后，掃描并分析。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；組內(nèi)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或者組間方差不齊，采用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 人參皂苷Rb1對H9c2細胞毒性的影響 對照組細胞存活率為100%(OD450 nm為1.15±0.06)，人參皂苷Rb1在50、100、200、400 μmol/L濃度細胞存活率分別為97.4%、93.9%、90.4%、82.6%(OD450 nm分別為1.12±0.12，1.08±0.04，1.04±0.08，1.04±0.08)，因此本實驗設(shè)計的人參皂苷Rb1濃度具有低毒性。為了排除人參皂苷Rb1對H9c2細胞毒性損傷引起細胞存活率改變及影響其他實驗結(jié)果，本實驗采用50、100、200 μmol/L為藥物濃度。

2.2 各組MDA、ROS含量和SOD 活性比較 H/R 處理心肌細胞后SOD活性較CON組下降(P<0.05)，但其MDA、ROS含量顯著增高(P<0.05)。人參皂苷Rb1預處理細胞后，L、M、H各組MDA、ROS含量較H/R組明顯降低(P<0.05 )，但M組與H組間MDA、ROS含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；L、M、H各組SOD活性較H/R組顯著增高(P<0.05)，Rb1各組間SOD活性均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。表明人參皂苷Rb1預處理可以減少I/R H9c2細胞的氧化應激損傷，呈濃度依賴性。見表1 。

2.3 TUNEL染色結(jié)果 見圖1。H/R處理使H9c2心肌細胞TUNEL陽性細胞增多〔CON組(1.33±0.58)%，H/R(15.33±3.06)%，P<0.05〕，凋亡加重；L、M、H組與H/R組相比，TUNEL陽性細胞減少〔L、M、H組分別為(11.00±1.00)%，(6.67±1.16)%，(4.67±1.16)%，均P<0.05〕；M組與H組相比，TUNEL陽性細胞數(shù)變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；人參皂苷Rb1預處理能降低H9c2細胞TUNEL陽性細胞，改善心肌細胞的凋亡，呈濃度依賴性。

表1 各組SOD、MDA、ROS的表達量比較

與CON組比較：1)P<0.05；與H/R組比較：2)P<0.05；與L組比較：3)P<0.05；與M組比較：4)P<0.05

圖1 各組TUNEL染色陽性細胞數(shù)(×400)

2.4 Western印跡法檢測結(jié)果 H/R處理H9c2心肌細胞后，酶切caspase-3蛋白水平上調(diào)(P<0.05)，L、M、H組與H/R組相比酶切caspase-3蛋白表達量均降低(P<0.05)，但M組與H組間酶切caspase-3蛋白表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。H/R處理H9c2心肌細胞后，Procaspase-3蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，人參皂苷Rb1預處理能夠上調(diào)Procaspase-3凋亡蛋白的表達(P<0.05)，但M組與H組之間Procaspase-3凋亡蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。表明人參皂苷Rb1預處理可減少H9c2細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達，呈濃度依賴性。見圖2，表2。

圖2 各組Procaspase-3、酶切caspase-3的蛋白表達量比較

組別Procaspase?3Cleavedcaspase?3CON組1．00±0．101．00±0．12H/R組0．13±0．031)6．58±0．591)L組0．33±0．091)2)4．11±0．601)2)M組0．62±0．131)2)3)3．24±0．551)2)3)H組0．64±0．131)2)3)2．94±0．211)2)3)

與CON組比較：1)P<0.05;與H/R組比較：2)P<0.05；與L組比較：3)P<0.05

3 討 論

本研究證實I/R誘導的心肌細胞損傷與氧化應激反應密切相關(guān)。人參皂苷Rb1預處理可以降低I/R H9c2細胞內(nèi)的ROS 和MDA水平，使SOD活力升高，從而提示人參皂苷Rb1可能通過減輕氧化應激反應發(fā)揮對H9c2心肌細胞的保護作用。細胞接受來自胞外的刺激后，可以通過死亡受體和線粒體介導的途徑兩個方面觸發(fā)凋亡。作為凋亡瀑布的重要組成部分，caspase-3的級聯(lián)活化是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要機制〔6〕，而caspase-3為凋亡瀑布的最終共同通路，其活化是凋亡的重要標志〔7〕。Western印跡結(jié)合TUNEL染色結(jié)果顯示，H/R可明顯增加H9c2心肌細胞的凋亡細胞數(shù)，人參皂苷Rb1具有減少H9c2 H/R細胞凋亡的作用。人參皂苷Rb1可清除氧自由基，拮抗鈣通道，改善能量代謝，促進血管再生，抑制心肌細胞凋亡等。研究證明人參皂苷Rb1對神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)均有保護作用。人參皂苷Rb1對缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭等方面均有臨床意義〔8，9〕。已有的研究證實人參皂苷Rb1對缺血再灌注心肌細胞有明顯的抑制作用，根據(jù)研究，Rb1能顯著減少肥厚心肌細胞H/R的損傷〔10，11〕。H9c2細胞株來源于大鼠胚胎的心肌細胞，具有原代心肌細胞的一般生理生化特性，且能傳代培養(yǎng)，而廣泛用于細胞學和藥理學等研究。從細胞水平研究藥物的心肌保護效應目的就在于排除在體心臟、離體心臟等模型中全身神經(jīng)體液和局部不同類型細胞間的相互影響，從而更好地研究藥物對單個細胞的直接作用及其機制〔12～15〕。作為體外模擬，H9c2細胞系缺氧后復氧模型，能很好地用于體內(nèi)環(huán)境心肌I/R損傷的研究。Sheng等〔16〕的研究提示，抑制心肌細胞凋亡可以逆轉(zhuǎn)心肌肥厚并抑制心肌重構(gòu)，明顯改善心臟正常代謝，提高心血管疾病患者的生存率。本課題組先前已在動物在體水平證實人參皂苷Rb1可通過P38-MAPK通路對大鼠I/R損傷起保護作用〔17〕，本實驗只是檢測了氧化應激、凋亡指標，未涉及動物在體實驗的部分及對信號通路的進一步研究，因此存在一定的局限性。

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〔2016-11-15修回〕

(編輯 徐 杰)

Effects of ginsenoside Rb1 on hypoxia-reoxygenation H9c2 cells

ZUO Chang-Peng,WANG Fang,ZONG Jing,etal.

Institute of Cardiovascular Disease Research,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000,Jiangsu,China

Objective To observe the effects of ginsenoside Rb1 on hypoxia-reoxygenation H9c2 cells.Methods Ginsenoside Rb1 was used to pretreat hypoxia-reoxygenation H9C2 cells,and the effects of ginsenosides Rb1 on oxidative stress and apoptosis were observed. H9C2 cells were divided into normal control,hypoxia/reoxygenation(H/R),H/R plus low,medium and high dose Ginsenoside Rb1 (L,M,H)groups. The apoptosis-related protein caspase-3 was detected by electrophoresis,superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA),reactive oxygen species(ROS). TUNEL staining were used to detect.Results With treatment of hypoxia-reoxygenation ,the levels of ROS and MDA in H9c2 cardiomyocytes were significantly increased,the activity of SOD was decreased,the expression of apoptosis protein was increased and the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes was increased. Ginsenoside Rb1 decreased the content of MDA and increased the activity of SOD and decreased the level of ROS,while Ginsenoside Rb1 reduced the amount of apoptotic protein and the number of apoptotic cells in hypoxia-reoxygenation H9C2 cells.Conclusions Ginsenoside Rb1 could reduce the oxidative stress injury and apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by H/R,and protect H9c2 cardiomyocytes from H/R.

Ginsenoside Rb1;Hypoxia and reoxygenation;Oxidative stress;Apoptosis

國家自然科學基金(81400178)；江蘇省自然科學基金青年基金(BK20160231)

錢文浩(1967-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事冠心病臨床及基礎(chǔ)研究。

左長鵬(1990-)，男，碩士，主要從事冠心病與心肌缺血再灌注基礎(chǔ)研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)10-2341-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.001

1 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科