XIAP和Smac在染錳大鼠生精細(xì)胞Caspase-9和Apaf-1表達(dá)中的作用

郭 海，宋 爽，陳 偉，才秀蓮

(1.河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南 鄭州 451191；2.遵義醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

XIAP和Smac在染錳大鼠生精細(xì)胞Caspase-9和Apaf-1表達(dá)中的作用

郭 海1，宋 爽1，陳 偉2，才秀蓮2

(1.河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南 鄭州 451191；2.遵義醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 研究氯化錳導(dǎo)致的大鼠生精細(xì)胞caspase-9及Apaf-1表達(dá)中XIAP和Smac的調(diào)節(jié)機(jī)制，探討錳導(dǎo)致的雄性不育機(jī)制。 方法 雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量(15 mg/kg MnCl2)和高劑量(30 mg/kg MnCl2)組，腹腔注射MnCl24周和6周，免疫組織化學(xué)檢測(cè)生精細(xì)胞caspase-9、Apaf-1、XIAP和Smac表達(dá)。結(jié)果 ①各組生精細(xì)胞caspase-9、Apaf-1和Smac表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，XIAP表達(dá)降低(P<0.01)。②同時(shí)間的高劑量組與低劑量組比較，同劑量的6周組與4周組比較，生精細(xì)胞caspase-9、Apaf-1和Smac表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，XIAP表達(dá)降低(P<0.01)。③各組caspase-9與Apaf-1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.862，P<0.05)，XIAP與Smac表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.887，P<0.01)。 結(jié)論 錳可促進(jìn)生精細(xì)胞caspase-9、Apaf-1和Smac表達(dá)，抑制XIAP表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生雄性生殖毒性效應(yīng)。

錳；生精細(xì)胞；caspase-9；Apaf-1；XIAP；Smac

細(xì)胞凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族的激活，caspase-9是該家族中在凋亡起始階段最先激活的成員，通過(guò)與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)形成caspase-9-Apaf-1復(fù)合物而促進(jìn)自身前體活化[1]。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)可直接抑制caspase家族各成員的活性， X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是IAP家族中最強(qiáng)大的凋亡抑制因子[2]，它可直接抑制caspase家族多個(gè)成員活性[3]，但其本身卻受線粒體第二激活因子(second mitochondria-derived activator of caspases，Smac)的抑制[4]。隨著汽車(chē)的普及，作為汽油抗爆劑成分之一的錳在環(huán)境中的含量也隨之上升。其作為一種生殖毒性金屬，可以直接誘發(fā)caspase家族的激活，最終導(dǎo)致生精細(xì)胞的凋亡[5]，抑制雄性生殖作用。但在caspase家族所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，最先發(fā)生的是caspase-9和Apaf-1的結(jié)合，同時(shí)該家族的其他成員活性又受XIAP和Smac的調(diào)節(jié)，共同維持生精細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)檢測(cè)錳中毒大鼠睪丸caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac的表達(dá)情況，探尋錳的雄性生殖毒性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只健康雄性SD大鼠，35日齡，體重110～130 g，由四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(川)2003-0001。設(shè)定對(duì)照組、低劑量(15 mg/kg)組和高劑量 (30 mg/kg)組，每組內(nèi)再分為4周和6周組，共6組，每組10只。均為腹腔注射給藥，對(duì)照組以生理鹽水代替，每周5 d，每天1次，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)溫度(20±1) ℃，濕度30%～50%，光照12 h/d。

1.2 主要試劑及儀器 分析純MnCl2·4H2O購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司；caspase-9和Apaf-1兔抗鼠單克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物工程公司；XIAP和Smac小鼠抗大鼠單克隆抗體購(gòu)于德國(guó)Roche公司；SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物工程公司；DMLB2HC型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó)LEICA公司。

1.3 標(biāo)本采集 分別于第4周末和第6周末處死各自時(shí)間段的對(duì)照組、低劑量組和高劑量組，分離雙側(cè)睪丸，縱切后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，片厚4 μm進(jìn)行冠狀位切片，免疫組織化學(xué)檢測(cè)生精細(xì)胞caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac表達(dá)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知的caspase-9和Apaf-1表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌切片及XIAP和Smac表達(dá)陽(yáng)性的胃癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 Caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac陽(yáng)性產(chǎn)物均呈棕黃色，位于生精細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，各組大鼠均可見(jiàn)，主要位于精母細(xì)胞。每例切片在冠狀位從左至右連續(xù)觀察10個(gè)生精小管，分別計(jì)數(shù)caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac表達(dá)陽(yáng)性的生精細(xì)胞數(shù)占總生精細(xì)胞數(shù)的百分率，即為各自的陽(yáng)性細(xì)胞率。

2 結(jié)果

2.1 錳對(duì)大鼠生精細(xì)胞caspase-9和Apaf-1表達(dá)的影響 Caspase-9和Apaf-1陽(yáng)性產(chǎn)物均呈棕黃色，主要位于精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，其余各級(jí)生精細(xì)胞可見(jiàn)少量表達(dá)。與對(duì)照組比較，低劑量、高劑量組caspase-9和Apaf-1表達(dá)均升高(P<0.01)。同時(shí)間的高劑量組與低劑量組比較，以及同劑量的6周組與4周組比較，caspase-9和Apaf-1表達(dá)均升高(P<0.01，見(jiàn)表1和圖1)。

組別caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞率4周6周Apaf-1陽(yáng)性細(xì)胞率4周6周空白對(duì)照5.26±1.574.38±2.713.94±1.622.84±0.5715mg/kgMnCl235.84±5.13a52.92±4.42ab43.25±5.37a61.27±4.68ab30mg/kgMnCl254.41±6.32ac62.34±5.65abc62.81±7.34ac77.56±5.73abc

a: 與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比; b: 與同劑量4周組相比; c: 與同時(shí)間點(diǎn)低劑量組相比；P<0.01。

A：caspase-9，對(duì)照組；B：caspase-9，4周低劑量組；C：caspase-9，6周低劑量組；D：Apaf-1，對(duì)照組；E：Apaf-1，6周低劑量組；F：Apaf-1，6周高劑量組。↗表示陽(yáng)性細(xì)胞。 圖1 各組大鼠生精細(xì)胞caspase-9和Afaf-1表達(dá)(SABC，×400)

2.2 錳對(duì)大鼠生精細(xì)胞XIAP和Smac表達(dá)的影響 XIAP和Smac免疫陽(yáng)性產(chǎn)物均呈棕黃色或棕褐色，主要表達(dá)于精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，其余各級(jí)生精細(xì)胞可見(jiàn)少量表達(dá)，各組大鼠均可見(jiàn)。與對(duì)照組比較，除4周低劑量組XIAP和Smac表達(dá)沒(méi)有明顯差異外，各組XIAP表達(dá)顯著降低，Smac表達(dá)顯著升高(P<0.01)。同時(shí)間的高劑量組與低劑量組比較，以及同劑量的6周組與4周組比較，XIAP表達(dá)顯著降低，Smac表達(dá)顯著升高(P<0.01，見(jiàn)表2和圖2)。

分組XIAP陽(yáng)性細(xì)胞率4周6周Smac陽(yáng)性細(xì)胞率4周6周空白對(duì)照45.52±5.3647.83±3.678.26±1.547.98±1.3315mg/kgMnCl243.41±4.2332.77±3.94ab35.16±5.21a56.31±6.62ab30mg/kgMnCl224.78±3.25ac19.13±4.38abc64.14±6.17ac76.53±5.47abc

a: 與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比；b: 與同劑量4周組相比；c: 與同時(shí)間點(diǎn)低劑量組相比，P<0.01。

A：XIAP，對(duì)照組；B：XIAP；6周低劑量組；C：XIAP, 6周高劑量組；D：Smac, 對(duì)照組；E：Smac, 6周低劑量組；F：Smac, 6周高劑量組。↗表示陽(yáng)性細(xì)胞。圖2 各組大鼠生精細(xì)胞XIAP和Smac表達(dá)(SABC，×400)

2.3 染錳大鼠生精細(xì)胞caspase-9、Apaf-1、XIAP及Smac表達(dá)間相關(guān)關(guān)系 各組大鼠生精細(xì)胞caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞率與Apaf-1陽(yáng)性細(xì)胞率呈正相關(guān)(r=0.862，P<0.05)，XIAP陽(yáng)性細(xì)胞率與Smac陽(yáng)性細(xì)胞率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.887，P<0.01)。

3 討論

錳是體內(nèi)多種酶的活性中心[6]，但過(guò)量的錳蓄積于體內(nèi)可以穿過(guò)血睪屏障，破壞生精微環(huán)境，導(dǎo)致生精細(xì)胞特別是精母細(xì)胞凋亡[5]，其直接后果為精子數(shù)量下降和雄性不育。

細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑最終都將導(dǎo)致caspase家族成員的激活，其中caspase-2,-8,-9,10是凋亡途徑的啟動(dòng)酶，caspase-3,-6,-7是凋亡途徑的效應(yīng)酶[7]。通常情況下caspase-9以前體酶原pro-caspase-9的形式存在，在線粒體釋放的細(xì)胞色素C的作用下，一方面使pro-caspase-9發(fā)生水解而自身激活，另一方面促使同樣在線粒體內(nèi)部的Apaf-1釋放，共同組成Cyto-c-Apaf-1-caspase-9凋亡復(fù)合體[8]。該復(fù)合體再激活caspase-3，最終導(dǎo)致不可逆的凋亡發(fā)生。在此過(guò)程中，Apaf-1起到承上啟下的關(guān)鍵作用，是整個(gè)凋亡復(fù)合體的核心[9]。染錳后Apaf-1主要表達(dá)于精母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，與caspase-9表達(dá)區(qū)域一致，且二者之間存在正相關(guān)。說(shuō)明生精細(xì)胞凋亡過(guò)程中，首先被激活的是Apaf-1，其釋放后與同時(shí)表達(dá)增加的caspase-9形成凋亡復(fù)合體，最終使細(xì)胞質(zhì)中caspase-3表達(dá)上調(diào)，并發(fā)生由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡。

X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中最強(qiáng)大最有效的caspase家族抑制劑，也是唯一能夠同時(shí)抑制凋亡起始階段caspase-9和凋亡執(zhí)行階段caspase-3的凋亡抑制蛋白[10]。XIAP由3個(gè)桿狀病毒caspase抑制因子重復(fù)區(qū)(baculovirus IAP repeats domain，BIR)的結(jié)構(gòu)域組成，分別是BIR1，BIR2和BIR3，BIR1和BIR2主要抑制caspase-3和caspase-7的活性，而B(niǎo)IR3主要通過(guò)在氨基酸組成序列上與Apaf-1高度同源的RING結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性抑制Apaf-1-caspase-9凋亡復(fù)合體的形成，使Apaf-1維持單體形態(tài)而喪失催化活性，進(jìn)而抑制caspase-9的激活[11]。因此，XIAP不僅在上游途徑通過(guò)對(duì)pro-caspase-9的抑制阻止凋亡發(fā)生，而且還通過(guò)對(duì)caspase-3和caspase-7的直接抑制作用，在下游途徑阻止后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)顯示，隨著染錳時(shí)間延長(zhǎng)和劑量增加，XIAP的活性逐漸被抑制，導(dǎo)致原本受其控制的Apaf-1和caspase-9表達(dá)增加，最終導(dǎo)致生精細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Caspase家族的線粒體第二激活因子(Smac)也位于動(dòng)物細(xì)胞線粒體內(nèi)，在人體各個(gè)器官中以睪丸表達(dá)最高，卵巢次之[12]。單體的Smac并無(wú)促凋亡作用，當(dāng)其自身剪切活化形成二聚體后，通過(guò)N端的丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸-異亮氨酸(AVPI)序列可以與包括XIAP在內(nèi)的多種凋亡抑制蛋白結(jié)合，使caspase-3,-7,-9從XIAP釋放，解除XIAP對(duì)它們的抑制作用，促進(jìn)凋亡發(fā)生[13]。還可以誘導(dǎo)pro-caspase-3的活性上升，使其更容易被caspase-9識(shí)別并激活，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。最后，Smac還可以通過(guò)反向激活Bax，再次使細(xì)胞核釋放細(xì)胞色素C，形成凋亡內(nèi)源性途徑的自身循環(huán)，加速凋亡進(jìn)程[15]。染錳后，作為caspase家族底物的Apaf-1隨同細(xì)胞色素C一同自線粒體釋放，二者共同激活caspase-9，進(jìn)而激活家族核心成員caspase-3，直接導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡。同時(shí)，具有抑制凋亡作用的XIAP表達(dá)下降，同時(shí)促進(jìn)caspase-3,-7,-9釋放，誘發(fā)凋亡的Smac表達(dá)增加，說(shuō)明錳一方面通過(guò)誘發(fā)凋亡內(nèi)源性的線粒體途徑激活，同時(shí)破壞凋亡抑制蛋白，促進(jìn)caspase家族成員與其分離，最終導(dǎo)致生精細(xì)胞的破壞和雄性生殖功能的抑制。

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[收稿2016-12-31;修回2017-02-28]

(編輯：王靜)

Effects of XIAP and Smac on the expressions of Caspase-9 and Apaf-1 in spermatogenic cells of rats exposed to manganese

GuoHai1,SongShuang1,ChenWei2,CaiXiulian2

(1.Department of Histology and Embryology, Henan Medical College, Zhengzhou Henan 451191, China; 2.Department of Histology and Embryology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To determine the regulatory effects of XIAP and Smac on the expressions of caspase-9 and Apaf-1 in spermatogenic cells of rats exposed to manganese and further explore the mechanisms through which male sterility caused by manganese. Methods Male Sprague Dawley rats were divided into control and MnC12(15 and 30 mg/kg) groups. After exposed to manganese for 4 or 6 weeks, the expressions of caspase-9, Apaf-1, XIAP and Smac were detected by immunohistochemistry (SABC) assay. Results 1) The caspase-9-positive-cell rate, the Apaf-1-positive-cell rate and the Smac-positive-cell rate were increased (P<0.01) while the XIAP-positive-cell rate was decreased (P<0.01). 2) Among the same dose and same time manganese groups, caspase-9-positive-cell rate, the Apaf-1-positive-cell rate and the Smac-positive-cell rate were increased (P<0.01) while the XIAP-positive-cell rate was decreased (P<0.01). 3)There was a positive correlation between caspase-9-positive-cell rate and Apaf-1-positive-cell rate (r=0.862,P<0.05), and a negative correlation between XIAP-positive-cell rate and Smac-positive-cell rate (r=-0.887,P<0.01). Conclusion Manganese could promote the expressions of caspase-9,Apaf-1 and Smac and inhibit the expression of XIAP, which might lead to male reproductive toxicity.

manganese; spermatogenic cells; caspase-9; Apaf-1; XIAP; Smac

遵義市科技局社會(huì)發(fā)展資助項(xiàng)目(NO: 遵市科合社字[2007]07); 遵義市紅花崗區(qū)科技局社會(huì)發(fā)展資助項(xiàng)目(NO: 遵紅科合[2006]22)。

才秀蓮，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生殖毒理學(xué)，E-mail:lianxiucai@163.com。

R114

A

1000-2715(2017)02-0156-05