慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)NTCP的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系構(gòu)建

勾 英，劉正蕓，肖冬焱，周艷萌，羅 果，高興紅，王 歡,3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099；3.貴州省普通高等學(xué)校 傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)NTCP的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系構(gòu)建

勾 英1,2，劉正蕓2,3，肖冬焱1,2，周艷萌1，羅 果2,3，高興紅2,3，王 歡1,2,3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099；3.貴州省普通高等學(xué)校 傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的 建立鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTCP)過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞系，以作為研究乙肝病毒(HBV)感染的細(xì)胞模型。方法 構(gòu)建NTCP慢病毒重組質(zhì)粒 Gv-NTCP，挑取克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定；將陽(yáng)性重組質(zhì)粒與慢病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝Gv-NTCP慢病毒并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定；Gv-NTCP慢病毒感染人肝癌細(xì)胞株SK-Hep1，嘌呤霉素篩選，通過(guò)熒光顯微鏡，PCR和Western blot檢測(cè)NTCP的表達(dá)。結(jié)果 測(cè)序結(jié)果證實(shí)Gv-NTCP慢病毒載體構(gòu)建成功；在HEK293T細(xì)胞中包裝的Gv-NTCP慢病毒滴度為2.0×108TU / mL；該病毒感染SK-Hep1細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)感染細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，PCR結(jié)果顯示感染組的NTCP表達(dá)明顯增高，WB結(jié)果顯示感染組的NTCP蛋白表達(dá)明顯增高。結(jié)論 成功建立了NTCP過(guò)表達(dá)的人肝癌細(xì)胞系NTCP-SK-Hep1。

鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白；肝癌細(xì)胞；慢病毒載體

鈉離子-?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(Na+/taurocholate cotransportingpolypeptide,NTCP)是多次跨膜糖蛋白，主要在肝細(xì)胞的基底膜上表達(dá)。它是溶質(zhì)載體蛋白(solute carrier family 10， SLC10)家族中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，主要介導(dǎo)鈉依賴(lài)性膽汁酸從血液中的攝取，參與類(lèi)固醇硫酸鹽的攝取[1]，在膽汁酸的腸肝循環(huán)中發(fā)揮重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NTCP是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)及丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV )的功能性受體[2]，且NTCP和HBV的L蛋白之間的相互作用是其進(jìn)入肝細(xì)胞的關(guān)鍵[3]。

筆者在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞SK-Hep1是一種低表達(dá)NTCP細(xì)胞，本研究通過(guò)建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NTCP基因的人肝癌SK-Hep1細(xì)胞，以期為進(jìn)一步研究HBV提供新的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒 人胚腎細(xì)胞 HEK293T細(xì)胞及人肝癌細(xì)胞SK-Hep1細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自吉?jiǎng)P公司；GV358載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，質(zhì)粒pHelper 1.0及pHelper 2.0均來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司，含有病毒包裝所需的元件；GV358載體含有HIV的基本元件5’LTR和5’LTR以及WRE等輔助元件，同時(shí)含有綠色熒光蛋白(GFP)基因。

1.2 主要試劑 引物(GeneRay)；內(nèi)切酶AgeI、EcoRⅠ(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶(大連寶生物公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(Promega公司)；質(zhì)粒純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Gibco血清、α-MEM培養(yǎng)基、EDTA-胰酶消化液(GIBCO公司)；嘌呤霉素(Sigma公司)；兔抗人NTCP抗體(Santa Cruz公司)；兔抗人β-actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；IRDye800 Cw標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗(odyssesy公司)。

1.3 方法

1.3.1 Gv- NTCP慢病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-Hep1細(xì)胞，提取總RNA，根據(jù)GenBank 中NTCP的 編 碼 序 列(NM003049)設(shè)計(jì)引物：上游：5’-GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG GAG GCC CAC AAC GCG TCT GC- 3’，下游：5’-TCC TTG TAG TCC ATA CCG GCT GTG CAA GGG GAG CAG TCC TC- 3’。經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得目的基因NTCP，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的片段并進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物和經(jīng)BamHI和AgeI酶切的GV358慢病毒載體進(jìn)行交換，交換反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，在冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，冰浴2 min。加入500 μL LB培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。取適量菌液均勻涂布在含有1%氨芐青霉素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h；挑取單克隆，做菌液PCR進(jìn)行初步鑒定。初步鑒定正確后進(jìn)行搖菌，取適量菌液送上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將其命名為Gv-NTCP。

1.3.2 HEK293T、SK-Hep1細(xì)胞培養(yǎng) 分別采用含10%胎牛血清的DMEM及α-MEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.3 Gv-NTCP慢病毒包裝 轉(zhuǎn)染前24 h，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293T細(xì)胞以5 ×106/ 15 mL接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。按照Lipo 2000操作說(shuō)明，取Gv-NTCP 20 μg，包裝質(zhì)粒(pHelper1.0 15 μg，pHelper 2.0 10 μg)與1.5 mL的Opti-MEM混合均勻，同時(shí)將脂質(zhì)體60 μg與Opti-MEM混合均勻，將兩者混合均勻，室溫靜置15 min，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基15 mL，繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，4 ℃，4 000 rpm離心10 min，除去細(xì)胞碎片；以0.22 μm濾器過(guò)濾，分裝后置-80 ℃冰箱中保存。

1.3.4 Gv-NTCP病毒滴度測(cè)定 測(cè)定前1 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK293T細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入培養(yǎng)基100 μL。24 h后吸去90 μL培養(yǎng)基，分別加入以10倍梯度稀釋好的Gv-NTCP病毒液90 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μL，72 h后，加入嘌呤霉素(5 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡下觀察感染后的活細(xì)胞數(shù)量，以此計(jì)算病毒滴度。病毒滴度=每孔活細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.3.5 過(guò)表達(dá)NTCP基因的SK-Hep1細(xì)胞系篩選 將SK-Hep1細(xì)胞按2×103/孔接種于96孔板中。待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%～40%時(shí)，分別加入GV-NTCP病毒液、陰性對(duì)照病毒液進(jìn)行感染。用a-MEM 培養(yǎng)基清洗孔板2遍， 然后添加病毒稀釋液10 μL (MOI=16，含9.5 μL Ehanced Infection Solution和0.5 μL Gv-NTCP慢病毒)和含50 μg/mL polybrene的無(wú)血清培養(yǎng)基90 μL，充分混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8～16 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換為新鮮培養(yǎng)基，感染后96 h加入嘌呤霉素(2 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Gv-NTCP病毒組和陰性對(duì)照病毒組有細(xì)胞漂浮，消化細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)篩選1次，培養(yǎng)5代后，無(wú)細(xì)胞死亡，命名為NTCP-SK-Hep1和NC-SK-Hep1，收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3.6 Real-time PCR檢測(cè)NTCP-SK-Hep1中NTCPmRNA 設(shè)計(jì)Real-time PCR檢測(cè)引物(NTCP上游：5’-CTC TCT TCT GCC TCA ATG GAC-3’，下游5’-CAG TTG TGG CAG CTG TGT AG-3’；β-actin上游：5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA -3’，下游5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC),交由上海生工合成。分別用Trizol按酚氯仿法提取SK-Hep1、NC-SK-Hep1及NTCP-SK-Hep1細(xì)胞的總RNA，通用引物反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 Real-time PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火45 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃延伸5 min。制備2%瓊脂糖凝膠，取以上已測(cè)量各DNA樣品與6× DNA Loading Buffer分別混合，以12 μL均量上樣，電壓90 V，電泳90 min后凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.7 Western blot法檢測(cè)NTCP-SK-Hep1中NTCP蛋白的表達(dá) 收集SK-Hep1、NC-SK-Hep1及NTCP-SK-Hep1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白濃度每孔上樣50 μg蛋白,進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，350 mA轉(zhuǎn)膜2 h、5%脫脂牛奶封閉2 h后，TBST洗膜3次，兔抗人一抗[NTCP(1∶200)，β-actin(1∶200)]4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，室溫下IRDye 800 Cw標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗(1∶10 000)孵育1 h，用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)NTCP和內(nèi)參β-actin的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 Gv-NTCP慢病毒重組載體構(gòu)建 將連接的重組慢病毒質(zhì)粒、GV358載體分別轉(zhuǎn)化DH5α，涂板，37 ℃培養(yǎng)，挑取8個(gè)重組克隆(圖1中的5～12泳道)及1個(gè)陰性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)其重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子在1 200 bp左右出現(xiàn)條帶，其大小符合預(yù)期(見(jiàn)圖1)。將陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與克隆模板序列比對(duì)完全一致(見(jiàn)圖2)，表明 Gv-NTCP慢病毒載體構(gòu)建成功。

1:空白對(duì)照(ddH2O); 2:陰性對(duì)照(GV358載體); 3:陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH);M:Marker;5～12:1～8號(hào)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子。 圖1 Gv-NTCP慢病毒重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 Gv-NTCP陽(yáng)性克隆的測(cè)序比對(duì)結(jié)果

2.2 Gv-NTCP慢病毒包裝及病毒滴度測(cè)定 Gv-NTCP與慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察嘌呤霉素篩選后HEK293T的數(shù)量。結(jié)果提示，Gv-NTCP慢病毒已經(jīng)成功感染HEK293T細(xì)胞，Gv-NTCP載體包裝成功。計(jì)算得出病毒滴度為2.0×108TU/mL。

2.3 過(guò)表達(dá)NTCP的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系的篩選及鑒定

2.3.1 Gv-NTCP慢病毒液感染細(xì)胞 將Gv-NTCP慢病毒液與陰性對(duì)照病毒液分別感染SK-Hep1細(xì)胞，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染Gv-NTCP慢病毒96 h后，在熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達(dá)的SK-Hep1細(xì)胞(見(jiàn)圖3A、3B)；而在轉(zhuǎn)染對(duì)照病毒相同時(shí)間后，僅見(jiàn)部分SK-Hep1細(xì)胞表達(dá)較弱的綠色熒光蛋白(見(jiàn)圖3C、3D )。嘌呤霉素持續(xù)加壓篩選、傳代后在倒置熒光顯微鏡下觀察到各轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均有綠色熒光蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖3E、3F、3G、3H)。此結(jié)果表明，Gv-NTCP慢病毒已經(jīng)成功感染SK-Hep1細(xì)胞，NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系藥物篩選成功。

A:明場(chǎng)(Gv-NTCP病毒感染96 h后); B:熒光(Gv-NTCP病毒感染96 h后); C:明場(chǎng)(對(duì)照病毒液感染96 h后)；D:熒光(對(duì)照病毒液感染96 h后); E:明場(chǎng)(Gv-NTCP病毒感染及嘌呤霉素篩選后14 d);F:熒光(Gv-NTCP病毒感染及嘌呤霉素篩選后14 d); G:明場(chǎng)(對(duì)照病毒液感染及嘌呤霉素篩選后14 d); H:熒光(對(duì)照病毒液感染及嘌呤霉素篩選后14 d)。圖3 Gv-NTCP慢病毒感染的SK-Hep1細(xì)胞(×100)

2.3.2 Real-time PCR和Western blot檢測(cè)NTCP-SK-Hep1中NTCP mRNA和蛋白表達(dá) Real- time PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞相比，NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系中NTCP的mRNA表達(dá)水平顯著升高(見(jiàn)圖4A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果也表明，NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系中 NTCP蛋白的表達(dá)水平也明顯升高(見(jiàn)圖4B，4C)。以上結(jié)果提示過(guò)表達(dá)NTCP的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系構(gòu)建成功。

A:NTCP mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B,C:各組細(xì)胞中NTCP蛋白的相對(duì)表達(dá)量。NTCP-SK-Hep1與SK-Hep1細(xì)胞比較,*P<0.05; NTCP-SK-Hep1與NC-SK-Hep1細(xì)胞比較,#P<0.05。圖4 SK-Hep1細(xì)胞中的NTCP基因及蛋白表達(dá)

3 討論

HBV感染是一種嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生和人體健康的全球性流行性疾病，盡管乙肝防治能力已有很大提高，但其嚴(yán)峻現(xiàn)狀仍不容忽視。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道： 全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年約有65萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。中國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū)：2014年全國(guó)1～29歲人群乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1～4歲、5～14歲和15～29歲人群HBsAg陽(yáng)性率分別為0.32%、0.94%和4.38%[中國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)]。目前，乙肝的抗病毒治療藥物主要有干擾素(Interferon，IFN)和核苷(酸)類(lèi)似物[nucleos(t)ide analogues，NAs][4]。但這些藥物也有其不足之處，如IFN應(yīng)答率低，副作用大，NAs易引起耐藥以及停藥反彈[5-8]；IFN及NAs的HBV表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)陰的療效欠佳[9]。因此，深入研究HBV，進(jìn)一步揭示HBV的確切發(fā)生機(jī)制，探究藥物的有效治療靶點(diǎn)，具有重要的社會(huì)意義和臨床意義。

細(xì)胞模型是體外研究HBV的重要工具。目前用于研究HBV的細(xì)胞模型大致分為兩種：轉(zhuǎn)染細(xì)胞系模型和感染細(xì)胞系模型[10]。HepG2.2.15細(xì)胞系是經(jīng)典的轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，它是將重組載體質(zhì)粒polTHBV-1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選構(gòu)建而成的細(xì)胞系[11]。該細(xì)胞模型雖然已被廣泛用于研究HBV生活周期、感染HBV基因組細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的免疫活性以及抗HBV藥物篩選等方面，但是，它卻并不適于研究 HBV感染肝細(xì)胞的早期分子機(jī)制，即從HBV入侵到cccDNA產(chǎn)生階段[10]。雖然人原代肝細(xì)胞(PHH)、原代樹(shù)鼩肝細(xì)胞(PTH)和HepaRG細(xì)胞系已被用作HBV感染模型，但是這3種模型價(jià)格昂貴，應(yīng)用條件有限，難以保持其對(duì)HBV的易感性[12-13]。因此，尋求細(xì)胞模型構(gòu)建的新方法成了HBV研究的重要組成部分。2012年對(duì)NTCP的突破性發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了HBV細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的發(fā)展。研究證實(shí)：將外源性NTCP導(dǎo)入對(duì)HBV并不易感的HepG2[3,12]、HuH7[3,14]及HepaR G[3]細(xì)胞后均可實(shí)現(xiàn)其對(duì)HBV的有效感染。實(shí)際上，NTCP過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建也在不斷發(fā)展。羅夢(mèng)月[15]運(yùn)用慢病毒的方法構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)hNTCP的LLC-PKl細(xì)胞模型(LLC-PKl/NTCP)，王宇澤[16]使用hNTCP慢病毒感染人肝癌細(xì)胞株HepG2獲得穩(wěn)定表達(dá)hNTCP的HepG2-NTCP細(xì)胞株。Verrier等[17]用轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了Huh7-NTCP細(xì)胞。

SK-Hep1細(xì)胞是1975年確定、報(bào)告的肝癌細(xì)胞[18]。該細(xì)胞來(lái)源于肝腺癌病人腹水，屬于內(nèi)皮細(xì)胞，具有分化程度低[18]，侵襲性及遷移力較強(qiáng)的特點(diǎn)[19]。SK-Hep1細(xì)胞同時(shí)也是最穩(wěn)定的，分裂和分化能力很強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞[19]。 換言之，我們認(rèn)為：SK-Hep1細(xì)胞株的生物學(xué)特性相對(duì)穩(wěn)定，有體外易培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，如用于轉(zhuǎn)染、構(gòu)建細(xì)胞模型，便于擴(kuò)大培養(yǎng)。此前，何玉琦等[20]用SK-Hep1細(xì)胞建立了SK-Hep1Cyb細(xì)胞模型，用以探討線粒體DNA缺失對(duì)肝癌細(xì)胞表型影響；彭曉慧等[21]建立了受強(qiáng)力霉素調(diào)控的，可用于c-myc基因功能研究的細(xì)胞株SK-Hep1 tet-on 10#；趙文淘等[22]建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-26a的肝癌細(xì)胞株。因此在本研究中，我們選用SK-Hep1細(xì)胞用于HBV研究的細(xì)胞模型。

慢病毒載體作為一種外源性轉(zhuǎn)基因載體，是以HIV-1的主要功能元件為基礎(chǔ)構(gòu)建起來(lái)的轉(zhuǎn)基因和基因治療載體[23]。慢病毒載體技術(shù)是廣泛運(yùn)用于穩(wěn)定基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)[24]。它能夠?qū)崿F(xiàn)持續(xù)的基因傳遞、將載體穩(wěn)定的整合到宿主基因組；能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞；載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后并不表達(dá)病毒蛋白[24]。經(jīng)過(guò)20多年的不斷改進(jìn)，慢病毒載體也更為安全、有效。

在本研究中，我們采用了GV358慢病毒載體構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒Gv-NTCP，用HEK293T細(xì)胞包裝獲得Gv-NTCP慢病毒液，再用該病毒液感染SK-Hep1細(xì)胞，進(jìn)一步構(gòu)建NTCP過(guò)表達(dá)的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞。同時(shí)，我們采用GFP為報(bào)告基因，通過(guò)觀察綠色熒光直接評(píng)價(jià)NTCP蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)情況。在慢病毒感染后，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選的14 d，便可獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NTCP的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞。篩選出的穩(wěn)定表達(dá)株在mRNA及蛋白水平均有較高的NTCP表達(dá)，說(shuō)明我們獲得了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NTCP的人肝癌細(xì)胞NTCP-SK-Hep1，這為乙肝的進(jìn)一步研究提供了工具。

本研究通過(guò)構(gòu)建Gv-NTCP慢病毒載體，包裝出Gv-NTCP慢病毒液，用其感染人肝癌細(xì)胞SK-Hep1，篩選出NTCP過(guò)表達(dá)的SK-Hep1細(xì)胞，從mRNA水平及蛋白水平加以驗(yàn)證，最終證明：過(guò)表達(dá)NTCP的人肝癌NTCP-SK-Hep1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系得以成功構(gòu)建。這一結(jié)果將為后續(xù)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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[收稿2016-10-29;修回2016-12-23]

(編輯：王靜)

Establishment of SK-Hep1 cell lines over-expressed NTCP gene by lentiviral system

GouYing1,2,LiuZhengyun2,3,XiaoDongyan1,2,ZhouYanmeng1,LuoGuo2,3,GaoXinghong2,3,WangHuan1,2,3

(1.Department of Microbiology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Research Center for Medicine and Biology,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Key Laboratory of Infectious Diseases & Biosafety,Guizhou Ordinary High School,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To establish the SK-Hep1 cell lines over-expressed NTCP gene by lentiviral vector and further investigate the hepatitis B virus (HBV) cell model.MethodsNTCPgene was amplified by PCR and sub-cloned into the lentiviral vector GV358 and then was assessed by DNA sequencing.The recombinant lentivirus was generated by co-transfection of three plasmids into HEK293T cells.The titer of virus was calculated according to the number of the viable HEK293T cells infected by the recombinant virus.The recombinant lentivirus was used to infect hepatocellular carcinoma cell line SK-Hep1.Puromycin was applied to screen stably-transfected cells.Fluorescence microscope,real-time PCR and western blot assays were carried out to detect the expression of NTCP.Results DNA sequencing verified that NTCP was successfully inserted into GV358 vector,and Gv-NTCP virus was obtained in 293T cells.The titer of recombinant lentivirus was 2.0×108TU/mL.The SK-Hep1 cell line was infected by GV-NTCP virus and the transfected cell line stably expressing NTCP gene was selected.The results of real-time PCR and western blot assays showed thatNTCPgene expression in the stable transfected cell line was more than that in the control group (P<0.05).Conclusion A stable SK-Hep1 cell line withNTCPgene over-expression is successfully constructed.

NTCP; hepatoma cell; lentiviral vector

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360261)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2013]08)。

王歡，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗病毒感染，E-mail:wh@zmc.edu.cn。

R346

A

1000-2715(2017)02-0150-06