乳腺癌中膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1蛋白表達(dá)及其臨床病理意義

王超群 曾悅 王艷 黃必飛 孫鑫鑫 趙永明 王倩 胡桂女 蘇振銘

乳腺癌中膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1蛋白表達(dá)及其臨床病理意義

王超群 曾悅 王艷 黃必飛 孫鑫鑫 趙永明 王倩 胡桂女 蘇振銘

目的 探討膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）蛋白表達(dá)在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床病理意義。方法 收集2011年1月至2014年12月404例女性乳腺組織石蠟標(biāo)本分為5組，其中浸潤(rùn)性乳腺癌組220例、導(dǎo)管原位癌（DCIS）Ⅲ組39例、DCISⅠ～Ⅱ組33例、普通型導(dǎo)管增生（UDH）組64例、正常乳腺組48例。采用免疫組化EnVision法檢測(cè)MT1-MMP蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 （1）浸潤(rùn)性乳腺癌、DCISⅢ、DCISⅠ～Ⅱ、UDH、正常乳腺組中MT1-MMP蛋白陽(yáng)性率分別為67.73%（149/220）、25.64%（10/39）、6.06%（2/33）、4.69%（3/64）、18.75%（9/48）；浸潤(rùn)性乳腺癌組陽(yáng)性率顯著高于DCISⅢ、DCISⅠ～Ⅱ、UDH和正常乳腺組（均P＜0.01）；DCISⅢ組陽(yáng)性率顯著高于DCISⅠ～Ⅱ和UDH組（均P＜0.05）。（2）MT1-MMP蛋白表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及孕激素受體（PR）相關(guān)（均P＜0.05）。logistic回歸模型多因素分析顯示浸潤(rùn)性乳腺癌患者M(jìn)T1-MMP蛋白表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素包括腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=0.213，95%CI=0.084～0.544，P＜0.01）和PR表達(dá)狀態(tài)（OR=1.927，95%CI=1.049～3.542，P＜0.05）。 結(jié)論 MT1-MMP蛋白表達(dá)自UDH和DCISⅠ～Ⅱ、DCISⅢ至浸潤(rùn)性乳腺癌顯著升高，且其MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者多項(xiàng)預(yù)后不良因素相關(guān)，提示其在乳腺癌進(jìn)展的全過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用，有望成為抗乳腺癌治療的一個(gè)潛在生物學(xué)標(biāo)志。

膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1 乳腺癌 免疫組化 導(dǎo)管原位癌 普通型導(dǎo)管增生

乳腺癌是我國(guó)女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，且近年來(lái)發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)[1]。腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此，尋找乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)記物，進(jìn)行靶向干預(yù)，對(duì)預(yù)防腫瘤發(fā)生、提高患者生存質(zhì)量和生存率有著重要意義。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一個(gè)重要成員，其編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為66kDa，在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用[2]。目前，關(guān)于浸潤(rùn)性乳腺癌和導(dǎo)管原位癌（DCIS）中MT1-MMP蛋白表達(dá)差異情況尚存在爭(zhēng)議[3-6]，關(guān)于MT1-MMP蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程中的主要作用少有相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)正常乳腺組織、普通型導(dǎo)管增生（UDH）、DCIS及浸潤(rùn)性乳腺癌組織中MT1-MMP蛋白的表達(dá)，并分析其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2011年1月至2014年12月東陽(yáng)市人民醫(yī)院病理科女性乳腺組織石蠟標(biāo)本404例，分為5組，其中浸潤(rùn)性乳腺癌組220例、DCISⅢ組39例、DCISⅠ～Ⅱ組33例、UDH組64例、正常乳腺組48例。按WHO標(biāo)準(zhǔn)（2012年）進(jìn)行分型和分級(jí)。浸潤(rùn)性乳腺癌患者年齡28～77（52.26±11.48）歲；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)18例，Ⅱ級(jí)145例，Ⅲ級(jí)57例；TNM分期：Ⅰ期76例，Ⅱ期93例，Ⅲ期51例，Ⅳ期0例。參照術(shù)后免疫組化結(jié)果將浸潤(rùn)性乳腺癌分為4個(gè)分子亞型：Luminal A[雌激素受體（ER）+/孕激素受體（PR）+/表皮生長(zhǎng)因子受體（HER）2-，Ki-67＜14%]86例；Luminal B（ER+/PR+/HER2-，Ki-67≥14%或 ER+/PR+/HER2+）54例；HER2過(guò)表達(dá)（ER-/PR-/HER2+）40例和三陰性（ER-/PR-/HER2-）29例。本研究中11例浸潤(rùn)性乳腺癌患者因HER2免疫組化結(jié)果不明確且未行進(jìn)一步熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)，故未進(jìn)行分子分型。DCISⅢ組患者年齡30～69（50.13±9.26）歲；DCISⅠ～Ⅱ組患者年齡35～71（51.89± 10.96）歲；UDH組患者年齡22～65（43.19±12.16）歲；正常乳腺組年齡32～66（48.24±8.56）歲。所有患者術(shù)前均未做化療、免疫及放射治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 所有組織均以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。免疫組化實(shí)驗(yàn)采用En－Vision二步法：檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)，0.3%H2O2室溫孵育15min，以1∶100稀釋比例滴加兔抗人MT1-MMP多克隆抗體（克隆號(hào)：H-72，Santa Cruz公司）室溫孵育70min，之后用EnVision二步法試劑盒（Dako公司）室溫孵育45min，最后用DAB顯色劑（Dako公司）顯色5～8min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封蠟。

1.2.2 免疫組化評(píng)分 MT1-MMP蛋白染色結(jié)果判定采用以下標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度計(jì)分：0（無(wú)染色），1（淡黃色），2（棕黃色），3（棕褐色）；染色范圍計(jì)分：0（無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。兩者相加得分0～7分，以≥3分且切片中≥5%細(xì)胞染色視為陽(yáng)性。染色結(jié)果判讀由2位病理醫(yī)師獨(dú)立完成。2位病理醫(yī)師判讀結(jié)果不一致的病例，由第3位醫(yī)師參與判讀并得出最終結(jié)果。

1.3 浸潤(rùn)性乳腺癌患者臨床病理特征 包括年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、ER、PR、c-erbB-2、分子分型，用于后續(xù)分析這些特征與MT1-MMP蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者臨床病理特征之間的多因素分析采用logistic回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 MT1-MMP蛋白在乳腺組織中的表達(dá)及分布 見(jiàn)圖1。

圖1 MT1-MMP蛋白在不同乳腺組織中的免疫組化染色（EnVision二步法）情況（a：正常乳腺組織，腺上皮陰性表達(dá)，×200；b：UDH，增生上皮陰性表達(dá)，×200；c：DCISⅢ級(jí)，導(dǎo)管內(nèi)異型腫瘤上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，×100；d：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，癌細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)，× 200）

由圖1可見(jiàn)，MT1-MMP蛋白染色主要定位于乳腺腺上皮或腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，少數(shù)病例可見(jiàn)細(xì)胞膜著色。正常乳腺和腫瘤組織中間質(zhì)成分（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）均可見(jiàn)著色。

浸潤(rùn)性乳腺癌組、DCISⅢ組、DCISⅠ～Ⅱ組、UDH組、正常乳腺組中MT1-MMP蛋白陽(yáng)性率分別為67.73%（149/220）、25.64%（10/39）、6.06%（2/33）、4.69%（3/64）、18.75%（9/48）。其中，浸潤(rùn)性乳腺癌組MT1-MMP蛋白陽(yáng)性率高于DCISⅢ組、DCISⅠ～Ⅱ組、UDH組和正常乳腺組（χ2=111.843，均P＜0.01）。DCISⅢ組MT1-MMP高于DCISⅠ～Ⅱ組和UDH組及正常乳腺組，且與前兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.934、7.841，均P＜0.05）。正常乳腺組MT1-MMP蛋白陽(yáng)性率高于UDH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.670，P＜0.05）。

2.2 MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 浸潤(rùn)性乳腺癌組織MT1-MMP蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

由表1可見(jiàn)，MT1-MMP蛋白表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及PR相關(guān)（均P＜0.05）。隨著組織學(xué)分級(jí)增高，MT1-MMP蛋白表達(dá)有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、c-erbB-2、分子分型均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。進(jìn)一步以logistic回歸模型多因素分析MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，顯示浸潤(rùn)性乳腺癌患者M(jìn)T1-MMP蛋白表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素包括腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=0.213，95%CI= 0.084～0.544，P＜0.01）和PR表達(dá)狀態(tài)（OR=1.927，95% CI=1.049～3.542，P＜0.05）。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)性蛋白水解酶，它們是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和代謝的最主要酶類(lèi)[7]。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶的一個(gè)亞家族，其中已發(fā)現(xiàn)MT1-MMP/MMP-14、MT2-MMP/MMP-15、MT3-MMP/MMP-16、MT4-MMP/MMP-17、MT5-MMP/ MMP-24、MT6-MMP/MMP-25 6種成員[8]。其中MT1-MMP是MT-MMPs家族的一個(gè)重要成員，在纖維肉瘤、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞性肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用[2,9]。目前，雖然有部分文獻(xiàn)報(bào)道了乳腺癌中MT1-MMP蛋白的表達(dá)[3-6]，但關(guān)于浸潤(rùn)性乳腺癌和DCIS中MT1-MMP蛋白表達(dá)差異情況尚存在爭(zhēng)議：Lodillinsky等[3]研究顯示，在DCIS向浸潤(rùn)性癌進(jìn)展的過(guò)程中MT1-MMP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，然而另一項(xiàng)研究顯示MT1-MMP蛋白表達(dá)在DCIS中顯著高于DCIS伴微浸潤(rùn)的區(qū)域[4]。另外有研究顯示DCIS和浸潤(rùn)性乳腺癌之間MT1-MMP蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯差異[5-6]。并且我們查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)后發(fā)現(xiàn)，關(guān)于MT1-MMP蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程中哪幾個(gè)階段發(fā)揮主要作用鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，在本研究中，我們選取了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一系列樣本，即選取正常乳腺組織、UDH、DCIS及浸潤(rùn)性乳腺癌等來(lái)闡明MT1-MMP蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床病理意義。

本研究結(jié)果顯示，MT1-MMP蛋白在正常乳腺組織中表達(dá)高于UDH組織。我們認(rèn)為可能是由于UDH中增生上皮較正常乳腺上皮相對(duì)幼稚，其在增生過(guò)程中MT1-MMP基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)（如轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程）受限，從而導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。在病變由UDH和DCISⅠ～Ⅱ、DCISⅢ級(jí)至浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)展的過(guò)程中，MT1-MMP蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，可能是受到一些腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，且MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高的臨床分期、PR陰性等多項(xiàng)預(yù)后不良因素相關(guān)，這些結(jié)果提示MT1-MMP蛋白在乳腺癌進(jìn)展的全過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用。

本研究表明MT1-MMP蛋白在HER2過(guò)表達(dá)型和TNBC中的表達(dá)較Luminal型略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與先前研究結(jié)果一致[10]。另外他們的研究顯示MT1-MMP蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌患者激素狀態(tài)、臨床分期無(wú)關(guān)[10]，與本研究結(jié)果有較大的差別，我們分析可能是由于評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的差異造成的。

關(guān)于MT1-MMP影響腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的下游機(jī)制已有較多研究報(bào)道，目前顯示它除了自身可降解細(xì)胞外基質(zhì)外，還可促進(jìn)腫瘤間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2前體和基質(zhì)金屬蛋白酶9前體，并進(jìn)一步激活這些前體基質(zhì)金屬蛋白酶[11]，從而促進(jìn)基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞遷移。另外MT1-MMP和CD44異源二聚體可激活表皮生長(zhǎng)因子受體并啟動(dòng)下游一系列促腫瘤信號(hào)通路[2]。然而關(guān)于腫瘤中調(diào)控MT1-MMP表達(dá)的上游機(jī)制目前僅見(jiàn)少數(shù)報(bào)道，Akanuma等[12]報(bào)道食管鱗狀細(xì)胞癌中微小RNA-133a可調(diào)控MT1-MMP和細(xì)胞骨架蛋白FSCN1表達(dá)，進(jìn)而影響癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，且MT1-MMP和FSCN1有協(xié)同促癌作用。那么乳腺癌中MT1-MMP是否受到miR-133a的調(diào)控，其和FSCN1之間是否存在相關(guān)性，我們將進(jìn)一步研究。

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Expression of MT1-MMP in breast cancer and its correlation w ith clinicopathology

WANG Chaoqun,ZENG Yue,WANG Yan,et

al.Department of Pathology,Dongyang People's Hospital，Dongyang 322100,China

Objective To investigate the exp ression of MT1-MMP p rotein in breast cancer and to evaluate its c linicopathologic significance. Methods The exp ression of MT1-MMP p rotein was detected by immunohistochem ical EnVision method in 48 samp les ofnormalb reast tissues,64 cases ofusualductalhyperp lasia (UDH),72 cases ofductalcarcinoma in situ (DCIS)and 220 cases of invasive b reast cancer. Results The exp ression rates ofMT1-MMP p rotein in invasive breast cancer, DCISⅢ,DCISⅠ-Ⅱ,UDH and normalbreast tissues were 67.73%(149/220),25.64%(10/39),6.06%(2/33),4.69%(3/64),18.75% (9/48).The MT1-MMP p rotein exp ression in invasive breast cancer was significantly higher than those in DCISⅢ,DCISⅠ-Ⅱ, UDH and normal breast tissues(P＜0.01),and MT1-MMP p rotein exp ression in DCISⅢwas significantly higher than those in DCISⅠ-Ⅱ (P＜0.05)and UDH(P＜0.01).MT1-MMP p rotein exp ression in invasive b reast cancer was increased w ith the increasing c linical stages(P＜0.01),and MT1-MMP p rotein positive rates in patients with axillary lymph node metastasis and negative PR status were significantly higher than those w ith negative axillary lym ph node and positive PR(P＜0.01 and P＜0.05, respectively).Logistic regression analysis showed thataxillary lym ph nodemetastasis(OR=0.213,95%CI=0.084～0.544,P＜0.01) and PR status(OR=1.927,95%CI=1.049～3.542,P＜0.05)were independent fac tors ofMT1-MMP p rotein exp ression in invasive b reastcancer.Conclusion MT1-MMP p rotein exp ression shows significantly increasing trend from UDH,DCISⅠ-Ⅱ,DCISⅢto invasive b reast cancer,and its exp ression is correlated w ith unfavorab le p rognostic factors of invasive b reast cancer,suggesting that MT1-MMP may p lay an im portant role in the p rog ression of breast cancer and m ight be a potential anti-cancer therapy biologicalmarker.

MT1-MMP Breastcancer Immunohistochem istry DCIS UDH

2016-05-16）

（本文編輯：楊麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-698

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012KYB230）

322100 東陽(yáng)市人民醫(yī)院病理科（王超群、曾悅、黃必飛、孫鑫鑫、王倩），腫瘤內(nèi)科（王艷），腫瘤外科（趙永明、胡桂女），生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室（蘇振銘）

王超群，E-mail：chaoqunw869@163.com