CK19對橋本甲狀腺炎伴發(fā)多灶性甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)測價(jià)值

夏清 嚴(yán)沛元 謝小軍 董帥

CK19對橋本甲狀腺炎伴發(fā)多灶性甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)測價(jià)值

夏清 嚴(yán)沛元 謝小軍 董帥

目的 探討細(xì)胞角蛋白（CK19）對橋本甲狀腺炎（HT）伴多灶性甲狀腺乳頭狀癌（PTC）的預(yù)測指標(biāo)。方法 根據(jù)病理檢查結(jié)果選擇HT合并多灶性PTC（A組）、HT合并單發(fā)PTC（B組）、單純HT（C組）各30例，觀察并分析其術(shù)前酶標(biāo)免疫分析法測定的血清CK19水平及免疫組化方法檢測的病理標(biāo)本CK19表達(dá)情況。結(jié)果 A、B兩組和B、C兩組患者血清CK19表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。病理標(biāo)本CK19免疫組化結(jié)果A組呈強(qiáng)陽性，B組呈陽性，C組呈弱陽性，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 結(jié)論 HT伴多灶性PTC患者CK19免疫組化陽性表達(dá)水平，明顯高于HT伴單發(fā)PTC患者，對術(shù)前穿刺或術(shù)中標(biāo)本CK19免疫組化呈強(qiáng)陽性表達(dá)者應(yīng)考慮行甲狀腺全切術(shù)。

細(xì)胞角蛋白19 橋本甲狀腺炎 甲狀腺乳頭狀癌

橋本甲狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）癌變問題是近年來臨床研究的熱點(diǎn)之一，有關(guān)發(fā)病的許多機(jī)制尚未明確，且治療方案也仍存在爭議。有學(xué)者主張對此類患者一律行甲狀腺全切除術(shù)，但有研究表明甲狀腺全切術(shù)后永久性甲狀旁腺功能減低和喉返神經(jīng)損傷的發(fā)生率較高[1]。因此，臨床上一般認(rèn)為HT伴單發(fā)小癌灶可行單側(cè)腺葉切除術(shù)，但目前尚無明確指標(biāo)能預(yù)先判斷HT伴發(fā)的是單發(fā)癌還是多灶癌，如確定為HT伴多灶性甲狀腺乳頭狀癌（PTC），應(yīng)行甲狀腺全切術(shù)。術(shù)前B超檢查有一定的局限性，術(shù)中冷凍切片也只是把比較明顯的結(jié)節(jié)進(jìn)行快速病理檢查，往往會遺漏微小癌灶，因此進(jìn)行HT多灶性癌變預(yù)警信號的研究對指導(dǎo)臨床治療方案具有重要意義。研究證實(shí)，細(xì)胞角蛋白19（CK19）在所有的PTC中都表達(dá)，作為PTC標(biāo)記的靈敏度達(dá)到100%，特異度達(dá)到82.15%[2]。典型PTC中CK19多呈強(qiáng)陽性表達(dá)，濾泡型乳頭狀癌與混合較多濾泡結(jié)構(gòu)的PTC多呈中等或稍強(qiáng)陽性表達(dá)，直徑＜1cm的隱匿性PTC及甲狀腺內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶也呈彌漫性陽性表達(dá)，癌旁組織、腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及乳頭狀增生均呈陰性或小灶性陽性表達(dá)，提示CK19有助于PTC的診斷，可用于隱匿性PTC與良性結(jié)節(jié)的鑒別診斷及判斷甲狀腺組織內(nèi)是否存在微小轉(zhuǎn)移灶。但CK19在HT伴多灶性或單發(fā)PTC中的表達(dá)是否有差異，能否作為前者的預(yù)警信號尚未見報(bào)道，對此筆者進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 根據(jù)術(shù)后病理檢查結(jié)果，選取2013年6月至2015年6月在浙江省人民醫(yī)院及浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)治療的HT伴多發(fā)性PTC（A組）、HT伴單發(fā)（B組）及單純HT（C組）患者各30例。A組男6例，女24例，平均年齡（46.00±7.25）歲，＜45歲11例（占36.67%），≥45歲19例（占63.33%）；B組男8例，女22例，平均年齡（49.00±6.89）歲，＜45歲9例（占30.00%），≥45歲21例（占70.00%）；C組男10例，女20例，平均年齡（50.00±5.77）歲，＜45歲8例（占26.67%），≥45歲22例（占73.33%）。3組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有因具備甲狀腺手術(shù)指征行手術(shù)治療而術(shù)后病理證實(shí)為HT伴PTC或單純HT的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有甲狀腺功能亢進(jìn)、亞急性甲狀腺炎病史、結(jié)核病史或有其他惡性腫瘤病史、免疫功能低下、其他重大疾病史，術(shù)前曾行化療、放療或免疫治療史的患者。所有患者均為體檢彩超檢查發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)因懷疑惡性或因結(jié)節(jié)較大有癥狀而行手術(shù)治療，術(shù)前均采集血液樣本進(jìn)行化驗(yàn)，所有患者均經(jīng)病理診斷證實(shí)。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果將其分為A組（HT合并多灶性PTC）、B組（HT合并單發(fā)PTC）、C組（單純HT），每組30例。

1.2 主要試劑 CK19試劑盒購自美國RB公司；CK19抗體購自美國Santa Cruz Bio公司；DAB顯色試劑盒（20×）購自北京CWbio公司；PBS（pH7.5，10×）購自北京CWbio公司；中性樹膠購自北京CWbio公司；改良型蘇木素購自北京CWbio公司；二甲苯購自北京化學(xué)試劑公司；無水乙醇購自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清CK19水平的測定 所有患者均術(shù)前禁食12h后采血，清晨空腹抽取肘靜脈血3ml。室溫下靜置30min后，2 000r/min離心15min，分離血清，取1.5ml放置在-70℃冰箱保存?zhèn)溆?，所有血清統(tǒng)一編號，各項(xiàng)指標(biāo)均統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定血清CK19水平。先將微孔板用純化的抗體包被，制成固相抗體，然后向包被單抗的微孔中按順序加入CK19抗原、生物素化的抗人CK19抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。在過氧化物酶的催化下，TMB轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，最后在酸的作用下轉(zhuǎn)化為黃色。顏色深淺與血清CK19濃度呈正相關(guān)。在450nm的波長下，用酶標(biāo)儀測定吸光度（OD值），將標(biāo)準(zhǔn)物濃度作為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值作為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),然后在半對數(shù)坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。由血清樣本的OD值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的實(shí)際濃度。

1.3.2 病理標(biāo)本CK19免疫組化法檢測 60℃烤片1h，二甲苯脫蠟2次，每次5min；二甲苯與純乙醇（1∶1）混合2min，再按順序浸入梯度乙醇（純乙醇－純乙醇－95%乙醇－85%乙醇－75%乙醇）及蒸餾水中，每次2min水化；用內(nèi)源性過氧化物酶封閉10min，然后PBS洗凈；用蛋白非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉10min，然后PBS洗凈；用0.1%Triton在冰上孵育 15min，然后 PBS洗凈；用0.125%胰酶在室溫下孵育30min，然后PBS洗凈；用冷0.1mol/L鹽酸孵育30min除去染色體的組蛋白，然后PBS洗凈；用2mol/L鹽酸在室溫下孵育35min，使DNA雙鏈解開，然后PBS洗凈；用0.1mol/L四硼酸鈉在室溫下孵育20min，然后PBS洗凈；用一抗（鼠抗人CK19單克隆抗體）工作液孵育36h，然后PBS洗凈；用二抗（羊抗鼠IgG）工作液孵育RT 30min，然后PBS洗凈；用Streptavidin-HRP工作液孵育RT 30min，然后PBS洗凈。DAB顯色：采用DAB顯色試劑盒（20×），用現(xiàn)配的DAB工作液顯色2～7min，然后在顯微鏡下觀察，控制顯色時(shí)間。蘇木素復(fù)染：采用改良型的蘇木素，復(fù)染1～ 3min，然后PBS沖洗返藍(lán)；用1%鹽酸分化液分化10s，然后PBS沖洗返藍(lán)。用75%－85%－95%－100%－100%各濃度乙醇每種3min逐級脫水，二甲苯與純乙醇（1∶1）混合5min，用二甲苯浸沒2次，每次5min，然后加中性樹脂將蓋玻片封片，晾干。最后用顯微成像系統(tǒng)拍照，對比圖像結(jié)果，染色強(qiáng)度以陽性細(xì)胞＜25%為+，陽性細(xì)胞25%～50%為++，陽性細(xì)胞51%～75%為+++，陽性細(xì)胞＞75%為++++；廣泛深染（+++～++++）為強(qiáng)陽性，中度染色（+～++）為陽性，低度染色（＜+）為弱陽性。用國際通用的IPP（image pro plus）軟件（美國Media Cybernetics）進(jìn)行平均光密度定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組患者血清CK19表達(dá)水平的比較 CK19表達(dá)水平以HT合并多灶性PTC組為高，HT合并單發(fā)PTC組居中，單純HT組低，但3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組患者血清CK19表達(dá)水平的比較（ng/ml）

2.2 3組標(biāo)本CK19免疫組化檢測結(jié)果

2.2.1 3組標(biāo)本鏡下所見 免疫組化檢測結(jié)果顯示A組CK19表達(dá)呈強(qiáng)陽性（+++～++++），B組CK19表達(dá)呈陽性（+～++），C組CK19表達(dá)呈弱陽性（＜+），見圖1。

圖1 3組標(biāo)本CK19免疫組化檢查結(jié)果（SP法×40）

2.2.2 3組標(biāo)本平均光密度定量分析結(jié)果比較 C組密度最低，與A、B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。A組平均光密度明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組標(biāo)本平均光密度定量分析結(jié)果比較

2.3 CK19表達(dá)水平與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 A、B兩組CK19陽性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者中CK19免疫組化強(qiáng)陽性表達(dá)比例明顯高于轉(zhuǎn)移陰性的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在單獨(dú)A或B組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），血清CK19水平差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 CK19表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[例（%）]

3 討論

HT伴發(fā)甲狀腺癌主要是PTC，且往往為多灶性PTC。近年來HT伴發(fā)PTC的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。研究表明，HT伴發(fā)TC的發(fā)生率為12%，絕大多數(shù)為PTC，HT與PTC的發(fā)生關(guān)系密切[3-5]，HT伴有甲狀腺功能減退的甲狀腺結(jié)節(jié)，其惡變的可能性會大大增加。HT伴發(fā)PTC應(yīng)手術(shù)治療，但目前對手術(shù)范圍的意見尚不一致，國外有些學(xué)者認(rèn)為HT是癌前病變，患側(cè)切除后，對側(cè)腺體有2%～9%的概率會出現(xiàn)甲狀腺癌復(fù)發(fā)，所以他們主張行甲狀腺全切術(shù)；但也有學(xué)者提出，甲狀腺全切術(shù)后出現(xiàn)的永久性甲狀旁腺功能減低及喉返神經(jīng)損傷的發(fā)生率較單側(cè)切除術(shù)明顯要高[6]。HT伴單發(fā)的小癌灶可行單側(cè)腺葉切除術(shù)，如確定HT伴發(fā)多灶性PTC則應(yīng)行甲狀腺全切術(shù)，但目前尚無明確指標(biāo)能預(yù)先判斷HT伴發(fā)的是單發(fā)癌灶還是多灶癌。多發(fā)病灶是甲狀腺癌、尤其是PTC的臨床特征之一。多灶性PTC與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)相關(guān)，多發(fā)癌灶可增加淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[7]，本研究也表明多灶癌的淋巴轉(zhuǎn)移陽性率明顯高于單發(fā)癌。但目前對于多灶性PTC的診斷，只有在術(shù)中或術(shù)后經(jīng)病理切片證實(shí)，而術(shù)中冰凍切片只是針對較為明顯的結(jié)節(jié)，往往會遺漏其它微小癌灶。但如果都把雙側(cè)甲狀腺全部切除進(jìn)行病理檢查則會使許多單發(fā)癌患者接受了過度治療，且增加了手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生率。因此，如能結(jié)合術(shù)前或術(shù)中檢查對多灶性PTC進(jìn)行預(yù)判將有助于選擇手術(shù)方式，對指導(dǎo)臨床治療方案具有重要意義。

CK屬于中微絲蛋白家族,是上皮細(xì)胞骨架的組成部分,在正常上皮、上皮源性原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞上表達(dá)。CK19分子量為40kD，其分子量較低，由KRT19基因編碼，主要表達(dá)于正常上皮及各種上皮來源的腫瘤中，尤其是單層上皮和間皮；成人皮膚、肝細(xì)胞及角膜表達(dá)陰性，而子宮上皮、羊膜上皮及間質(zhì)則呈陽性表達(dá)，主要用于腺癌的診斷。近年來，CK19在甲狀腺疾病的研究中被廣泛采用，國內(nèi)外均有許多研究。CK19是目前常用的PTC診斷免疫標(biāo)志物之一，其彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)有助于PTC的診斷，可用于隱匿性PTC與良性結(jié)節(jié)的鑒別診斷及判斷甲狀腺內(nèi)是否存在微小轉(zhuǎn)移灶。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，CK19的高表達(dá)能提高PTC診斷的特異性。HT中淋巴濾泡周圍甲狀腺濾泡上皮有陽性表達(dá)，癌變組織中的陽性率為100%，且強(qiáng)而廣泛。有研究發(fā)現(xiàn)，HT濾泡上皮增生、不典型增生、癌變，CK19的陽性表達(dá)會逐漸增強(qiáng)，CK19在HT中的高表達(dá)，特別是在不典型增生細(xì)胞中的高表達(dá)，提示其有可能發(fā)展為PTC，可作為早期檢測HT向PTC癌變的指標(biāo)之一[9]。Cochand-Priollet等[10]發(fā)現(xiàn)，與形態(tài)學(xué)方法相比，CK19抗體染色能夠減少PTC診斷的假陽性率和假陰性率，從而提高診斷的準(zhǔn)確性，減少不必要的手術(shù)治療。另外在PTC患者當(dāng)中,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CK19表達(dá)水平又高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的。本研究結(jié)果表明，檢測血清CK19水平因各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異故認(rèn)為其對預(yù)測是否為HT伴多灶癌沒有幫助，對預(yù)測是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦無幫助，而CK19免疫組化檢測則有助于預(yù)測是否為HT伴多灶性PTC，而且對預(yù)測PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也具有一定的意義。本研究表明，HT伴多灶性PTC組CK19免疫組化呈強(qiáng)陽性表達(dá)，明顯高于HT伴單發(fā)PTC組，故可作為預(yù)測HT伴多灶性PTC的指標(biāo)，如術(shù)前穿刺或術(shù)中標(biāo)本進(jìn)行CK19免疫組化檢測呈強(qiáng)陽性表達(dá)則提示很有可能為HT伴多灶性PTC，結(jié)合術(shù)中冷凍切片建議行甲狀腺全切；另外頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的CK19強(qiáng)陽性表達(dá)（+++～++++）率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的CK19陽性（+～++）表達(dá)率則明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，提示如CK19強(qiáng)陽性表達(dá)則很有可能中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽性，須行淋巴結(jié)清掃。

總之，HT與PTC的發(fā)生有非常密切的關(guān)系，而是否為多灶癌則直接關(guān)系到手術(shù)方式及預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)HT伴多灶性PTC的組織中CK19呈強(qiáng)陽性表達(dá)，明顯高于HT伴單發(fā)PTC，因此可以利用免疫組化檢測CK19水平來預(yù)測是否為HT多灶性癌變，對于HT伴PTC的臨床診斷治療具有重要的指導(dǎo)作用。

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Predicting value of CK19 in Hashimoto's thyroiditis patients complicated w ith multifocal papillary thyroid carcinoma

XIA Qing,YAN

Peiyuan,XIE Xiaojun,et al.Department of Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the serum level and tissue exp ression of CK19 in Hashimoto's thyroid itis(HT) com p licated w ith multifocal pap illary thyroid carcinoma(PTC). Methods Ninety patients pathologically d iagnosed as HT w ith multifocalPTC(g roup A,n=30),HTw ith unifocalPTC(g roup B,n=30)and HT only(group C,n=30)adm itted in two hospitals from June 2013 to June 2015 were enrolled in the study.The CK19 levels in serum were determ ined by ELISA and the exp ression of CK19 in tissue sections was detected by immunohistochem istry. Results There was no significant d ifference in serum CK19 levels between g roups A and B,between g roups B and C(P＞0.05).The exp ression ofCK19 in tissue specimens ofg roup A was stronger than that in g roup B(0.007536±0.003851 vs 0.005126±0.006244,P＜0.05),and the latterwas stronger than thatof C g roup(0.005126±0.006244 vs 0.003444±0.002063,P＜0.05). Conclusion Tissue exp ression of CK19 in HT patients w ith multifocal PTC is higher than that in HT patients w ith unifocal PTC or in patients w ith HT alone,which suggests that strong ly positive exp ression ofCK19 in biopsy specimensmay ind icate HTw ithmultifocalPTC.

CK19 Hashimoto's thyroid itis Papillary thyroid carcinoma

2016-12-17）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-2108

浙江省衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目（2014KYA059）

310014杭州，浙江省人民醫(yī)院干部科（夏清、嚴(yán)沛元）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院甲狀腺疾病診治中心（謝小軍、董帥）

董帥，E-mail：donshai@163.com